Bài tiểu luận vaccine và ứng dụng 45

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG  oOo  Đề tài: VACCINE VÀ ỨNG DỤNG BÀI TIỂU LUẬN NHĨM Mơn: Sinh Lý Người Và Động Vật Giảng viên hướng dẫn: Ths: Lại Đình Biên TP.HCM, Tháng năm 2016 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG  oOo  Đề tài: VACCINE VÀ ỨNG DỤNG BÀI TIỂU LUẬN NHÓM Môn: Sinh Lý Người Và Động Vật Giảng viên hướng dẫn: Ths Lại Đình Biên Nhóm sinh viên thực hiện: TP.HCM, Tháng năm 2016 LỜI CẢM ƠN Chúng xin trân thành cảm ơn Ths Lại Đình Biên tận tình bảo, hướng dẫn giúp đỡ chúng tơi suốt thời gian học tập.Một lần nhóm xin trân thành cảm ơn thầy Mặc dù tiểu luận hồn thành khó tránh sai sót.Mong nhận đóng góp ý kiến thầy cô bạn để tiểu luận hồn thiện Từ đó, chúng tơi có thêm nhiều kinh nghiệm để thực tiều luận đồ án sau nghề nghiệp tương lai Sau xin chúc Ths Lại Đình Biên tồn thể thầy Khoa thật dồi sức khỏe, niềm vui để tiếp tục thực sứ mệnh cao đẹp truyền đạt kiến thức cho hệ mai sau Trân trọng cảm ơn! NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN LỜI CAM ĐOAN Chúng người thực tiểu luận xin cam đoan: Bài tiểu luận thành viên nhóm chung tay làm việc, có phân cơng rõ ràng cơng thành viên nhóm Đồng thời, khơng chép tiểu luận Các nội dung tham khảo kỉ lưỡng trước đưa vào tiều luận Chúng chịu hoàn toàn trách nhiệm trước thầy Khoa cam đoan TP.HCM, ngày tháng năm 2016 NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay HAV Hepatitis A Virus (Virus viêm gan A) HBV Hepatitis B virus (Virus viêm gan B) HBsAg viêm gan B) Hepatitis B surface antigen (kháng nguyên bề mặt viru1t PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuổi polymerase) WSV Working seed virus (chủng sản xuất) PFU Plaque Forming Unit ( đơn vị tạo đám hoại tử) PMMK Primary Monkey Kidney Cell (tế bào thận khỉ tiên phát) MSV Master seed virus (chủng gốc giống) AGMK cell African green monkey kidney cell (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi tiên phát) BS-C-1 Tế bào thận khỉ Châu phi thường trực Frhk-4 Tế bào thận khỉ Rhesus bào thai thường trực DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ STT Tên bảng sơ đồ Bảng 2.1: Lịch tiêm chủng vacxin chương trình tiêm chủng mở rộng Việt Nam: Sơ đồ 3.1: Quy trình sản xuất vacxin truyền thống Sơ đồ 3.2: Sơ đồ cấy truyền virus HAV- HM- 175 qua tế bào loài khác Sơ đồ 3.3: Quy trình phân tích xác định gen đích Sơ đồ 3.4: Các chu kì kỉ thuật PCR Sơ đồ 3.5: Quy trình ni cấy tế bào đích vi khuẩn E Coli Trang 21 23 24 26 27 28 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH STT Tên hình Hình 1.1: Edward Jenner (bên trái) Louis Pasteur (bên phải) Hình 1.2: Virus variola tác nhân gây dđậu mùa bị (trái) hình Jenner tiêm chủng cho người (phải) Hình 1.3: Vacxin bệnh đậu mùa bị (trái) Ali Maow Maalin (phải) Hình 1.4: Vacxin BCG- ngừa lao (trái) vacxin Rota ngừa bại liệt (phải) Hình 1.5: Cơ chế bảo vệ thể miễn dịch đặc hiệu Hình 1.6: Cơ chế hoạt động vacxin Hình 1.7: Biểu sốt nhẹ xuất mẫn đỏ tiêm vacxin Hình 1.8: Nghiên