Nghiên cứu điều kiện lên men cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - LÊ QUỐC PHONG NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh - Năm 2021 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TSKH NGÔ KẾ SƯƠNG Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … …, ngày … tháng … năm 202… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps sinensis (C sinensis) loài nấm dược liệu quý Chúng chứa nhiều hoạt chất đáng quý adenosine, cordycepin, polysaccharide, β -glucan nhiều loại vitamin khoáng chất khác Những nghiên cứu trước cho thấy C sinensis có nhiều tác dụng tăng cường miễn dịch, chống lão hóa, kháng viêm, hỗ trợ điều trị bệnh liên quan đến phổi, thận, bệnh mãn tính đái tháo đường, gout, ung thư Hiện nay, sản lượng C sinensis thu hái tự nhiên ngày khan đó, ni cấy nhân tạo nấm mơi trường lỏng bán rắn điều cần thiết Ngoài nghiên cứu thơng thường, qua trình ni cấy bổ sung thêm tiền chất nhằm nâng cao chất lượng nấm thu hợp chất thứ cấp có hoạt tính cao quan tâm Trong đó, nguyên tố vi lượng nghiên cứu nhiều selen (Se) Selen nguyên tố tham gia vào cấu trúc acid amin thứ 21 - selenocysteine, ngồi chúng cịn tham gia vào nhiều cấu trúc enzyme kháng oxy hóa quan trọng thể glutathione peroxidase (GPx), iodothyronine deiodinases (DIOs), thioredoxin reductase (Txnrd),… nữa, chúng cịn có vai trị quan trọng hệ miễn dịch bệnh liên quan đến tim mạch, xương Tuy nhiên, dạng vơ Se lại có độc tính với người, để chuyển hóa thành dạng hữu có khả dụng sinh học cao, nấm C sinensis sử dụng để chuyển hóa Se từ dạng vô môi trường thành dạng hữu tích lũy thể nấm, từ nâng cao giá trị loài nấm dược liệu Hơn nữa, Việt Nam, từ năm 1965 có nghiên cứu Se nguyên liệu làm thuốc Đông Y Năm 2003 – 2005, Bộ Y tế khuyến khích định hướng nghiên cứu tìm nguồn Se từ cỏ để làm thuốc Một số dược liệu chứa Se nước ta như: tỏi, nấm linh chi nhàu khuyến khích sản xuất để sử dụng làm thực phẩm chức năng… hàm lượng không ổn định Một số nghiên cứu hàm lượng Se thể cho thấy thiếu hụt Se đáng kể Từ vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen khảo sát hoạt tính sinh học” thực Mục tiêu nghiên cứu luận án Sản xuất sinh khối nấm C sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học cải thiện tạo nguồn Se có khả dụng sinh học cao Các nội dung nghiên cứu luận án Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng selen lên khả sản xuất sinh khối nấm Cordyceps sinensis Nội dung 2: Tối ưu hóa mơi trường điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu selen Nội dung 3: Đánh giá hoạt tính sinh học sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu selen CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm Cordyceps sinensis Cordyceps sinensis lồi nấm kí sinh ấu trùng lồi bướm đêm Thitarodes (Hepialus) armoricanus thuộc họ Hepialidae sống đất Đây loài nấm đặc hữu vùng cao nguyên Tây Tạng vùng đồng cỏ núi cao xung quanh khu vực dãy Himalaya Bhutan, Trung Quốc Nepal độ cao 3500-5000 m so với mực nước biển Giá trị dược liệu loài nấm ghi nhận cách 2000 năm Trung Quốc nước phương Đông với tác dụng cải thiện chức gan thận, đổ mồ hôi đêm, bệnh tiểu đường, máu