Điều chỉnh quy trình semi-nested RT-PCR chẩn đoán Tilapia Lake virus (TiLV) và bước đầu phân lập TiLV từ cá rô phi Việt Nam

Tilapia Lake virus là loại virus được phát hiện trên cả cá rô phi trong tự nhiên và cá rô phi nuôi. Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên về TiLV phân lập tại Việt Nam. Trong năm 2019 và 2020, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thu thập 51 mẫu cá rô phi nghi ngờ nhiễm TiLV tại thành phố Hồ Chí Minh (Tp. HCM) và Vĩnh Long.

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ĐIỀU CHỈNH QUY TRÌNH SEMI-NESTED RT-PCR CHẨN ĐỐN TILAPIA LAKE VIRUS (TiLV) VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN LẬP TiLV TỪ CÁ RÔ PHI VIỆT NAM Ngô Huỳnh Phương Thảo1*, Trần Hạnh Triết1, Nguyễn Hồng Thụy Vy1, Lê Thị Thu Thảo1, Bùi Nguyễn Chí Hiếu1, Trần Thị Thanh Hương1, Nguyễn Hoàng Chi Mai2, Lê Hồng Thế Huy3, Trần Nhựt Linh4 TĨM TẮT Tilapia Lake virus loại virus phát cá rô phi tự nhiên cá rô phi nuôi Đây nghiên cứu TiLV phân lập Việt Nam Trong năm 2019 2020, nhóm nghiên cứu tiến hành thu thập 51 mẫu cá rô phi nghi ngờ nhiễm TiLV thành phố Hồ Chí Minh (Tp HCM) Vĩnh Long Kết semi-nested RT-PCR cho thấy có 02/51 (3,9%) mẫu dương tính với virus TiLV, mẫu cịn lại cho kết âm tính Việc ni cấy virus dịng tế bào E-11 thực thành cơng 02 mẫu virus TiLV Việt Nam (VL160 VL167) Tuy nhiên, mẫu virus TiLV Việt Nam chưa trì thành cơng dịng tế bào E-11 qua lần cấy chuyền quy trình cần phải tối ưu thêm Ngoài ra, nghiên cứu thay đổi quy trình semi-nested RT-PCR chẩn đốn TiLV để đạt hiệu khuếch đại tốt hơn, so với 02 quy trình semi-nested RT-PCR cho TiLV phổ biến cách thay cặp mồi đặc hiệu cặp mồi Random hexamer/OligodT phản ứng tổng hợp cDNA Mặc dù, độ nhạy quy trình RT-PCR tối ưu cần khảo sát thêm nồng độ mẫu RNA khác nhau, quy trình RT-PCR ứng dụng đơn vị kiểm soát dịch bệnh thủy sản để tăng hiệu phát virus TiLV Từ khóa: Tilapia Lake virus, cá rơ phi, phản ứng semi-nested RT-PCR, tế bào E-11 I GIỚI THIỆU Tilapia Lake virus (TiLV) tìm thấy lần cá rơ phi nuôi vào năm 2014 Israel (Eyngor et al., 2014a) Đây loại virus RNA mạch đơn, sợi âm, có vỏ bọc chứa 10 đoạn trình tự mã hóa cho 14 protein (Bacharach et al., 2016; Eyngor et al., 2014a; Surachetpong et al., 2017), với kích thước từ 55 đến 100 nm (DelPozo et al., 2017; Eyngor et al., 2014a; Ferguson et al., 2014; Surachetpong et al., 2017; Acharya et al., 2019) Trước đây, TiLV đề xuất thuộc họ Orthomyxoviridae tương đồng với cấu trúc gen Orthomyxoviruses Tuy nhiên, sau TiLV xếp vào họ mới, Amnoonviridae, thuộc Articulavirales với Orthomyxoviridae (ICTV, 2020) Tỷ lệ chết ổ dịch tự nhiên từ 09-90%; bệnh xuất lứa tuổi chủ yếu tập trung cá giống (01-03 tháng tuổi) Cá rô phi đỏ (cá điêu hồng) giống ni lồng bị nhiễm bệnh, tỷ lệ chết lên tới 90% vòng tháng sau thả Bệnh lây lan theo chiều ngang từ cá bệnh sang Trung tâm Cơng nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Đại học Nguyễn Tất Thành Trường Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh * Email: nhpthao.snn@tphcm.gov.vn; tilv.bc2@gmail.