cứu vacxin phịng thí nghiệm thử nghiệm khỉ Hình 1.9: Vacxin bại liệt bất hoạt (IPV) (trái) vacxin phòng bệnh dại LYSSAVAC N (phải) Hình 1.10: Vacxin sởi giảm độc lực MVVAC (trái) vacxin 10 thủy đậu giảm độc lực Varilrix (phải) Hình 1.11: Vacxin uốn ván hấp phụ VAT (trái) vacxin giải độc 11 tố bạch hầu, uốn ván Td (phải) Hình 1.12: Vaccin phối hợp phịng bệnh sởi-quai bị-rubella MMR 12 II Trimovax Hình 1.13: Cấu trúc virus viêm gan B vacxin phòng viêm gan 13 B hệ Hình 1.14: Vacxin phịng bệnh viêm gan B r-Hbvax vacxin 14 Cúm INFLUVAC hệ III 15 Hình 2.1: Một số hình thức đưa vacxin vào thể 16 Hình 2.2: Một số thiết bị bảo quản vacxin 17 Hình 2.3: Tiêm chủng vaccin 18 Hình 3.1: Cấu trúc virus viêm gan A 19 Hình 3.2: Vacxin viêm gan A Hình 3.3: Hình kính hiển vi cấu trúc virus viêm gan 20 B 21 Hình 3.4: Một số hệ thống lên men vi sinh vật 22 Hình 3.5: Vacxin viêm gan B 23 Hình 3.6: Quy trình sản xuất vacxin ADN Trang 6 10 10 11 12 13 14 16 17 18 24 26 29 30 31 33 MỤC LỤ LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN .ii KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ .iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH v I Giới thiệu 1.1 Lịch sử phát triển vaccine 1.2 Vaccine .4 1.2.1 Cơ sở lý thuyết 1.2.2 Định nghĩa 1.2.3 Cơ chế hoạt động vaccine 1.2.4 Đặc tính vaccine 1.2.4.1 An toàn .7 1.2.4.2 Hiệu lực 1.2.4.3 Tính kháng nguyên hay tính kháng thể 1.2.4.4 Tính miễn dịch hay tính mẫn cảm 1.3 Phân loại vaccine 1.3.1 Vacxin hệ thứ 1.3.2 Vacxin hệ thứ hai 12 1.3.3 Vacxin hệ thứ ba 13 1.3.4 Dạng kháng - kháng thể vacxin 15 II Ứng dụng vaccine 15 2.1 Nguyên lý sử dụng vaccine 15 2.1.1 Liều lượng đường đưa vaccin vào thể 15 2.1.2 Bảo quản vaccin .17 2.1.3 Đối tượng tiêm chủng .17 2.2 Vaccine ứng dụng thực tế .19 2.2.1 Các loại vacxin hệ 19 2.2.2 Các loại vacxin hệ 22 III Sản xuất vacxin 22 3.1 Sản xuất vacxin truyền thống 22 3.1.1 Quy trình sản xuất chung 22 3.1.2 Vacxin sản xuất 23 3.2 Sản xuất vacxin hệ – Vacxin ADN tái tổ hợp 26 3.2.1 Quy trình sản xuất chung 26 3.2.2 Vacxin sản xuất 28 3.3 Vaccine nghiên cứu 32 IV Hạn chế vacxin 33 4.1 Kém hiệu 33 4.1.1 Kém hiệu lượng .33 4.1.2 Kém hiệu chất .34 4.2 Tai biến 34 4.2.1 Nhiễm bệnh .34 4.2.2 Các bệnh miễn dịch 34 V Kết luận 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường LỜI MỞ ĐẦU Vacxin công cụ hiệu dự phòng bệnh nhiễm trùng Hiện có gần 30 bệnh nhiễm trùng dự phịng vắc xin Khơng giống can thiệp y tế khác, vacxin giúp cho dự phòng bảo vệ sức khỏe cho người qua góp phần phát triển nguồn nhân lực Ngồi việc làm giảm tỷ lệ mắc bệnh tử vong, làm cho trẻ em khỏe mạnh phát triển thể chất trí não bình thường, vacxin cịn giảm mắc bệnh khác, giảm số ngày ốm nhập viện, giảm chi phí chăm sóc y tế, đặc biệt giảm thời gian công sức phụ nữ chăm sóc trẻ bị bệnh làm giảm số trẻ sinh lo trẻ bị ốm chết, góp phần nâng cao sức khỏe phụ nữ, giảm tình trạng tàn phế hay khả lao động bệnh tật gây nên Ngoài tiêm chủng giúp bảo vệ sức khỏe cho người lớn vắc xin phòng cúm, phòng viêm màng