nhiễm mỡ, hồi phục sức khỏe, bệnh tim, tăng tuổi thọ nâng cao thể trạng thể 1.2 Selen vai trị sinh học selen Se Jacob Berzelius Jưns phát năm 1817 chất thải trình khai thác quặng pyrit Trong đất, Se tồn chủ yếu dạng selenite (Se+4) selenate (Se+6), lượng nhỏ dạng hữu hoạt động vi sinh vật thực vật tạo Hiện nay, 25 gen mã hóa seleno-protein xác định genome người Selenoprotein có chức khác nhau, bao gồm hoạt tính kháng oxy hóa, chức miễn dịch, trao đổi chất hormon tuyến giáp, vận chuyển cân nội môi Se trao đổi chất xương tim 1.3 Nuôi trồng nấm Cordyceps Do nhu cầu sử dụng Cordyceps ngày lớn nên số lượng thu thập ngồi tự nhiên ngày hạn chế Chính vậy, để trì nguồn dược liệu quý này, nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu ni cấy nhân tạo nấm Cordyceps mang lại lợi ích lâu dài cho người Hiện nay, nuôi cấy Cordyceps tiến hành theo hai phương pháp ni cấy lỏng bán rắn Để tăng hoạt tính C sinensis giúp bổ sung lượng Se cần thiết cho thể, chiến lược nuôi cấy làm giàu Se hữu nhà khoa học quan tâm Tuy nhiên, bổ sung Se nồng độ cao ảnh hưởng đến phát triển nấm, vậy, nghiên cứu khả thích nghi, tối ưu thành phần điều kiện môi trường nuôi cấy vấn đề cấp thiết Ngoài ra, tối ưu hóa mơi trường điều kiện ni cấy phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) nghiên cứu áp dụng để nâng cao sinh khối tích lũy Se qua đánh giá tương tác yếu tố để tìm điểm cực trị vùng tối ưu cho thí nghiệm Phương pháp cịn giúp tiết kiệm tối đa thời gian công sức so với phương pháp tối ưu kinh điển CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Chủng nấm Cordyceps sinensis CS-YK2007 cung cấp TS Trương Bình Nguyên, Viện nghiên cứu ứng dụng nông nghiệp công nghệ cao, Trường Đại học Đà Lạt, Lâm Đồng Hóa chất phân tích cung cấp hãng Sigma Aldrich, Fisher Scientific, hóa chất cho nuôi cấy cung cấp hãng Việt Nam Thiết bị: Nồi hấp Jibimed (Trung Quốc); Tủ cấy Shinsaeng (Hàn Quốc); Máy quang phổ Phoenix (Đức); Hệ thống ICP-MS Agilent 7700x (Mỹ); Kính hiển vi (Trung Quốc); Máy đo độ ẩm AND MX–50 (Nhật Bản); Tủ sấy MEMMERT (Đức); Máy đo pH HANNA (Romania); Máy ly tâm Micro 17R (Đức); Cân kỹ thuật PioneerTM Ohaus (Mỹ); Hệ thống NexION 350X Perkin Elmer (Mỹ); Bể điều nhiệt Julabo F34 (Đức) 2.2 Phương pháp 2.2.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến sinh trưởng hệ sợi C sinensis môi trường PGA môi trường lỏng PS 2.2.1.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến C sinensis môi trường PGA Nghiên cứu tiến hành môi trường PGA Sau đó, bổ sung muối selenite Se+4 (Na2SeO3.5H2O) selenate Se+6 (Na2SeO4.12H2O) selenourea (SeC(NH2)2) với nồng độ từ 40 mgSe/L đổ vào đĩa petri Theo dõi tốc độ lan tơ sợi nấm thời điểm 5, 10, 15 ngày xác định đường kính sợi nấm qua kính trắc vi thị kính 2.2.1.2 Khảo sát sự ảnh hướng của Se đến C sinensis môi trường lỏng PS Nghiên cứu tiến hành mơi trường lỏng PS Sau đó, bổ sung muối selenite (Se+4), selenate (Se+6) selenourea với nồng độ 5, 10, 15, 20, 15, 30 mgSe/L Nuôi nhiệt độ 22 ± °C, theo dõi 40 ngày Thu sinh khối, sấy khơ phân tích Se 2.2.2 Phương pháp ni cấy thích nghi cải tiến Sử dụng loại muối Se chọn thí nghiệm 2.2.1 tiến