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 45 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II cá khoẻ ao nuôi, trại nuôi, qua nguồn nước, dụng cụ … (Cục Thú y, 2017); đồng thời theo chiều dọc từ cá bố mẹ sang cá thông qua trứng tinh trùng cá (Dong et al., 2020) Vào tháng năm 2017, FAO ban hành hệ thống cảnh báo sớm thông tin toàn cầu số 338 TiLV (FAO, 2017) Tổ chức Thú y Thế giới (World Organization for Animal Health, OIE) công bố trang thông tin bệnh TiLV (OIE, 2017a) Sau đó, 14 quốc gia/vùng lãnh thổ báo cáo với OIE diện TiLV, ví dụ Đài Loan (OIE, 2017b), Israel (OIE, 2017c), Thái Lan (OIE, 2017d), Malaysia (OIE, 2017e), Peru (OIE, 2018) Philippin (OIE, 2017f) Trong OIE gọi dịch bệnh TiLV gây “tilapia lake virus” ((OIE), 2017a), số tên khác sử dụng báo cáo khoa học bệnh viêm gan virus cá rô phi (syncytial hepatitis of tilapia, SHT) (Ferguson et al., 2014) Hội chứng chết hàng loạt tháng nuôi đầu (1-month mortality syndrome) (Tattiyapong et al., 2017) Bệnh lây lan qua hoạt động vận chuyển cá rô phi giống mang mầm bệnh từ nước sang nước khác Tại Việt Nam, cá rô phi kỳ vọng đối tượng nuôi xuất chủ lực ngành thủy sản Tuy nhiên, việc nuôi thâm canh cá rô phi gặp phải trở ngại lớn dịch bệnh xuất ngày nhiều lây lan diện rộng, gây thiệt hại đáng kể cho người nuôi Từ năm 2015, Việt Nam có nhập cá rơ phi làm giống thực phẩm từ số nước có cơng bố dịch bệnh TiLV (Thái Lan, Đài Loan, Israel, Philippin) nước nguy cao xuất bệnh (Vương quốc Anh, Trung Quốc) Nguy TiLV xâm nhiễm vào Việt Nam thông qua đường nhập cá rô phi giống cao bệnh chưa có danh sách bệnh phải công bố dịch theo quy định OIE (Jansen et al., 2019) pháp luật hành Việt Nam (Cục Thú y, 2017a) Ngoài ra, Cục 46 Thú y tổ chức phối hợp đơn vị liên quan tổ chức điều tra, lấy mẫu xét nghiệm TiLV cá rơ phi, tính đến lấy xét nghiệm 257 mẫu cá 15 tỉnh, thành phố, có 60 mẫu (chiếm 26,43%) dương tính với TiLV (Chi cục Chăn ni, Thú y Thủy sản tỉnh Bình Dương, 2017) Do đó, theo nhận định OIE, FAO Mạng lưới Trung tâm Nuôi trồng thủy sản khu vực Châu Á Thái Bình Dương (NACA), Việt Nam nước thuộc diện có nguy cao bệnh Để chuẩn bị sẵn sàng đối phó với dịch bệnh nguy hiểm này, Cục Thú y bước đầu ban hành số văn đạo nhằm cảnh báo nguy bùng phát lây lan dịch bệnh TiLV gây cá rô phi, công văn 1357/TY-TS ngày 17/7/2017 hướng dẫn phòng, chống bệnh TiLV cá rô phi; công văn số 8862/BNN-TY ngày 20/10/2017 đạo áp dụng biện pháp cấp bách phòng, chống dịch bệnh TiLV gây cá rơ phi Quy trình semi – nested RT-PCR phát TiLV mẫu cá bệnh dựa theo cơng bố Dong et al (2017) Quy trình dựa vào đoạn trình tự số gen TiLV đơn vị thuộc Cục thú y Việt Nam ứng dụng chẩn đoán TiLV (TCCS 05:2017/ TY-TS) Sau đó, Taengphu et al (2020) phát triển quy trình tương tự đoạn trình tự số chủng TiLV Cả hai quy trình sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen mục tiêu vào q trình tổng hợp cDNA Chính vậy, nghiên cứu này, mồi Random hexamer OligodT sử dụng vào trình tổng hợp cDNA phản ứng seminested RT-PCR chẩn đoán TiLV so sánh hiệu khuếch đại quy trình với Ngồi ra, chưa có nghiên cứu ni cấy chủng TiLV phân lập từ cá rô phi nuôi Việt Nam Do đó, nghiên cứu tiến hành thu thập ni cấy chủng TiLV Việt Nam dịng tế bào E-11 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguồn gốc mẫu virus TiLV đối chứng tế bào E-11 Chủng TiLV-TL Thái Lan dòng tế bào E-11 (https://www.sigmaaldrich.com/catalog/ product/sigma/01110916?lang=en®ion=VN ) cung cấp Khoa Khoa học Công nghệ, trường Đại học Suan Sunandha Rajabhat, Thái Lan Mẫu cá rơ phi dương tính với TiLV (TiLVRIA2) cung cấp Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Mẫu mô phân lập