não não mơ cầu, phịng ung thư gan, ung thư cổ tử cung Bên cạnh ích lợi trực tiếp gián tiếp vacxin việc làm giảm tỷ lệ mắc tử vong bệnh nhiễm trùng, cịn có tác động lâu dài cho cá nhân cộng đồng, tăng khả suất lao động khơng bị ốm đau Chính lợi ích to lớn mà vacxin mang lại mà nhóm chon đề tài “ Vacxin ứng dụng” để tìm hiểu sâu cụ thể vacxin mà ch1ng mang lại cho người Bài báo cáo gồm phần trình bày cụ thể sau:  Phần I: Giới thiệu: Phần chúng tơi khái qt vacxin  Phần II: Ứng dụng vacxin: Trong phần nhóm tìm hiểu khái quát ứng dụng vacxin đời sống  Phần III: Sản xuất vacxin: Trong phần nhóm trình bày quy trình sản xuất loại vacxin vacxin truyền thống vacxin ADN tái tổ hợp sâu vào nghiên cứu cách sản xuất loại vacxin viêm gan A B  Phần IV: Hạn chế vacxin: Phần nhóm trình bày yếu mà vacxin mang lại cho người  Phần V: Kết luận: Đánh giá lại tồn nhóm tìm hiểu Biển học vơ bờ, cịn nhiều điều cịn chưa đề cập đến hay cịn sai sót chắn tránh khỏi Rất mong nhận đóng góp từ Ths Lại Đình Biên thầy cô Khoa, để báo cáo, luận sau hồn thiện tránh sai lầm khơng đáng có Cuối cùng, xin chúc Ths Lại Đình Biên q thầy thật dồi sức khỏe thành công công việc Xin trân thành cảm ơn ! Trang Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường  Làm bất hoạt: Yêu cầu sản xuất vacxin phải an toàn cho người sử dụng Do vi khuẩn sử dụng để chế tạo vacxin phải khơng cịn khả gây bệnh giữ tính kháng ngun, nghĩa có khả kích thích hệ thống miễn dịch thể  Đối với vacxin vi khuẩn chết: dùng tác nhân diệt khuẩn hóa chất (formalin, alcool, aceton), tia cực tím, siêu âm…  Đối với vacxin từ vi khuẩn sống giảm độc: dùng phương pháp cấy chuyền vi khuẩn nhiều lần môi trường nuôi cấy Ví dụ vacxin BCG (Bacille Calmette Guerin) vacxin chế tạo từ vi khuẩn lao bò cấy chuyền thời gian dài môi trường nuôi cấy  Sản xuất chế phẩm: Sau làm bất hoạt, tiếp tục tinh khiết hóa đơng khơ để tạo sản phẩm, cuối đóng gói Tuỳ theo loại chế phẩm đóng gói dạng thuốc lỏng để uống, dạng thuốc viên, dạng thuốc tiêm  Kiểm tra sản phẩm: Cần phải kiểm tra: Độ vô trùng: chế phẩm vacxin không lẫn vi sinh vật lạ  Đảm bảo đủ nồng độ  Kiểm tra khả gây miễn dịch Sơ đồ 3.1: Quy trình sản xuất vacxin truyền thống 3.1.2 Vacxin sản xuất Do thời gian khơng cho phép nhóm trình bày loại vacxin sản xuất theo phương pháp truyền thống Dưới quy trình sản xuất vacxin viêm gan A theo phương pháp truyền thống: Trang 24 Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Chọn chủng virus viêm gan A: sử dụng chủng HAV HM-175 thu phân lập phân người bị nhiễm bệnh Hình 3.1: Cấu trúc virus viêm gan A Tiến hành cấy truyền qua loài động vật khác để thu chủng virus sản xuất vacxin Quá trình cấy truyền tiến hành sơ đồ sau: Sơ đồ 3.2: Sơ đồ cấy truyền virus HAV- HM- 175 qua tế bào loài khác Trang 25 Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Tạo sinh khối:  Nhận tế bào thận khỉ Maccaca Mulatta tiên phát lớp (PMMK) từ Trung tâm sản xuất vacxin Sabbin (POLIOVAC)  Hỗn hợp tế bào thận khỉ có nồng độ 3.105 tế bào/ml mơi trường