hành qua nồng độ từ đến 25 mgSe/L nđể nấm thích ứng dần 2.2.3 Tối ưu hóa mơi trường điều kiện ni cấy Cordyceps sinensis môi trường lỏng bổ sung selen 2.2.3.1 Sàng lọc thành phần môi trường thiết kế Plackett – Burman Sử dụng thiết kế Plackett-Burman để sàng lọc thơng số số lượng lớn yếu tố trình tối ưu Sàng lọc thành phần môi trường ảnh hưởng đến tổng hợp tiến hành mức (-1 +1) Các nghiệm thức thiết kế theo Plackett – Burman với yếu tố lựa chọn khoai tây, saccharose, peptone, cao nấm men, KH2PO4, K2HPO4, MgCl2 liệt kê bảng 2.3, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 biến độc lập Bố trí 12 thí nghiệm bảng 2.4 Sinh khối thu nhận, sấy khô 60 °C phân tích Se 2.2.3.2 Tối ưu hóa đáp ứng bề mặt Box -Behnken Dựa vào kết thí nghiệm sàng lọc, mơ hình Box – Behnken sử dụng để tối ưu hóa mơi trường nuôi cấy nấm C sinensis giàu Se Mô hình thực mức (-1, +1) với 17 thí nghiệm Sinh khối thu nhận, sấy khơ 60 °C phân tích Se Hàm đáp ứng chọn sinh khối (g/L) hàm lượng Se (µg/g), mơ hình hóa biểu diễn phương trình bậc hai: Y = B0 + B1X1 + B2X2 + B3X3 + B12X1X2 + B13X1X3 + B23X2X3 + B11X12 + B22X22 + B33X32 Trong đó, B1, B2, B3 hệ số bậc 1; B11, B22 B33 hệ số bậc 2; B12, B23 B13 hệ số tương tác cặp yếu tố; X1, X2, X3 biến độc lập 2.2.3.3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy đáp ứng bề mặt D-optimal Tiến hành tối ưu hóa mơi trường D-optimal mức (1, +1) Chuẩn bị môi trường (2L): theo nghiệm thức thiết kế theo D-optimal lặp lại lần 2.2.4 Phương pháp thu nhận cao chiết Sinh khối nấm chiết ngấm kiệt với EtOH 96% theo tỷ tệ 1:10 48 Cô quay chân không để đuổi EtOH thu lấy cao EtOH thô (cao tổng) Cao EtOH thô tiếp tục phân đoạn kỹ thuật chiết lỏng – lỏng qua dung môi PE – EtOAc – Bu – H2O Bã nguyên liệu sau chiết ngấm kiệt đem sấy khơ Sau chiết với nước nóng 65 °C, lọc lấy dịch chiết Sấy khô mẫu 50 °C, bảo quản mẫu tủ lạnh Cao chiết polysaccharide từ bã (CPS) thu nhận Dịch nuôi cấy nấm C sinensis cô đặc, tủa với ethanol lạnh 96% theo tỷ lệ dịch : ethanol (v/v), 24h °C, loại bỏ dịch nổi, thu tủa rửa tủa với ethanol 96% Sấy khô tủa 48h thu EPS Sinh khối bột nấm chiết với 20mL NaOH 0,4M 60°C Dịch đặc giảm thể tích máy quay chân không 60°C Bổ sung ethanol lạnh 96% vào dịch chiết theo tỉ lệ (ethanol:dịch = 5: 1, v/v), giữ qua đêm 4°C, thu tủa Chuyển vào màng thẩm tách - kDa, thẩm tách với nước cất 24h Mẫu sấy khô 24h bảo quản chai tối màu 4°C 2.2.5 Khảo sát hoạt tính sinh học cao chiết 2.2.5.1 Khả bắt gốc tự ABTS Mẫu cao chiết tiến hành phản ứng với dung dịch ABTS đệm PBS pH 7,4, tối 30 phút, Sau tiến hành đo OD 734nm đánh giá khả bắt gốc tự 2.2.5.2 Khả bắt gốc tự DPPH Mẫu cao chiết tiến hành phản ứng với dung dịch DPPH methanol 80%, tối 30 phút, Sau tiến hành đo OD 517 nm đánh giá khả bắt gốc tự 2.2.5.3 Xác định lực khử Mẫu cao chiết tiến hành phản ứng với dung dịch K3[Fe(CN)6]) 1% đệm phosphate 0,2 M pH 6,0 50 phút, Sau thêm dung dịch TCA 10%, lắc Thêm FeCl3 1% Đo mật độ quang bước sóng 700 nm 2.2.5.4 Xác định khả bảo vệ DNA Phương pháp đánh giá khả bảo vệ DNA trước công gốc OH tự tạo từ phản ứng fenton Tạo hỗn hợp phản ứng cách cho µL DNA, µL cao chiết, µL