Nghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị chẩn đoán, tiên lượng của một số microRNA ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG VIỆN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Y DƯỢC LÂM SÀNG 108 TRẦN THỊ LIÊN NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN VÀ GIÁ TRỊ CHẨN ĐOÁN, TIÊN LƯỢNG CỦA MỘT SỐ MICRORNA Ở BỆNH NHÂN NHIỄM KHUẨN HUYẾT Ngành: Truyền nhiễm bệnh nhiệt đới Mã số: 62720153 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Hà Nội – 2021 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI: VIỆN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Y DƯỢC LÂM SÀNG 108 Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Viết Sáng TS Ngô Tất Trung Phản biện: Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: Viện Nghiên cứu Khoa học Y Dược Lâm sàng 108 Vào hồi ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Viện NCKH Y Dược lâm sàng 108 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm khuẩn huyết (NKH) định nghĩa tình trạng rối loạn chức quan đe dọa tính mạng kiểm sốt đáp ứng hệ thống miễn dịch thể nguyên nhiễm trùng.NKH thách thức hệ thống chăm sóc sức khỏe với tỷ lệ mắc tỷ lệ tử vong cao Nhận biết chẩn đoán sớm NKH giúp nhà lâm sàng đưa liệu pháp điều trị phù hợp kịp thời, nhằm cải thiện biến chứng giảm tỷ lệ sốc nhiễm khuẩn, suy đa tạng, đồng thời giảm tỷ lệ tử vong Các nghiên cứu cho thấy nhiều dấu ấn sinh học (biomarkers) sử dụng chẩn đoán sớm tiên lượng NKH có độ đặc hiệu chưa cao cần tìm kiếm dấu ấn nhằm giúp nhà lâm sàng có thêm cơng cụ phát sớm tiên lượng bệnh nhân NKH MicroRNA (miRNA) phân tử RNA chuỗi đơn ngắn (khoảng 22 nucleotide), nội sinh khơng tham gia vào q trình tổng hợp protein, nhiên chúng có vai trị điều hịa gien giai đoạn sau phiên mã Ở bệnh nhân NKH, miRNA cho thấy có mặt giai đoạn chế bệnh sinh như: đáp ứng viêm sớm, đáp ứng chống viêm, phản ứng viêm mức, ức chế miễn dịch, chết tế bào theo chương trình cuối dẫn đến rối loạn chức đa quan Các nghiên cứu cho thấy thay đổi mức độ biểu miRNA huyết tương bệnh nhân NKH, số miRNA miRNA-146-3p, miRNA-147b, miRNA-223, miRNA-155 cho thấy dấu ấn có tiêm chẩn đốn tiên lượng NKH Ở Việt Nam, số nghiên cứu cho thấy vai trò dấu ấn sinh học IL-2, IL-6, IL-10, TNF-α, PCT CRP chẩn đoán tiên lượng bệnh nhân NKH Đồng thời có nghiên cứu tìm hiểu vai trị số miRNA bệnh lý gan mật, ung thư Tuy nhiên, thiếu liệu vai trò miRNA bệnh nhân NKH Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài với hai mục tiêu sau: Khảo sát mức độ biểu miRNA-146-3p, miRNA147b, miRNA-155 miRNA-223 bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết so với nhóm chứng Xác định vai trị miRNA-146-3p, miRNA-147b, miRNA155 miRNA-223 chẩn đoán tiên lượng bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết * Những đóng góp luận án Luận án cung cấp thêm kết nghiên cứu dấu ấn sinh học sử dụng chẩn đốn tiên lượng nhiễm khuẩn huyết Kết nghiên cứu cho thấy miRNA: miRNA-146-3p, miRNA-147b, miRNA-155, miRNA-223 có giá trị chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết sốc nhiễm khuẩn, nhiên có giá trị tiên lượng tử vong BNnhiễm khuẩn huyết miRNA dấu ấn sinh học nghiên cứu nhiều bệnh lý, có