từ trại cá rô phi Tp HCM bảo quản cồn 96o 2.2 Quy trình semi-nested RT-PCR chẩn đoán TiLV với mồi Random hexamer OligodT 2.2.1 Tách chiết RNA RNA virus tách chiết từ mẫu cá dung dịch Trizol Mô cá nhiễm TiLV (10 mg) 200 µL dịch ni cấy virus TiLVTL tế bào E11 trộn với mL TRISure (Bioline) đồng máy Qiagen TissueLyserII tần số rung (Oscillation frequency) 50 Hz/giây thời gian phút 4oC Sau đồng nhất, mẫu ủ nhiệt độ phòng phút bổ sung thêm 100 µL BCP (Merck), lắc mạnh tuýp 15 giây tiếp tục ủ nhiệt độ phòng 15 phút Mẫu ly tâm tốc độ 20.000 xg 15 phút 4°C tách pha Phần pha bên chuyển qua tuýp 1,5 mL (khoảng 300-500 µL) Lượng isopropanol lạnh tương đương thể tích mẫu bổ sung để tủa RNA Các tuýp đảo 5-7 lần ly tâm tốc độ 20.000 xg 15 phút 4°C. Cặn đáy tube rửa với mL ethanol 75% lạnh tiếp tục ly tâm 20.000 xg phút nhiệt độ phòng Cặn sau rửa phơi khơ nhiệt độ phịng 5-10 phút Sau đó, cặn hịa 10-20 µL nước nuclease-free (Thermo Fisher Scientific) qua đêm 4oC RNA bảo quản -80oC dùng Nồng độ chất lượng RNA sau tách kiểm tra máy Nanodrop (Thermo Scientific) Ngoài ra, để làm tăng hiệu suất tách chiết RNA từ dịch nuôi cấy TiLV, kit QIAmp Viral RNA Mini (Qiagen) sử dụng theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.2.2 RT-PCR chẩn đốn TiLV Quy trình semi-nested RT-PCR khuếch đại đoạn trình tự thứ TiLV với mồi gồm Nested ext-1 (5’-TAT GCA GTA CTT TCC CTG CC-3’), ME1 (5’-GTT GGG CAC AAG GCA TCC TA-3’) 7450/150R/ME2 (5’TAT CAC GTG CGT ACT CGT TCA GT-3’) (Eyngor et al., 2014; Kembou Tsofack et al., 2017; Dong et al., 2017) quy trình phổ biến, Trung tâm chẩn đốn virus TiLV sử dụng Trong quy trình này, phản ứng tổng hợp cDNA tiến hành với kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific™), gồm μl mẫu RNA (100–400 ng), 0,4 μM mồi Nested ext-1 ME1, mM dNTP, μl Reverse Transcriptase, μl RiboLock RNAse inhibitor 1X dung dịch đệm tổng thể tích 20 μl Chương trình nhiệt gồm 25oC 10 phút, 50oC 30 phút 94oC phút Sau sản phẩm cDNA khuếch đại phản ứng Nested PCR với cặp mồi Nested ext-1 ME1 (PCR1, 415 bp) cặp mồi 7450/150R/ME2 ME1 (PCR2, 250 bp) kit DreamTaq Green PCR master mix (Thermo Scientific) Phản ứng PCR gồm 1,5 μL cDNA, 0,4 μM mồi Nested ext-1 ME1, 1X DreamTaq Green PCR master mix tổng thể tích 25 μL Chương trình nhiệt TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 47 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II gồm chu kỳ 94oC phút 25 chu kỳ với 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s, chu kỳ 72oC phút Phản ứng PCR2 tiến hành thể tích 20 μL gồm có μL sản phẩm PCR1, 0,25 μM mồi 7450/150R/ME2 ME1, X DreamTaq PCR master mix Chương trình nhiệt tương tự phản ứng PCR1 (Dong et al., 2017a) Quy trình RT-PCR khuếch đại đoạn trình tự thứ TiLV thiết kế với mồi gồm TiLV/nSeg1F (5′-TCT GAT CTA TAG TGT CTG GGC C-3′), TiLV/nSeg1R (5′-AGT CAT GCT CGC TTA CAT GGT-3′) TiLV/ nSeg1RN (5′- CCA CTT GTG ACT CTG AAA CAG -3′) (Dong et al., 2020; Taengphu et al., 2020) Quy trình có độ nhạy cao gấp 100 lần so với quy trình RT-PCR đoạn trình tự số TiLV Trong quy trình này, phản ứng tổng hợp cDNA tiến hành với kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, gồm μl mẫu RNA (100 ng), 0,4 μM mồi TiLV/nSeg1F TiLV/nSeg1R, mM dNTP, μl Reverse Transcriptase, μl RiboLock RNAse inhibitor 1X dung dịch đệm tổng thể tích 20 μl Chương trình nhiệt gồm 25oC 10 phút, 50oC 30 