H2O2 1M µL 12 Thành phần Se có sinh khối nhằm đánh giá khả tích lũy Se sợi nấm C sinensis q trình ni cấy có bổ sung hai loại Se+4 Se+6 Nhìn chung, lượng Se tích lũy sinh khối nấm C sinensis tăng dần tương ứng với mơi trường có chứa Se từ 30 mg/L (hình 3.2) Hình 3.2 (A) Sự phát triển sinh khối nấm Cordyceps sinensis môi trường lỏng có bổ sung selenite selenate nồng độ 30 mgSe/L sau 40 ngày (B) Sinh khối nấm Cordyceps sinensis môi trường lỏng bổ sung selen từ – 30 mgSe/L sau 40 ngày 13 Ba nguồn selen tương ứng selenite, selenate selenoure Chữ cột thể khác biệt mặt thống kê nghiệm thức loại selen với giá trị α = 0,05 Do nghiên cứu này, ngưỡng Se 25 mg/L Se+6 nồng độ Se thích hợp cho phát triển sản xuất sinh khối nấm C sinensis 3.1.3 Về khả nâng cao phát triển sản xuất sinh khối của nấm Cordyceps sinensis môi trường bổ sung selenate phương pháp ni cấy thích nghi cải tiến Nấm C sinensis ni cấy theo phương pháp cải tiến (PP2) có hiệu suất sinh khối đạt cao so với nấm ni cấy theo phương pháp truyền thống (PP1) (Hình 3.3) Sợi nấm PP2 mọc đều, dày phủ kín bề mặt hộp, sợi nấm PP1 mọc yếu, chưa phủ kín bề mặt mỏng Hàm lượng sinh khối thu từ PP2 đạt 17,31 ± 1,12g/L cao gấp 1,2 lần so với PP1 chỉ đạt 14,52 ± 0,82g/L (p < 0,05) So với đối chứng, sinh khối PP2 giảm khoảng 16%, PP1 giảm gần 30% (hình 3.3) Qua nhận thấy, PP2 cải thiện gần 50% khả sản xuất sinh khối so với PP1 Đối với tích lũy Se PP2 PP1, hàm lượng Se sinh khối PP2 thấp so với sinh khối PP1, tương ứng 1354,97 ± 54,54µg/g 1644,83 ± 116,45µg/g Tuy nhiên, tổng Se có sinh khối PP2 tương đương so với PP1 (23454,53 23882,93µg Se tương ứng) Qua kết nhận thấy PP2 nâng cao khả sản xuất sinh khối nấm môi trường giàu Se Phân tích hàm lượng selen nguyên dạng phương pháp HPLC-ICP/MS cho thấy, sinh khối nấm nuôi phương pháp cải tiến (PP2) có chứa selenate (Se+6) cao với hàm lượng 991,9 µg/g, 14 sau selenomethionine (SE-MET) (383,9 µg/g) Một lượng nhỏ selenocystine (SE-CYS2) phát sinh khối PP2 Trong đó, sinh khối nuôi theo phương pháp truyền thống (PP1), SE-MET dạng selen nguyên dạng tích lũy cao với 645,6 µg/g, SE-CYS2 (93,5 µg/g) Hình 3.3 (A) So sánh sản xuất sinh khối (cột) hấp thụ selen (đường gạch nối) nấm Cordyceps sinensis hai phương pháp nuôi cấy truyền thống cải tiến sau 40 ngày Đối chứng: nấm nuôi cấy phương pháp truyền thống không bổ sung selen; PP1 PP2: nấm nuôi cấy phương pháp truyền thống cải tiến tương ứng có bổ sung selen Nguồn selen sử dụng selenate với nồng độ bổ sung 25mgSe/L (B) Hình thái sợi nấm phát triển 15 môi trường thạch sau 14 ngày (C) sản xuất sinh khối nấm môi trường lỏng theo nghiệm thức tương ứng sau 40 ngày 3.2 Tối ưu hóa mơi trường điều kiện ni cấy để nâng cao chuyển hóa selen sinh khối nấm Cordyceps sinensis Từ kết sàng lọc Plackett – Burman, nhận thấy saccharose, peptone, khoai tây KH2PO4 yếu tố ảnh hưởng mạnh đến khả sản xuất sinh khối Kết tạo tiền đề tối ưu môi trường nuôi cấy theo phương pháp đáp ứng bề mặt Box Behnken Khi tiến hành đánh giá ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả tích lũy Se mơ hình Plackett - Burman cho thấy mơ hình khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Như