nhiễm khuẩn huyết lần nghiên cứu Việt Nam với vai trò dấu ấn sinh học nhiễm khuẩn huyết • Kết cấu luận án gồm 108 trang Luận án gồm 108 trang Đặt vấn đề 02 trang; Chương 1.Tổng quan tài liệu 29 trang; Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu:20 trang; Chương Kết nghiên cứu: 25 trang; Chương 4.Bàn luận: 30 trang; Kết luận 02 trang; Khuyến nghị 01 trang Luận án có 32 bảng, 14 biểu đồ, 02 sơ đồ, 06 hình vẽ; 183 tài liệu tham khảo gồm 05 tài liệu tiếng Việt 178 tài liệu tiếng Anh Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nhiễm khuẩn huyết 1.1.1 Định nghĩa nhiễm khuẩn huyết Nhiễm khuẩn huyết định nghĩa rối loạn chức quan nghiêm trọng đe dọa tính mạng đáp ứng khơng kiểm sốt vật chủ với nhiễm trùng (Sepsis-3)) 1.1.2 Căn nguyên, ổ nhiễm khuẩn tiên phát yếu tố nguy 1.1.3.Cơ chế bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết 1.1.4 Vai trò dấu ấn sinh học nhiễm khuẩn huyết 1.2 miRNA vai trò số miRNA nhiễm khuẩn huyết 1.2.1 Nguồn gốc sinh học miRNA MiRNA phát lần vào năm 1993 giun tròn Caenorhabditis elegans MiRNA đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 –24 nucleotit, không tham gia vào trình tổng hợp protein, gần 70% miRNA liên quan đến kiểm sốt q trình phiên mã tạo RNA thơng tin, 30% miRNA cịn lại chưa làm rõ chức 1.2.2 Cơ chế hoạt động miRNA người MiRNA đóng vai trị quan trọng mạng lưới quy định kiểm soát trình sinh học phức tạp liên quan đến tế bào, thơng qua kiểm sốt đáp ứng miễn dịch bẩm sinh thích nghi 1.2.3 Đặc tính sinh học miRNA 1.2.4 Các kỹ thuật định lượng miRNA 1.2.5 Vai trị miRNA chẩn đốn tiên lượng bệnh người 1.2.6 Vai trò miRNA bệnh nhân khuẩn huyết Các nghiên cứu giới gần bắt đầu nghiên cứu vai trò giá trị miRNA BN NKH Hầu hết nghiên cứu khẳng định mức độ biểu số miRNA thay đổi nhóm BN NKH so với nhóm chứng thay đổi theo mức độ nặng NKH, từ đề xuất sử dụng miRNA với vai trò dấu ấn sinh học chẩn đoán tiên lượng NKH, vậy, kết chưa thống với Một số nghiên cứu rối loạn miRNA tương ứng với triệu chứng lâm sàng nhiễm trùng nặng NKH Kingsley SMK nhận thấy miRNA tham gia vào hai đáp ứng thể đáp ứng miễn dịch bẩm sinh đáp ứng miễn dịch mắc phải, tham gia vào hầu hết giai đoạn chế bệnh sinh NKH MiRNA-146a ngăn cản kích hoạt nội mơi cách ức chế dịch mã protein thúc đẩy hoạt động nội mơ thơng qua hoạt hóa đường tín hiệu NF-κB Nghiên cứu Ryan M.O’Cornell khẳng định miRNA-155 gây đáp ứng viêm thông qua đại thực bào Tác giả Gangliu cộng chứng minh vai trò miRNA147 làm giảm đáp ứng viêm đại thực bào thông qua TLR.Tác giả Konstantin D.Tagonov David Baltimore chứng minh miRNA146 có vai trị ức chế protein cảm ứng NF-қB đáp ứng miễn dịch bẩm sinh, ức chế biểu cytokin viêm MiRNA-223 có vai trị quan trọng điều hịa phản ứng miễn dịch thơng qua điều chỉnh tồn thay đổi gien có vai trị tốt việc điều hịa phản ứng miễn dịch Theo đó, chuột đột biến tăng miRNA223 hiển thị phản ứng miễn dịch tăng lên tác nhân gây bệnh Candida albicans cho thấy hủy hoại mô tăng cao đáp ứng với LPS MiRNA đóng vai trị dấu ấn sinh học khả dụng giúp phân biệt giai đoạn khác NKH Kết phân tích số miRNA: miRNA-146a, miRNA155, miRNA-182 miRNA-584 tìm thấy tế bào đơn nhân máu ngoại vi bệnh nhân NKH