phút 94oC phút Sau sản phẩm cDNA khuếch đại phản ứng Nested PCR với cặp mồi TiLV/ nSeg1F TiLV/nSeg1R (PCR1, 620 bp) cặp mồi TiLV/nSeg1F TiLV/nSeg1RN (PCR2, 274 bp) Phản ứng PCR gồm 1,5 μL cDNA, 0,4 μM mồi TiLV/nSeg1F TiLV/ nSeg1R, 1X DreamTaq Green PCR master mix tổng thể tích 25 μL Chương trình nhiệt gồm trình nhiệt gồm chu kỳ 94oC phút, 25 chu kỳ với 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s, chu kỳ 72oC phút Phản ứng PCR2 tiến hành thể tích 25 μL gồm có μL sản phẩm PCR1, 48 0,5 μM mồi TiLV/nSeg1F 0,6 μM mồi TiLV/ nSeg1RN, X DreamTaq Green PCR master mix Chương trình nhiệt tương tự phản ứng PCR1 Ngoài ra, việc sử dụng cặp mồi Random hexamer (5´ – d (NNNNNN) –3´ N = G, A, T or C) OligodT (5´-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3´) để tổng hợp cDNA thay cho cặp mồi đặc hiệu với đoạn trình tự số số nhằm tối ưu quy trình chẩn đốn TiLV Phản ứng tổng hợp cDNA gồm tiến hành với kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, gồm μL mẫu RNA (100 ng), 0,4 μM mồi Random hexamer OligodT, mM dNTP, μl Reverse Transcriptase, μl RiboLock RNAse inhibitor 1X dung dịch đệm tổng thể tích 20 μl Chương trình nhiệt gồm 25oC 10 phút, 45oC 60 phút 85oC phút Sau sản phẩm cDNA khuếch đại với 02 mồi liên quan đến đoạn trình tự số số TiLV với quy trình PCR tương tự Mẫu RNA chủng TiLV-TL ni cấy dịng tế bào E-11 dùng để so sánh hiệu khuếch đại quy trình với Chứng dương mẫu RNA virus TiLV-RIA2, đó, chứng âm mẫu nước Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 1% chứa với 1X dung dịch GelRed® 10,000X (Biotum) dung dịch đệm TAE 0,5X (20 mM Tris (Merck), 10 mM acetic acid (Merck), and 0.5 mM EDTA (Merck)) Kết điện di quan sát máy chụp ảnh gel điện di (GelDoc-it2, UVP) 2.3 Thu mẫu cá rơ phi nhiễm TiLV Việt Nam Nhóm nghiên cứu tiến hành thu thập mẫu cá rô phi nghi ngờ nhiễm TiLV thông qua dấu hiệu bệnh lý xuất huyết, lở lt thân, bụng phình, tróc vảy, mắt lồi (Dong et al., 2017b; Ferguson et al., 2014; Jansen and TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Mohan, 2017; Surachetpong et al., 2017) trại nuôi cá rô phi Tp HCM Vĩnh Long Các mẫu cá chết vận chuyển đá lạnh (trong vòng 24 giờ) Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM Mẫu gan, thận, lách não mẫu cá nghi ngờ nhiễm TiLV thu, trộn chung chia làm hai phần để bảo quản -80oC cồn 96o Mẫu mô cá bảo quản cồn 96o kiểm tra diện TiLV quy trình semi-nested RT-PCR trình bày Mục 2.2 Đối với mẫu mơ cá 96o dương tính với TiLV, mẫu mơ tương ứng bảo quản -80oC sử dụng để nuôi cấy virus TiLV dịng tế bào E-11 2.4 Ni cấy virus TiLV dịng tế bào E-11 2.4.1 Ni cấy tế bào E-11 Dòng tế bào E-11 (tế bào từ cá lóc Ophicephalus striatus) dịng tế bào nhạy cảm với TiLV Tế bào bảo quản -80oC (khoảng 106 tế bào mL-1) rã đông nhanh 37oC chuyển vào môi trường Liebovitz L-15 (Bioind) nhiệt độ phịng Tiến hành loại bỏ mơi trường đơng lạnh cách ly tâm với tốc độ 450 xg 25oC phút Cặn tế bào huyền phù mơi trường L-15 bổ sung 5% huyết bị (fetal bovine serum, FBS, Sigma) mM L-glutamine (Sigma) với mật độ x 105 tế bào/cm2 ủ 25oC điều kiện khơng có CO2 Thay mơi trường L-15 + 5%FBS + 2mM L-glutamine tế bào mọc lan 50% diện tích đĩa ni cấy Khi tế bào E-11 phát triển thành lớp đơn liên tục (monolayer) chiếm 70 – 80% diện tích đĩa ni cấy, tế bào cấy chuyền sang đĩa cảm nhiễm với virus TiLV 2.4.2 Cảm nhiễm tế bào E-11 với virus