LHE (Lactalbumin Hydrolysate Eagle) phân chia vào chai nhựa ba lớp ủ 37oC thay đổi môi trường sau khoảng tuần  Sau 1-2 ngày chọn chai tế bào có lớp đạt yêu cầu để gây nhiễm với virus Gây nhiễm tế bào với 20ml hỗn hợp chủng virus sản xuất (WSV) với tỷ lệ gây nhiễm 0.05 PFU/tế bào  Cho virut hấp thụ vào tế bào 37 oC, hút bỏ hỗn hợp dịch virus thừa Phân chia vào chai 200ml mơi trường trì D’MEM 2% FBS (gồm D’MEM (Gibco) 500ml L, Glutamin (Gibco) 5mM , Gentamyxin sulfat (Gibco) 5g/ml, Fungizon (Gibco) 5g/ml, FBS (Gibco) 10ml)  Nuôi tế bào 21 ngày thay môi trường tuần Nước thu q trình thay mơi trường giữ lại bảo quản -20oC Tinh khiết tế bào:  Ngày 22 chai nuôi cấy đưa vào cất giữ nhiệt độ -70 oC, trừ chứng tế bào (10% mẻ gây nhiễm giữ lại để quan sát tượng gây hủy hoại tế bào không đặc hiệu để kiểm tra tác nhân ngoại lai gây hủy hoại tế bào) Trang 26 Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường  Nước tế bào trứng trộn lại sau ly tâm loại xác tế bào tiến hành kiểm tra tác nhân ngoại lai gây hủy hoại tế bào không đặc hiệu dòng tế bào khác (thận khỉ tiên phát, Vero, Hep2,…)  Các chai tế bào gây nhiễm tiến hành làm đông tan lần, sau trộn với nước thu trình thay mơi trường để ly tâm 6000v/phút nước siêu lọc cô đặc màng Millipore Pellicon 10.000 NMWL (Nominal Molecular Weight Limit) đến thể tích cần thiết  Thêm vào cặn tế bào Triton X- 100 để có nồng độ cối 2%, cho tiếp xúc với nhiệt độ môi trường khoảng oC giời sau tiến hành siêu ly tâm phút, lặp lại chu kì 0.3 Ly tâm loại bỏ cặn nước cặn trọn với dung dịch cô đặc Virus siêu lọc gây bất hoạt Formalin 1/2000 37 oC 96 Lấy mẫu kiểm tra sau gây bất hoạt Pha vacxin: vacxin pha loãng đến hàm lượng 200g/ml dung dịch M199, Al(OH)3 chất bảo quản 2- phenoxyethanol Tween 20 Kiểm tra độ an tồn, thơng số hóa lí, hóa sinh sản phẩm Lọc vơ trùng, đóng chai, dán nhãn đóng gói Hình 3.2: Vacxin viêm gan A 3.2 Sản xuất vacxin hệ – Vacxin ADN tái tổ hợp 3.2.1 Quy trình sản xuất chung Lựa chọn kháng nguyên đích: Lựa chọn kháng nguyên phục vụ cho q trình sản xuất vacxin Phân tích xác định gen đích Việc tiến hành theo sơ đồ sau: Sơ đồ 3.3: Quy trình phân tích xác định gen đích Trang 27 Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Nhân giống gen: sau thu gen đích, tiến hành nhân giống gen nhằm tạo nhiều ADN tái tổ hợp, có hai cách nhân giống gen thường sử dụng: Dùng phương pháp PCR tạo đoạn mồi kéo dài kháng nguyên đích Sơ đồ 3.4: Các chu kì kỉ thuật PCR Trang 28 Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Dùng phương pháp nuôi cấy tế bào vi sinh vật: thường dùng vi khuẩn E Coli làm tế bào chủ tốc độ sản sinh nhanh, thao tác đơn giản, tạo dòng ADN tái tổ hợp nhanh Qui trình thực sau: Sơ đồ 3.5: Quy trình ni cấy tế bào đích vi khuẩn E Coli Trang 29 Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Biểu gen tế bào vật chủ Nuôi thu nhận protein kháng nguyên Tinh kháng nguyên: Tiến hành cô đặc kháng nguyên phương pháp vi lọc tủa sau tinh phương pháp thường dùng sắc kí trao đổi ion, lọc gel