Wang cộng sử dụng giải trình tự Solexa nhận diện sáu miRNA để tiên lượng bệnh nhân NKH có miRNA-146a, miRNA-223.Wang đồng nghiệp thấy mức độ biểu miRNA-223 huyết tương bệnh nhân NKH giảm thấp so với bệnh nhân có SIRS người khỏe mạnh Gang liu nghiên cứu thấy miRNA-147b tạo đại thực bào hoạt hóa nhiều TLR đóng vai trị kiểm sốt phản hồi âm tính tín hiệu liên quan đến thụ thể dạng chng(TLRs) thụ thể cho phép tế bào viêm nhận biết mầm bệnh vi khuẩn xâm nhập Wang et al nhận diện sáu miRNA để tiên lượng bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết có miRNA-146a, miRNA-223 Huang cho thấy miRNA: miRNA-146a, miRNA-223 dấu sinh học chẩn đốn nhiễm khuẩn huyết MiRNA-223 tăng lên tương quan với tăng lên nồng độ TNFα mức độ nghiêm trọng bệnh Sử dụng miRNA làm dấu ấn sinh học lưu hành cho nhiễm khuẩn huyết giai đoạn sơ khai Tuy nhiên, thời điểm này, số miRNA xác nhận bước đầu sử dụng dấu ấn sinh học chẩn đoán tiên lượng nhiễm khuẩn huyết, cần thêm nghiên cứu để xác định thêm vai trò dấu sinh học miRNA bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Nhóm bệnh: 125 bệnh nhân chẩn đốn nhiễm khuẩn huyết theo tiêu chuẩn Sepsis-3 Nhóm chứng: 71 người khỏe mạnh 69 bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue (SXH Dengue) 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu 2.1.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết - Bệnh nhân ≥ 18 tuổi, có chứng nhiễm trùng lâm sàng điểm SOFA≥ - Đồng ý tham gia nghiên cứu 2.1.1.2.Tiêu chuẩn lựa chọn nhóm chứng - 71 người khỏe mạnh tham gia hiến máu tình nguyện đến khám sức khỏe định kỳ Bệnh viện TƯQĐ 108, không mắc bệnh mạn tính tiền sử, khơng mắc bệnh cấp tính thời điểm lấy máu, có xét nghiệm HbsAg âm tính, Anti HCV âm tính, Anti HIV âm tính - 69 bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue: Sốt + xét nghiệm NS1Ag Dengue dương tính và/hoặc ELISA type IgM dương tính, HbsAg âm tính, Anti HCV âm tính, Anti HIV âm tính 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ - Tuổi < 18 năm - Phụ nữ có thai - Người mắc bệnh lý ác tính mạn tính giai đoạn cuối, nhiễm trùng HIV - Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu 2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu - Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 - Bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp, Hải Phòng 2.2.2 Thời gian nghiên cứu - Nghiên cứu tiến hành năm, từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 12 năm 2017 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang, có so sánh bệnh chứng Phương pháp tính cỡ mẫu: Chọn mẫu theo phương pháp thuận tiện có chủ đích 2.3.2 Phương pháp tiến hành nghiên cứu 2.3.2.1 Tiến hành lấy mẫu xử lý, bảo quản lưu trữ mẫu • Mỗi bệnh nhân nghiên cứu nhóm chứng lấy 2ml máu thời điểm chẩn đoán, mẫu máu chứa ống EDTA K2 gửi lên khoa SHPT để xử lý bảo quản mẫu • Các mẫu máu đựng ống EDTA K2 ly tâm 5000 vòng vòng 15 phút nhiệt độ phịng, sau hút phần huyết tương pha chuyển sang ống Epfendor, ghi lại thông tin mẫu bệnh phẩm lưu trữ tủ lạnh nhiệt độ âm 20 độ C 2.3.2.2 Tách chiết ARN tổng hợp cDNA - Tách chiết ARN, lưu nhiệt độ -20°C dùng để tổng hợp cDNA - Tổng hợp cDNA, sử dụng kít thương mại