TiLV Để thu virus từ mẫu bệnh phẩm, mẫu mơ dương tính với TiLV đồng dung dịch Hank’s balanced salt solution (HBSS, Thermo Fisher Scientific) sau ly tâm 3.000 xg 10 phút 4oC (Tattiyapong et al., 2017) Dịch thu lọc qua màng lọc 0,22 μm Sau đó, 0,5 – mL dịch virus sau lọc bổ sung vào đĩa nuôi cấy giếng chứa tế bào E-11 lớp đơn chiếm 70 – 80% diện tích đĩa ủ 25oC 14 ngày Mật độ tế bào quan sát hàng ngày Khi bình ni cấy có hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE, cytopathic effect) với mật độ tế bào bị ly giải từ 50 – 90%, dịch lọc qua màng lọc 0,22 μm, cấy chuyền sang giếng tế bào E-11 với tỷ lệ thể tích 1:1 Để thu virus, dịch lần cấy chuyền thứ với dấu hiệu CPE rõ ràng lọc qua màng lọc 0,22 μm chia vào nhiều tuýp để bảo quản -80oC Dịch nuôi cấy virus kiểm tra diện TiLV quy trình semi-nested RT-PCR (Mục 2.2) cấy chuyền sang bình tế bào nhằm mục đích trì tồn virus cho nghiên cứu sâu sau III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Quy trình semi-nested RT-PCR chẩn đoán TiLV với mồi Random hexamer OligodT Khi sử dụng 01 mẫu RNA để so sánh khả chẩn đốn TiLV quy trình seminested RT-PCR đoạn trình tự số số theo công bố Dong et al., (2017); Dong et al., (2020); Taengphu et al., (2020) với quy trình có điều chỉnh phản ứng tạo cDNA với cặp mồi Random hexamer/OligodT, kết cho thấy khả phát TiLV tốt quy trình RT-PCR sử dụng mồi Random hexamer/ OligodT/Nested ext-1/ME1/ 7450/150R/ME2 (Hình 1) Quy trình điều chỉnh nhóm TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 49 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II nghiên cứu sử dụng cho đợt kiểm tra TiLV sau Căn gen TiLV, số phương pháp PCR thiết lập RT-PCR (Eyngor et al., 2014), nested RT-PCR (Kembou Tsofack et al., 2017), semi-nested RT-PCR (Dong et al., 2017a; Taengphu et al., 2020), RT-qPCR (Kembou Tsofack et al., 2017; Tattiyapong et al., 2017; Waiyamitra et al., 2018) RT-LAMP (Phusantisampan et al., 2019; Yin et al., 2019) Hầu hết phương pháp hướng đến đoạn trình tự TiLV Mặc dù quy trình RT- PCR khuếch đại đoạn trình tự thứ TiLV với mồi gồm TiLV/nSeg1F, TiLV/nSeg1R, TiLV/nSeg1RN Taengphu ctv (2020) đánh giá nhạy mồi khuếch đại đoạn trình tự số (Dong et al., 2017), kết so sánh đề tài lại cho thấy điều ngược lại Việc khảo sát quy mô mẫu lớn nồng độ mẫu khác cần triển khai để kiểm chứng thêm độ nhạy độ đặc hiệu quy trình semi-nested RT-PCR với mồi Random hexamer/OligodT/Nested ext1/ME1/ 7450/150R/ME2 Hình Kết chẩn đốn TiLV quy trình semi-nested RT-PCR đoạn trình tự số (Ex1/ME1) Dong et al., (2017), đoạn trình tự số (nSeq1F/R) Taengphu et al., (2020) q trình tổng hợp cDNA có điều chỉnh với cặp mồi random hexamer/oligodT M: thang DNA 1kb (Thermo); 1: mẫu RNA TiLV-TL tách phương pháp Trizol; 2: mẫu RNA TiLV-TL, tách QIAmp Viral RNA Mini; 3: mẫu TiLV-RIA2; (-): chứng âm 3.2 Phân lập nuôi cấy chủng TiLV Việt Nam 3.2.1 Thu thập mẫu cá nhiễm TiLV 50 Từ tháng 08/2019 đến tháng 06/2020, nhóm nghiên cứu tiến hành 04 đợt thu thập mẫu cá rô phi nghi ngờ nhiễm TiLV TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II bè nuôi cá rô phi Tp HCM (04 mẫu) Vĩnh 5/2019 nơi thu mẫu cá dương Long (47 mẫu) (Bảng 1) Bè ni cá rơ phi tính TiLV Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Tp HCM nhiễm TiLV vào khoảng tháng Thủy sản II Bảng Danh sách mẫu cá rô phi nghi nhiễm TiLV thu Tp HCM Vĩnh Long 