hay sắc kí tương tác kị nước hay sắc kí lực để thu nhận kháng nguyên tinh khiết Sản xuất chế phẩm: Tuy theo chế phẩm sử dụng đặc tính kháng nguyên mà chế phẩm sản xuất dạng thuốc uống, tiêm,… Kiểm tra sản phẩm: Kiểm tra độ an toàn vacxin, tiến hành thử nghiệm thơng số hóa lí chế phẩm sau tiến hành thử nghiệm lâm sàn động vật người 3.2.2 Vacxin sản xuất Dưới trình bày sơ nét quy trình sản xuất vacxin viêm gan B phương pháp tái tổ hợp gen: Chọn chủng sản xuất có khả mã hóa sinh tổng hợp kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) Trang 30 Vacxin Ứng Dụng Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Mơi Trường Hình 3.3: Hình kính hiển vi cấu trúc virus viêm gan B Chủng cấy chuyển lần môi trường thạch YPD/Zeocin (thành phần bao gồm Yeast extract 0.5g, Casaminoacid 1g, Dextrose 1g, Agar 1g, Zeocin (100 µg/ ml) 50 µl, nước cất 50 ml) nhân lên môi trường YPD (thành phần gồm Yeast extract 1g, Casaminoacid 2g, Dextrose 2g, nước cất 100ml) Lắc ủ nhiệt độ 30 oC để vòng 7-8 giờ, bổ sung glyxerol với tỉ lệ 1:1 bảo quản -90 oC để thu chủng sản xuất Từ chủng sản xuất, lấy loop đầu que cấy, ria đĩa thạch môi trường YPD/Zeocin ủ 30oC vòng 72 Tiến hành nhân chủng:  Chọn khuẩn lạc từ đĩa thạch cho vào 50ml môi trường YPD bình tam giác Lắc với tốc độ 200v/p, 30oC vòng 40 Đo OD 600nm để kiểm tra độ đậm chủng kiểm tra độ khiết nhuộm soi kính kính hiển vi  Ly tâm 4500v/p 10 phút, bỏ nước lấy cặn Cặn hịa 30 ml mơi trường BMGY (thành phần gồm Yeast extract 15g, Casaminoacid 30g, Yeast nitrogen base (YNB) 20.1 g, đệm Potassium phosphate 1M 150 ml, Glycerol 30 ml nước cất 1500 ml) cấy chuyển vào nồi lên men 2000 ml + 1500 ml môi trường BMGY Khuấy với tốc độ 300v/p 30 oC vịng 48 Kiểm tra q trình nhân lên cách đo OD 600nm sau 24 sau 48 sau Kiểm tra độ khiết cách nhuộm soi kính kính hiển vi  Cấy chuyển từ nồi lên men 2000ml sang nồi nuôi cấy 10000 ml + 6000ml môi trường BMGY để tiếp tục nhân lên (thành phần môi trường tương tự khối lượng thể tích thành phần tăng gấp lần) Khuấy với tốc độ Trang 31 Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường 300v/p, ủ 30oC vòng 30 Kiểm tra độ khiết đo OD 600nm để theo dõi trình nhân lên Chỉnh pH = 6.5 NH4OH sau ni cấy Hình 3.4: Một số hệ thống lên men vi sinh vật Sử dụng nguồn methanol nguồn Cacbon để gây biến nạp nội bào Thêm 80 ml môi trường BMMY 10x (thành phần gồm Yeast extract 32 g Casaminoacid 64 g Yeast nitrogen base (YNB) 42,88 g đệm Potassium phosphate 1M 320 ml) + B x500 ( gồm Na2B4O7 (Borax) 10.061 g Sodium deoxycholate 12,5 g nước cất 5000 ml) sau bổ sung 80ml methanol 50% sau 24 bổ sung 80 ml môi trường BMMY 10x 16 ml B x500 Luôn giữ ph 6.5-7 NH 4OH DO = 30% hệ thống bơm Khuấy liên tục với tốc độ 300v/p 30oC 72 Đo OD600nm để theo dõi trình nhân lên biến nạp sau Thu nhận tế bào, ly tâm 4500v/p vòng 10 phút oC bỏ phần dịch lấy phần cặn rửa lần dung dịch đệm ly giải (Na 2HPO4.2H2O 27,82 g , NaH2PO4 Trang 32 Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường 10,446 g, EDTA 37,21 