tổng hợp cDNA hãng Ferenzymtas Sử dụng Primer tổng hợp cDNA tự thiết kế bao gồm 16 mồi (cDNA Stemloop primer) • Điều kiện chạy PCR: 250C 10 phút 60 phút phút 42 C 70 C - cDNA sau tổng hợp xong pha loãng nước RNA, DNA tự để tổng thể tích 100µl Sử dụng 5µl cho phản ứng realtime PCR 2.3.2.2 Quy trình định lượng miRNA Thành phần phản ứng: Master mix SYBR luminar: 5µl, Primer mix – FR: 1µl/ miRNA (miRNA-16, miRNA- 146-3p, miRNA147b, miRNA- 150, miRNA-155, miRNA-223), cDNA: µl - Chu trình nhiệt chạy SYBR, 45 cycles: 50°C- phút, 95°C-10 phút, 95°C- 15 giây, 58°C-phút, 95°C- 15 giây, 60°C-1 phút, 95°C15 giây Mức độ biểu miRNA định lượng tương đối hệ thống máy realtime PCR Agilent Mỗi mẫu xét nghiệm lặp lại lần lấy kết trung bình cộng chu kỳ ngưỡng (CT) Mồi: sử dụng cặp mồi xuôi mồi ngược thiết kế đặc hiệu bới khoa SHPT BV TƯQĐ 108 cho miRNA: miRNA16, miRNA-146-3p, miRNA-147b, miRNA-155, miRNA-223 Thực phản ứng qRT-PCR:Sử dụng Sybergreen mồi tự thiết kế để chạy realtime PCR miRNA-16, miRNA-1463p, miRNA-147b, miRNA-155, miRNA-223 • Điều kiện chạy realtimePCR: Lặp lại chu kì 95 C - 10 phút Lặp lại chu kì 950C - 15 giây Lặp lại 45 chu kì 50 C - phút 580C - phút - Toàn phản ứng thực máy Agilent - Nội chuẩn: MiRNA-16 lựa chọn làm nội chuẩn - Xét nghiệm định lượng miRNA thực khoa sinh học phân tử Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 • Phân tích kết quả: - Dựa vào phần mềm có sẵn máy Agilent để xác định chu kỳ ngưỡng miRNA, mức độ biểu tương đối miRNA dựa theo cơng thức tính tốn - Kết phân tích dựa tỷ lệ miRNA ứng viên nội chuẩn theo công thức Livac 11 BN Nhiễm khuẩn huyết Nhóm chứng n=140 n=125 Có sốc n=50 Không sốc n=75 Định lượng miRNA : miRNA-146-3p, miRNA-147b, miRNA-155, miRNA-223 Vai trò miRNA chẩn đ ốn, tiên lượngHìnhNKH2.2 Sơ đồ Người khỏe mạnh (n=71) BN SXH Dengue (n=69) Định lượng miRNA : miRNA-146-3p, miRNA-147b, mi RNA-155, miRNA-223 Sự thay đổi mức độ biểu miRNAở BN NKH, SXH nghiên Dengue người khỏe mạnh 12 Chương KẾT QUẢNGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm nhóm bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết Bảng 3.1.Đặc điểm chung bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết Đặc điểm Tuổi (X±SD) (năm) (min – max) Giới (nam) Số bệnh nhân (n=125) Tỷ lệ (%) 57,6 ± 17,5 (18-87) 90 72,6 Thời gian nằm viện (ngày) 12 (5 - 19) Điểm SOFA 6,1±4,1 Sốc nhiễm khuẩn 50 40 Tử vong 45 36,0 Mắc bệnh lý mạn tính 76 68,8 Không xác định Da, niêm mạc nhiễm Hô hấp khuẩn tiên Tiêu hóa phát Tiết niệu Ổ Thần kinh 18 14,4 17 13,6 22 17,6 27 21,6 18 14,4 23 18,4 Nhận xét:Tuổi trung bình nhóm bệnh nhân NKH 57,6 năm, nam giới chiếm 72,6%.Tỷ lệ SNK tử vong chung nhóm nghiên cứu 40% 36,0% 13 3.2 Mức độ biểu miRNA bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết Bảng 3.7 Mức độ biểu miRNA huyết tương bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết người khỏe mạnh Nhóm nghiên cứu Trung vị (Khoảng tứ phân vị) miRNA p Người khỏe mạnh NKH (n=125) (n=71) miRNA-1463p 0,02 (0,0007-0,63) 0,0002(0,00007-0,001) miRNA-147b 2,12 (0,07-50,07) 0,0173 (0,0059-0041) miRNA-155 0,023 (0,002-0,24) 0,0025 (0,00076-0,0072) miRNA-223 0,0055 (0,00080,06) 0,0008 (0,0004-0,0014)