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Q3 Q4 Q130 Q134 VL1 VL2 VL3 VL4 VL5 VL6 VL7 VL8 VL9 VL10 VL11 VL12 VL13 VL14 VL15 VL16 VL17 VL18 VL19 VL20 VL21 VL22 VL23 VL24 VL25 VL26 Rô phi vằn Rô phi vằn Rô phi vằn Rô phi vằn Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng Điêu hồng 100 g 100 g 300 g 30 g 210 g 36 g 186 g 53 g 122 g 127 g 55 g 47 g 112 g 52 g 66 g 67 g 179 g 22 g 73 g 52 g 226 g 59 g 156 g 101 g 141 g 133 g 116 g 146 g 182 g 176 g Tp HCM Tp HCM Tp.HCM Tp.HCM Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long Vĩnh Long 08/2019 08/2019 06/2020 06/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 03/2020 Kết chẩn đoán TiLV (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) VL27 Điêu hồng 164 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 32 VL28 Điêu hồng 92 g Vĩnh Long 03/2020 (-) TT Ký hiệu Loài cá Trọng lượng cá Nguồn gốc mẫu Thời gian thu mẫu TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 51 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II TT Ký hiệu Loài cá Trọng lượng cá Nguồn gốc mẫu Thời gian thu mẫu Kết chẩn đoán TiLV 33 VL29 Điêu hồng 170 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 34 VL156 Điêu hồng 600 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 35 VL157 Điêu hồng 350 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 36 VL158 Điêu hồng 270 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 37 VL159 Điêu hồng 400 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 38 VL160 Điêu hồng 350 g Vĩnh Long 06/2020 (+) 39 VL161 Điêu hồng 400 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 40 VL162 Điêu hồng 520 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 41 VL163 Điêu hồng 90 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 42 VL164 Điêu hồng 70 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 43 VL165 Điêu hồng 70 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 44 VL166 Điêu hồng 70 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 45 VL167 Điêu hồng 70 g Vĩnh Long 06/2020 (+) 46 VL168 Điêu hồng 60 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 47 VL169 Điêu hồng 70 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 48 VL170 Điêu hồng 50 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 49 VL171 Điêu hồng 40 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 50 VL172 Điêu hồng 40 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 51 VL173 Điêu hồng 35 g Vĩnh Long 06/2020 (-) Sau mẫu chuyển Trung tâm CNSH Tp HCM, diện TiLV 51 mẫu mô cá kiểm tra bẳng RT-PCR (Hình – 3) Kết RT-PCR cho thấy có mẫu VL160 VL167 dương tính với virus TiLV, mẫu cịn lại (49/51 mẫu) cho kết âm tính Hình Kiểm tra diện TiLV mẫu mô cá nghi nhiễm TiLV thu Tp HCM quy trình semi nested RT-PCR M: thang DNA Hyperladder 1kb (Bioline); 1: Q3; 2: Q4; 3: Q130; 4: Q134; 5, 6: Chứng âm; 7: mẫu virus TiLV-TL 52 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II Hình Kiểm tra diện TiLV mẫu mô cá nghi nhiễm TiLV thu Vĩnh Long (VL156 – VL173) quy trình semi nested RT-PCR M: thang DNA O’Generuler 1kb (Thermo); (+): mẫu virus TiLV- RIA2; (-): Chứng âm Dịch bệnh TiLV thường xảy vào mùa nóng từ tháng Năm đến tháng Mười hàng năm (Kembou Tsofack et al., 2017) Đa số đợt lấy mẫu nghiên cứu rơi vào khoảng mùa hè với nhiệt độ cao Đồng thời, vào thời điểm thu mẫu, tượng