vậy, thành phần môi trường nuôi cấy gồm khoai tây, saccharose, peptone, cao nấm men, KH2PO4, K2HPO4, MgCl2 không ảnh hưởng nhiều đến tích lũy Se sinh khối hệ sợi nấm C sinensis 3.2.1 Tối ưu hóa thành phần mơi trường Sau phân tích số liệu mơ hình Box – Behnken, sử dụng phần mềm DE để dự đốn thành phần mơi trường tối ưu cho phát triển nấm C sinensis Thông số đưa sau: saccharose 53,48 g/L, peptone 11,17 g/L, KH2PO4 1,05 g/L với trọng lượng sinh khối nấm C sinensis lượng Se tổng tích lũy dự đốn đạt 25,35 g/L 24343,86 µg (khoảng 960,31 µg/g) Sau đó, tiến hành kiểm tra thực nghiệm công thức môi trường mơ hình Box – Behnken dự đốn Kết thu cho thấy mơ hình tối ưu hóa môi trường nuôi cấy thực thành công 16 Tóm lại, mơi trường tối ưu cho ni cấy C sinensis thu sinh khối giàu Se theo mô hình Box - Behnken gồm khoai tây 200 g/L, saccharose 53,48 g/L, cao nấm men g/L, peptone 11,17 g/L, KH2PO4 1,05 g/L, K2HPO4 0,5 g/L, MgCl2 0,1 g/L cho phép thu 24,93 g/L sinh khối C sinensis lượng Se tổng tích lũy đạt 26.400,87 µg (1059 µg/g) 3.2.2 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy Dựa vào phân tích, mơ hình D-optimal đưa điều kiện nuôi cấy tối ưu cho nấm C sinensis giàu Se sau: nhiệt độ 20 °C, ánh sáng trắng, pH 6,1 với điều kiện này, trọng lượng sinh khối hàm lượng Se theo mơ hình dự đốn đạt 24,79 g/L 1097 µg/g Sau tiến hành nuôi kiểm chứng điều kiện thu sinh khối 26,45 g/L hàm lượng Se đạt 1068 µg/g Tuy nhiên, điều kiện ni cấy không ảnh hưởng rõ rệt đến hàm lượng Se sinh khối, ngưỡng chuyển hóa C sinensis chỉ đạt khoảng 1000 - 1200 µg/g 3.3 Xác định thành phần hoạt chất dạng selen chuyển hóa nấm Cordyceps sinensis Hiệu suất chiết cao khác phân đoạn cho thấy sinh khối nấm C sinensis giàu selen nhóm C sinensis đối chứng có hàm lượng hợp chất có khác biệt phân đoạn cao Các cao chiết có chứa selen, nhiên hàm lượng selen chủ yếu tập trung nhóm cao chiết phân cực cao, đặt biệt cao chiết có chứa polysaccharide 17 3.4 Về hoạt tính sinh học nấm Cordyceps sinensis giàu selen 3.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa in vitro Nhìn chung, hoạt tính bắt gốc tự ABTS C sinensis giàu Se cao nhóm ĐC Đặc biệt, cao EtOAc thể hoạt tính cao (IC50 = 2026 ± 23,45µg/mL) Tương tự với khả bắt gốc tự ABTS, cao EtOAc thể hoạt tính cao nhất, đặc biệt với nấm giàu Se với giá trị IC50 1.200 ± 69,5µg/mL so với nấm đối chứng 1.598 ± 17,5µg/mL Ở nấm C sinensis giàu Se, cao chiết có lực khử cao cao EtOAc (0,137) cao tổng (0,120) cao nước, cao Bu, cao CPS, IPS, EPS cao PE Ở nhóm ĐC thứ tự lực khử giảm dần theo thứ tự cao tổng > cao nước > cao EtOAc > cao Bu > EPS, IPS > CPS > cao PE Nhìn chung, cao EtOAc, cao tổng thể hoạt tính tốt cao PE cho thấy hoạt tính thấp 3.4.2 Hoạt tính kháng oxy hóa dựa khả bảo vệ tính nguyên vẹn của DNA Kết cho thấy tất cao chiết, IPS EPS có khả bảo vệ nguyên vẹn DNA nồng độ 1500 µg/mL, giảm dần nồng độ cao chiết từ 1500 xuống 1000 500 (µg/mL) mức độ nguyên vẹn DNA giảm theo số mẫu cao Cụ thể, cao EtOAc cao Bu, nước nấm C sinensis giàu Se có hoạt tính tốt, mức độ ngun vẹn DNA tương đương với mẫu 0, (tại nồng độ 500 µg/mL) cao ĐC Trong đó, cao