g, 15 ml Tween 20, nước cất 1000 ml) Cân phần cặn vả bảo quản -70oC Tách chiết HbsAg :  Phá vỡ tế bào nấm men nuôi cấy bi thủy tinh đệm ly giải Sử dụng máy phá vỡ để làm vỡ tế bào dùng CO để giữ lạnh (tốc độ phá vỡ 10000v/p 4oC 10 phút)  Rửa bi thủy tinh tách HBsAg khỏi màng tế bào dd đệm ly giải Rửa cặn ly tâm nhiều lần (4500v/p, 4oC 30 phút) Lấy nước nổi, bỏ cặn kiểm tra phương pháp ELISA đế không cịn HbsAg  Cơ đặc nước phương pháp siêu lọc Milipore Minitan với màng lọc Pellicon cassette M.W.100 000  Tách hạt HbsAg phương pháp siêu âm với chu kì 0.3vịng/s, với cơng suất 200 phút Tinh chế HbsAg:  Hấp thụ gel aerosil 380 mẫu với tỷ lệ 40g/1000ml Ủ, lắc nhẹ 120v/p 37oC sau dem ly tâm 15 phút 4500v/p 20 oC, bỏ phần dịch giữ lại gel, rửa gel nước muối sinh lí đến giá trị OD 280nm 0.4  Dùng đệm Borax 0,01M để phản hấp phụ HbsAg khỏi gel aerosil thực lần, lần 56 oC lắc nhẹ 120v/p Ly tâm 4500v/p sau lần phản hấp phụ  Tách hạt HbsAg phương pháp siêu âm với chu kì 0.3vịng/s, với cơng suất 200 phút  Tinh chế HbsAg lần siêu ly tâm phân vùng với lần dung dịch KBr gradient (1,3 1,32 g/cm3) với tốc độ 25 000 v/p 24 20 o C, lần dung dịch CsCl (1,3 1,32 g/cm 3) với vận tốc 25 000 v/p 19 10o C cuối dung dịch gradient sucrose (10-20-30-40%) với vận tốc 25 000 v/p 19 10 o C Các phân đoạn kiểm tra HbsAg phản ứng ELISA với qui trình ủ 30’-30’-15’ Bất hoạt virus Formaldehyt 1/2000 37oC 96 Sản xuất chế phẩm:  Cơ đặc thẩm tích chế phẩm Amicon cassette  Kiểm tra độ tinh khiết kháng nguyên phương pháp điện di gel Polyacrylamid, PCR hay hình ảnh thơng qua kính hiển vi điện tử  Định lượng HbsAg phương pháp đo mật độ quang ELISA  Định lượng protein phương pháp Lowry  HbsAg tinh khiết pha loãng dung dịch đệm (chứa NaCl CH3COONa) lọc vô trùng qua màng lọc 0.22 , thêm chất phụ gia Al(OH)3 Trang 33 Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường nồng độ đạt 300 hàm lượng HbsAg cuối đạt 20 Bổ sung Merthiolat -chất bảo quản với hàm lượng 0.005% Hình 3.5: Vacxin viêm gan B Đóng lọ, dán nhãn đóng gói 3.3 Vaccine nghiên cứu Các vacxin xem vắc-xin tương lai, có hướng phát triển nay:  Sử dụng phụ gia (adjuvant) mới, nhằm gây loại đáp ứng miễn dịch mong muốn Thí dụ, chất nhơm phosphate oligonucleotide chứa CpG demethyl hóa đưa vào vacxin khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo hướng dịch thể (tạo kháng thể) thay tế bào  Vacxin khảm: sử dụng sinh thể quen biết để hạn chế tượng "phản tác dụng", thí dụ dùng virus vaccinia mang số yếu tố virus viêm gan B hay virus dại  Vacxin polypeptidique: tăng cường tính sinh miễn dịch nhờ liên kết tốt với phân tử MHC: peptide nhân tạo 1/2 giống virus, 1/2 gắn MHC; đoạn peptide mô định kháng nguyên (epitope)  Anti-idiotype: idiotype cấu trúc không gian kháng thể vị trí gắn kháng nguyên, đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng Anti-idiotype kháng thể đặc hiệu idiotype, anti-idiotype xét mặt đặc hiệu lại tương tự với kháng nguyên Vậy, thay dùng kháng nguyên X làm vắc-xin, người ta dùng idiotype anti-anti-X  Vacxin ADN: ADN tác nhân gây bệnh biểu tế bào người chủng ngừa Lợi ADN rẻ, bền, dễ sản xuất số lượng lớn nên thích hợp cho chương trình tiêm chủng rộng rãi Ngồi ra, vacxin ADN giúp định hướng đáp ứng miễn dịch: tác nhân gây bệnh ngoại bào trình diện qua MHC loại II, dẫn đến đáp ứng CD4 (đáp ứng miễn dịch dịch thể) Khi kháng Trang 34 Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường ngun tác nhân thể người biểu hiện, trình diện qua MHC loại I, lúc đáp ứng miễn dịch tế bào qua CD8 kích thích Tuy nhiên phương pháp dao hai lưỡi lẽ tế bào mang ADN lạ có nguy bị nhận diện "khơng ta", sinh bệnh tự miễn Hình 3.6: Quy trình sản xuất vacxin ADN  Sử dụng vectơ tái tổ hợp – dùng vi khuẩn tính tế bào trình diện kháng nguyên tế bào tua chuyển gen để biểu kháng nguyên mong muốn IV Hạn chế vacxin 4.1 Kém hiệu 4.1.1 Kém hiệu lượng Các "lỗ hổng" kho tàng miễn dịch: lý thuyết, tế bào lympho B tạo 1012 loại kháng thể đặc hiệu, cịn lympho T nhận diện 1015 kháng nguyên khác nhau, số lớn vô hạn, hệ miễn dịch chống lại thứ Hiệu vacxinxin tùy thuộc vào thời gian bảo vệ: trí nhớ miễn dịch tồn suốt đời sản xuất kháng thể khơng khơng tái kích thích Trang 35 Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Đột biến tác nhân gây bệnh: chế sinh tồn tác nhân gây bệnh Đột biến đẩy hệ miễn dịch vào rượt đuổi trường kỳ Tiêu biểu cho chế HIV, virus sốt xuất huyết, virus cúm với nguy đại dịch cúm gia cầm 4.1.2 Kém hiệu chất Vai trò phụ gia: để giảm tác dụng không mong muốn vacxin, người ta thường tinh lọc chế phẩm, có vacxin tinh khiết lại trở nên hiệu Đó hệ miễn dịch muốn kích hoạt, phải nhận tín hiệu báo nguy, tín hiệu thường khơng phải kháng nguyên dùng làm vacxin Để khắc phục, người ta dùng số loại phụ gia chế phẩm vacxin Thí dụ phụ gia Freund, nhơm hyđrơxít, nhơm phosphate trộn lẫn vacxin với Loại phản ứng miễn dịch tượng chuyển hướng miễn dịch: tác nhân gây bệnh ngoại bào, đáp ứng miễn dịch dịch thể thích hợp (loại đáp ứng hỗ trợ tế bào lympho Th1) Ngược lại, đáp ứng miễn dịch tế bào (cần hỗ trợ lympho Th2) lại hữu hiệu cho tác nhân gây bệnh nội bào Do đó, vắc-xin gây đáp ứng miễn dịch không loại đáp ứng nên có, hiệu khơng bảo đảm Th1 Th2 có xu hướng khắc chế lẫn Vắc-xin kinh điển có xu hướng tạo đáp ứng Th1 Do bệnh tác nhân nội bào nhiễm leishmania, miễn dịch đặc hiệu sau lành bệnh lại tốt vacxin, vacxin lại gây hiệu ngược, kiềm hãm phản ứng bảo vệ 4.2 Tai biến 4.2.1 Nhiễm bệnh Vacxin sống, giảm độc lực gây bệnh cho người bị suy giảm miễn dịch Nguy hồi phục tác nhân vi sinh: tác nhân bị làm giảm độc lực tìm lại độc tính Nguy vacxin ngừa bại liệt 10 -7, nghĩa 10 triệu trẻ em uống vacxin Sabin có em bị tai nạn loại Điều không may không ngăn cản việc sử dụng vacxin lẽ tỷ lệ xem chấp nhận Nguy nhiễm tác nhân gây bệnh khác vào chế phẩm vacxin Điều hạn chế quy trình sản xuất, bảo quản sử dụng chặt chẽ 4.2.2 Các bệnh miễn dịch Thử nghiệm vacxin phịng bệnh dại cừu cho thấy có xác suất gây EAE (Experimental autoimmune encephalomyelitis), bệnh tự