nước bị đục khu vực nuôi cá ghi nhận Đây yếu tố môi trường gây stress khiến cá dễ nhiễm bệnh Tuy nhiên, số mẫu cá rô phi bệnh dương tính với TiLV có tỷ lệ thấp (2/51 mẫu, chiếm 3,9%) mức độ nhiễm yếu theo đánh giá cảm quan thông qua kết điện di sản phẩm RT-PCR (Hình - 3) Điều cho thấy dịch bệnh TiLV trại nuôi cá rô phi Tp HCM Vĩnh Long chưa diện nhiều mạnh; đó, chưa gây dịch lớn tổn thất nghiêm trọng 3.2.2 Nuôi cấy virus TiLV từ mẫu cá rô phi nuôi Việt Nam Mẫu cá rơ phi VL160 VL167 dương tính với TiLV sử dụng để cảm nhiễm dòng tế bào E-11 nhằm mục đích phân lập ni cấy virus TiLV Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu chuyên sâu sau Cả hai mẫu VL160 VL167 cho thấy ly giải tế bào với dấu hiệu đặc trưng virus TiLV gây vệt tan xuất lớp đơn tế bào E11 (vật kính 4x) lan dần đến tồn E11 bị ly giải hết Ở vật kính 20x, tế bào E11 có tượng bị co trịn bong tróc khỏi bề mặt bình ni cấy Mẫu VL167 ly giải 80% tế bào sau 02 ngày cảm nhiễm, mẫu VL160 có tốc độ ly giải tế bào chậm hơn, đến ngày thứ ly giải 80-90% tế bào (Hình 4) Sau 89-90% tế bào bị ly giải, phần dịch thu để kiểm tra diện TiLV cấy chuyền sang bình ni cấy tế bào TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 53 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình Hình ảnh sau 2-8 ngày cảm nhiễm tế bào E-11 với dịch đồng mẫu VL160 VL167 Dấu (*): vệt tan tế bào, dấu hiệu ly giải tế bào đặc trưng vật kính 4X Dấu (→): tế bào bị co trịn bong tróc vật kính 20x dpi: số ngày sau cảm nhiễm virus vào tế bào (day post infection) Kết semi-nested RT-PCR có tồn TiLV dịch ly giải tế bào sau cảm nhiễm hai mẫu VL160 VL167 (Hình 5) Điều cho thấy hai chủng virus TiLV VL160 VL167 phân lập bước đầu nuôi cấy thành công Tuy nhiên, tốc độ ly giải tế bào hai chủng ngày chậm yếu dần qua đợt cấy chuyền (Hình 6) Chủng VL160 ly giải 54 tế bào E-11 qua đợt cấy chuyền (P1, P2) không ly giải tế bào lần cấy chuyền thứ (P3) Trong đó, chủng VL167 ly giải tế bào lần nuôi cấy (P1) không tiếp tục ly giải tế bào E-11 cấy chuyền lần (P2) Bên cạnh đó, dịch ni cấy virus P1 bảo quản -80oC 02 chủng khả ly giải tế bào sau rã đơng ni cấy bình tế bào E-11 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Theo nghiên cứu trước đây, việc cảm nhiễm tế bào E-11 với dịch đồng mẫu cá nghi nhiễm TiLV phương pháp chẩn đốn TiLV có độ xác tương đương phản ứng nested RT-PCR (Kembou Tsofack et al., 2017) Nhiều dịng tế bào khác dùng để ni cấy TiLV, tế bào não cá rô phi ban sơ (Eyngor et al., 2014a), OmB, TmB (Kembou Tsofack et al., 2017), CFF (Behera et al., 2018), OnlB, OnlL (Thangaraj et al., 2018) Trong đó, Thangaraj ctv (2018) trì thành cơng virus TiLV qua 20 đợt cấy chuyền dòng tế bào não (OnlB) gan (OnlL) cá rô phi Tuy nhiên, hầu hết nghiên cứu trước chưa đề cập đến tỷ lệ mật độ virus TiLV so với mật độ tế bào ni cấy để đảm bảo q trình ly giải xảy tốt nhất, thời điểm thu virus thích hợp (dựa vào phần trăm tế bào bị ly giải, khoảng 50 - 90%) trước cấy chuyền để thu lượng virus cao Trong nghiên cứu tại, hai mẫu cá VL160 VL167 có mức độ nhiễm TiLV yếu (Hình 3), phát PCR bước quy trình semi-nested RT-PCR với vạch mờ Mặc dù, chủng TiLV hai mẫu nuôi cấy thành công tế bào E-11, cấy chuyền qua đợt hai ba, nhóm nghiên cứu nhận thấy hàm lượng virus có giảm sút dần ly giải tế bào không xảy Điều hai nguyên nhân: là, hai chủng TiLV Việt Nam có hoạt lực