tổng, IPS, cao PE, cao 18 CPS có mức độ toàn vẹn DNA thấp, DNA bị phân mảnh nhiều (hình 3.12) Hình 3.12 Kết bảo vệ DNA mẫu cao chiết; A, C: Kết vạch điện di; B, D kết định dạng 3D; (+): Mẫu DNA ngun vẹn; (-): Mẫu chứng âm (khơng có chất bảo vệ); Nồng độ tương ứng với cao từ trái qua phải: 1500µg/mL-1000µg/mL500µg/mL 3.4.3 Khả ức chế xanthine oxidase Kết cho thấy việc bổ sung Se làm gia tăng đáng kể hoạt tính ức chế enzyme XO nấm C sinensis số phân đoạn cao PE; cao BuOH với IC50 2558,49 ± 208,54, 3017,41 ± 195,25 (µg/mL) Ở hai nhóm nấm, cao có khả ức chế XO cao cao EA với giá trị IC50 1979,96 ± 225,73, 1938,13 ± 165,40 (µg/mL) mẫu giàu Se ĐC 3.4.5 Hoạt tính kháng viêm in vitro 19 Hầu hết cao có hoạt tính kháng viêm nấm C sinensis giàu Se có giá trị IC50 thấp so với ĐC, điều cho thấy bổ sung Se tăng cường hoạt tính kháng viêm nấm Ở cao tổng, PE, EtOAc, CPS, IPS C sinensis giàu Se có hoạt tính tốt so với cao mẫu nấm ĐC (p > 0,05), cụ thể, cao tổng gấp 4,4 lần, cao PE gấp 3,1 lần, cao EtOAc gấp 1,72 lần (các mẫu CPS, IPS ĐC IC50 >1500 µg/mL nên khơng xác định) Trong khoảng nồng độ khảo sát cao cao Bu, cao nước ức chế biến tính bé 50% nên không xác định giá trị IC50 Đối với mẫu cao, cao PE thể hoạt tính tốt với (IC50 = 64,19 ± 0,22 µg/mL), cao tổng (195,58 ± 7,89 µg/mL), cao EtOAc (469,27 ± 16,57 µg/mL), cao CPS (1259,28 ± 46,20 µg/mL) IPS (1280,33 ± 135,22 µg/mL) 3.4.6 Hoạt tính ức chế α–glucosidase Ở nấm C sinensis giàu Se cho thấy phần trăm ức chế enzyme tăng dần theo nồng độ khảo sát giá trị nhỏ 50% nên khơng tính giá trị IC50 nên chúng tơi quan sát dựa vào bảng số liệu phần trăm ức chế enzyme nhận thấy có giá trị âm xuất nồng độ 50 500 µg/mL, phần trăm ức chế enzyme cao cao EtOAc đạt 23,76% nồng độ 5000 µg/mL cao ĐC 12,8%) Đối với nấm C sinensis ĐC ta thấy giá trị âm xuất nhiều hơn, số cao cao EtOH phần trăm ức chế enzyme giảm dần theo nồng độ khảo sát, giá trị phần trăm ức chế enzyme cao nằm cao EtOAc nồng độ 5000 µg/mL đạt 12,8% 3.4.7 Hoạt tính ức chế tăng sinh của tế bào ung thư Kết cho thấy cao chiết nấm C sinensis giàu Se ĐC có khả gây độc tế bào MCF7, cụ thể cao EtOH, PE EtOAc, mẫu ĐC có thêm cao BuOH (Hình 3.14) Đối với cao EtOH, bổ 20 sung Se giá trị IC50 thấp 1,57 lần so với ĐC (p < 0,05) Tương tự cao EtOAc, hoạt tính nấm giàu Se tốt với IC50 = 3,82 ± 0,12g/mL cao mẫu ĐC 7,59 lần, điều cho thấy Se có tác động cộng gộp làm tăng họat tính mẫu cao (hình 3.14) Mặc dù mẫu cao chiết không xác định giá trị IC50 song so với thử nghiệm dòng tế bào MCF-7 kết có điểm tương đồng, cao EtOH, PE, EtOAc cho hoạt tính gây độc cao với khả gây độc 36,87; 37,11; 7,85 (%) Ngoài ra, EPS từ nấm C sinensis giàu Se cho thấy khả gây độc tế bào với 15,06 ± 7,12% nồng độ 100µg/mL 120 100 IC50 (µg/mL) 80 60 a a 40 a a b 20 b EtOAc EtOH ĐC PE BuOH Se Hình 3.14 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư MCF7 Giá trị IC50 thấp thể hoạt tính cao IC50 nồng độ cao chiết 50% tế bào MCF7 bị chết Chữ khác cột thể khác biệt mặt thống kế cao chiết giá trị α = 0,05 21 3.5 Đề xuất quy trình ni cấy sản xuất nấm Cordyceps sinensis giàu selen 3.5.1 Đánh giá độc tính cấp Liều 