miễn hệ thần kinh khoảng 1/3000-1/1000.Lý vắc-xin chiết xuất từ não chó mang theo mẩu protein tế bào thần kinh, tạo miễn dịch, thể (được tiêm)đã tạo kháng thể chống lại cấu trúc thần kinh Trang 36 Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Vacxin ngừa ho gà gây sốc kèm di chứng thần kinh với xác suất 10 -4-10-6 Việc tinh lọc vacxin làm tăng mức an toàn lần nữa, giảm hiệu V Kết luận Một số vacxin có hiệu quả, khơng kể vacxin đậu mùa tiếng, thí dụ vacxin ngừa bệnh uốn ván, sởi v.v Một số vacxin khác có hiệu vừa phải (hiệu BCG vào khoảng 50%) Ngược lại, có bệnh đến đầu kỷ 21 chưa có vacxin thích hợp (AIDS, sốt rét v.v.) Do vậy, vacxin chưa phải vũ khí vạn để đối phó với bệnh tật Hiệu vacxin khó đánh giá xác Kết nghiên cứu động vật áp dụng 100% cho lồi người, đặc điểm riêng loài Trên lý thuyết, phương pháp để chứng minh hiệu lấy nhóm người, nhóm tiêm chủng, nhóm khơng truyền mầm bệnh cho hai nhóm để xem kết Dĩ nhiên phương pháp sử dụng trái đạo đức Do đó, người ta biến hóa chút, chia nhóm chủng không chủng không truyền bệnh mà quan sát nhiễm bệnh qua ngã thông thường Hạn chế phương pháp vacxin tỏ có hiệu quả, người ta khơng thể triển khai nghiên cứu quy mô rộng để tính xác hiệu số lớn quần chúng bị thiệt thịi khơng bảo vệ Bởi vậy, vacxin xem có hiệu quả, người ta đem tiêm chủng cho người quan sát giảm số người mắc bệnh Tuy nhiên, bệnh có chiều hướng giảm xuống, người ta khơng biết vai trị thật vắc-xin, thí dụ tần suất bệnh lao giảm nhiều, vai trò biện pháp vệ sinh, cách ly nguồn lây đáng kể Tính hiệu vacxin biểu mặt chất (đáp ứng miễn dịch khơng thích hợp) mặt lượng (khơng có đáp ứng miễn dịch) Trang 37 Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] GS Nguyễn Ngọc Lanh, GS.TS Văn Đình Hoa (chủ biên) Miễn dịch học NXB Y Học Hà Nội(2006) [2] GS.TS Phạm Văn Ty (chủ biên) Công Nghệ Sinh Học (tập 5) NXB Giáo Dục [3] GS Nguyễn Lân Dũng (chủ biên) Vi Sinh Vật Học NXB Giáo Dục [4]http://vietsciences.free.fr/giaokhoa/biology/nguyenlandung/visinhvathoc/chuong22sanxuatvasudungvaccin.htm [5]https://webcache.googleusercontent.com/search? q=cache:StjhUJB2FIwJ:https://www.lhu.edu.vn/Data/News/388/files/CN_sinh_hoc_d uoc_pham_tiep_theo_9npem.doc+&cd=1&hl=en&ct=clnk [6]http://elib.tic.edu.vn:8080/dspace/bitstream/123456789/7063/1/5971.pdf [7]http://www.slideshare.net/ngocgiaunguyen94617/95395941cacphuongphapsanxuatvacxincnvsvoivacxinthehemoi-1 Trang 38 Vacxin Ứng Dụng ... Vacxin Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường II Ứng dụng vaccine 2.1 Nguyên lý sử dụng vaccine 2.1.1 Liều lượng đường đưa vaccin vào thể Liều lượng Liều lượng vaccin tùy thuộc vào... NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG  oOo  Đề tài: VACCINE VÀ ỨNG DỤNG BÀI TIỂU LUẬN NHĨM Mơn: Sinh Lý Người Và Động Vật Giảng viên hướng dẫn: Ths Lại Đình... tiểu luận xin cam đoan: Bài tiểu luận thành viên nhóm chung tay làm việc, có phân cơng rõ ràng cơng thành viên nhóm Đồng thời, không chép tiểu luận Các nội dung tham khảo kỉ lưỡng trước đưa vào