2500mg/kg liều đậm đặc dung nạp cho chuột nhắt trắng thông qua đường uống kim cho uống chun dụng Kết cho thấy khơng có tượng gây chết động vật thử nghiệm, khơng có triệu chứng bất thường sau giờ, 24 sau cho uống Chuột lô thử nghiệm ăn uống, hoạt động bình thường, phân nước tiểu khơng có bất thường, quan sát thêm đến ngày 14 ngày chuột hoạt động bình thường, ăn khỏe, tăng thể trọng 3.5.2 Đánh giá các tiêu an tồn thực phẩm Bên cạnh việc thử độc tính cấp, chỉ tiêu an toàn thực phẩm tiến hành theo tiêu chuẩn 46/2007/QĐ-BYT, QCVN 82:2011/BYT, 46/2007/QĐ-BYT để đảm bảo chất lượng sản phẩm nấm C sinensis, từ làm tiền đề để xây dựng quy trình công nghệ sản xuất C sinensis giàu Se hữu (hình 3.16) 22 Hình 3.16 Quy trình cơng nghệ nuôi cấy nấm C sinensis giàu Se 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu thu rút số kết luận sau đây: Trong loại muối Se: selenite, selenate selenourea dùng nuôi cấy C sinensis, muối selenate nồng độ 25mgSe/L phù hợp cho qui trình ni cấy thu sinh khối hệ sợi C sinensis giàu selen Xác định thành phần điều kiện tối ưu nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi nấm C sinensis giàu Se sau: môi trường nuôi cấy gồm: khoai tây 200g/L, saccharose 53,48g/L, cao nấm men 4g/L, peptone 11,17g/L, KH2PO4 1,05g/L, K2HPO4 0,5g/L, MgCl2 0,1g/L; muối selenate 25 mg/L điều kiện tối ưu là: nhiệt độ 20°C, ánh sáng trắng, pH 6,1 Hiệu suất sinh khối đạt 26,45 g/L hàm lượng Se tổng khoảng 1068 µgSe/g sinh khối Đã xác minh số dạng selen hữu chuyển hóa từ selenate sinh khối: selenomethylcystein 0,6µgSe/g, selenomethionine 383,9µgSe/g, selenocystamine 3,2µgSe/g selenocystine 85,6µgSe/g Selen tích lũy cao chiết polysaccharide cao chiết nước với hàm lượng tương ứng Hoạt tính sinh học sinh khối nấm C sinensis giàu selen cao so với sinh khối nấm đối chứng không bổ sung selen Đặc biệt, cao chiết ethyl acetate từ sinh khối nấm C sinensis giàu selen thể dược tính sinh học cao kháng oxy hóa hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thư MCF7 Jurkat Đã đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất sinh khối hệ sợi nấm C sinensis giàu selen qui mô pilot (10 L); hiệu suất sinh khối 26,45g/L; 1068 µgSe/g sinh khối Sinh khối hệ sợi nấm C 24 sinensis đạt tiêu chuẩn an toàn thực phẩm theo qui định Bộ Y tế Cuối cùng, nghiên cứu cần thực (1) tiếp tục tổ chức sản xuất thử nghiệm hoạt tính khả kháng khối u, kháng viêm kháng oxy hóa mơ hình in vivo, (2) phân tách, lập hợp chất có cao chiết nấm C sinensis giàu Se có hoạt tính tiềm NHỮNG ĐĨNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Lần xây dựng quy trình sản xuất sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu selen Việt Nam, nhằm nâng cao dược tính lồi nấm hướng đến ứng dụng, đồng thời tạo nguồn selen hữu có khả dụng sinh học cao Một số dạng selen protein phát selenomethylcystein, selenomethionine, selenocystamine selenocystine sinh khối nấm dẫn liệu có giá trị giúp làm sáng tỏ thêm đường chuyển hóa selen từ dạng vơ sang hữu điều kiện lên men nấm Cordyceps sinensis Nghiên cứu làm rõ ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng điều kiện môi trường đặc biệt nhiệt độ (20°C), pH 6.1 ánh sáng trắng sinh trưởng tích lũy selen nấm Cordyceps sinensis Nghiên cứu chứng minh sinh khối nấm giàu selen có hoạt tính kháng oxy hóa cải thiện Đặc biệt chúng tơi phát cao chiết ethyl acetate từ sinh khối nấm cao chiết tiềm kháng phân bào tế bào ung thư vú 25 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Trần Minh Trang, Phạm Tiến Dũng, Lê Quốc Phong, Đinh Minh Hiệp (2016), Nghiên cứu khả hấp thu selenium của nấm Ophiocordyceps sinensis ni cấy lỏng, Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ (ISSN 1859-0128), Đại học Quốc gia TP.HCM, tập 19, số T6, trang 53-61 Lê Quốc Phong, Nguyễn Tài Hoàng, Phạm Thị Mỹ Ninh, Trần Minh Trang, Đinh Minh Hiệp, Ngô Kế Sương (2017), Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sản xuất sinh khối nấm Ophiocordyceps sinensis có bổ sung selen, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (ISSN 1811-4989), Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tập 15, số 3A, trang 281-288 Lê Quốc Phong, Nguyễn Hoàng Đăng Khoa, Nguyễn Tài Hoàng, Đinh Minh Hiệp, Ngơ Kế Sương (2020), Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính úc chế xanthine oxidase của nấm Ophiocordyceps sinensis giàu selen, Hội thảo khoa học Công nghệ Sinh học ứng dụng (lần 2), Khoa Công nghệ, Trường Đại học Văn Lang, tháng 7/2020, NXB Nông nghiệp trang 201-208 (ISBN 978604-60-3195-6) Lê Quốc Phong, Nguyễn Hoàng Đăng Khoa, Nguyễn Tài Hồng, Đinh Minh Hiệp, Ngơ Kế Sương (2020), Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bảo vệ DNA in vitro của nấm Ophiocordyceps sinensis giàu selen, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm 2020, Thành phố Huế, tháng 10/2020, chủ đề “Công nghệ sinh học: Từ 25 nghiên cứu đến ứng dụng phục vụ cơng nghiệp hóa, đại hóa đất nước”; Kỷ yếu Hội nghị, trang 268-273, NXB Đại học Huế (ISBN 978-604-974-562-1) Lê Quốc Phong, Nguyễn Hoàng Đăng Khoa, Đặng Tú Qun, Nguyễn Tài Hồng, Đinh Minh Hiệp, Ngơ Kế Sương (2020), Đánh giá hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn ức chế enzyme αglucosidase in vitro của nấm Ophiocordyceps sinensis giàu selen, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam (ISSN 1859-4794), Bộ Khoa học Công nghệ, series B, tập 62, số 8, trang 19-24 Le, Q.P., Nguyen, T.H., Huynh, V.P., Nguyen, T.T.M., Tran, M.T., Dinh, M.H., Ngo, K.S (2020), Optimization of culture parameters of selenium-enriched Ophiocordyceps sinensis biomass by response surface methodology, International Journal of Agricultural Technology (ISSN 2630-0192), 16(4):855-866 ... Một số nghiên cứu hàm lượng Se thể cho thấy thiếu hụt Se đáng kể Từ vấn đề trên, đề tài ? ?Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen khảo sát hoạt tính sinh học? ?? thực... tiêu nghiên cứu luận án Sản xuất sinh khối nấm C sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học cải thiện tạo nguồn Se có khả dụng sinh học cao Các nội dung nghiên cứu luận án Nội dung 1: Khảo sát ảnh... tương ứng Hoạt tính sinh học sinh khối nấm C sinensis giàu selen cao so với sinh khối nấm đối chứng không bổ sung selen Đặc biệt, cao chiết ethyl acetate từ sinh khối nấm C sinensis giàu selen thể