yếu nên khơng trì khả xâm nhiễm tế bào qua đợt cấy chuyền, mẫu TiLV-Thái Lan đối chứng cấy chuyền tốt qua nhiều đợt (dữ liệu khơng trình bày báo này); hai là, cần xác định thời điểm thu virus thích hợp trước cấy chuyền TiLV dường không tồn lâu môi trường nuôi cấy thiếu tế bào để xâm nhiễm Do đó, quy trình ni cấy TiLV cần tìm hiểu tối ưu thời gian tới để lưu giữ chủng TiLV Việt Nam cho nghiên cứu sâu sau Hình Kiểm tra diện TiLV dịch nuôi cấy mẫu mơ đồng VL160-P1 VL167-P1 quy trình semi-nested RT-PCR M: thang DNA O’Generuler 1kb (Thermo); (+): mẫu virus TiLV- RIA2 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 55 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình Thời gian ly giải 80-90% tế bào chủng TiLV VL160 (A) VL167 (B) qua đợt cấy chuyền khoảng thời gian từ 01/07/2020 đến 31/07/2020 P: đợt cấy chuyền (passage); dpi: số ngày sau cảm nhiễm virus vào tế bào (day post infection) V KẾT LUẬN Virus TiLV phát quốc gia giới, có cơng bố liên quan đến TiLV phân lập Việt Nam Trong nghiên cứu này, dù số lượng mẫu cịn tập 56 trung hai tỉnh thành, kết chẩn đoán TiLV phản ánh phần tình trạng nhiễm TiLV trại ni cá rơ phi khu vực phía Nam Cụ thể là, dịch bệnh TiLV gây chưa xuất nhiều, chưa có tình trạng lây TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II lan rộng khắp trại cá, chưa mức nghiêm trọng, xảy theo mùa năm phụ thuộc vào yếu tố môi trường (như nhiệt độ cao, nước bị đục) Bên cạnh đó, nghiên cứu bước đầu tăng hiệu chẩn đoán TiLV mẫu có mức độ nhiễm virus yếu với quy trình semi-nested RT-PCR cách sử dụng cặp mồi Random hexamer/OligodT phản ứng tổng hợp cDNA Tuy nhiên, độ nhạy xác quy trình cần định lượng mẫu chuẩn với số lượng TiLV khác Việc phân lập nuôi cấy TiLV bước đầu thành công, cần phải tìm mẫu cá bệnh với mật độ TiLV nhiều hơn; đồng thời điều chỉnh tối ưu hóa thêm quy trình cấy chuyền virus nhằm lưu trữ nguồn TiLV Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu sâu sau LỜI CẢM ƠN Các kết nghiên cứu báo thuộc nhiệm vụ khoa học cơng nghệ “Phân tích hệ gen phiên mã (transcriptome) cá rô phi đỏ (Oreochromis spp.) nhằm sàng lọc thị phân tử tiềm có liên quan đến tính kháng virus TiLV (Tilapia Lake virus)” (Mã số: TS01/19-21) Sở Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Tp HCM cấp kinh phí TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Chi cục Chăn nuôi, Thú y Thủy sản tỉnh Bình Dương, 2017 Phịng, chống bệnh Tilapia lake virus (TiLV) cá rô phi Việt Nam Tại trang: http://cctybinhduong.gov.vn/tin-tuc/ phong-chong-benh-moi-do-tilapia-lake-virustilv-tren-ca-ro-phi-tai-viet-nam-958.html (xem ngày 31/12/2020) Cục Thú y, 2017a “Công văn số 8862/BNN-TY ngày 20/10/2017 đạo áp dụng biện pháp cấp bách phòng, chống dịch bệnh TiLV gây cá rô phi”, Cục Thú y Việt Nam, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Tại trang: http://www.cucthuy.gov.vn/Pages/cong-van-so8862-bnn-ty.aspx (xem ngày 11/01/2021) Cục Thú y, 2017b “Công văn số 1357/TY-TS hướng dẫn phịng, chống bệnh TiLV cá rơ phi” Cục Thú y Việt Nam, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Tại trang: http://www cucthuy.gov.vn/Pages/cong-van-so-1357-ty-ts-vv-huong-dan-phong-chong-benh-do-tilv-tren-caro-phi-.aspx (xem ngày 11/01/2021) Tài liệu tiếng Anh Acharya, V., Chakraborty, H.C., Rout, A.K., Balabantaray, S., Behera, B.K & Das, B.K., 2019 “Structural Characterization of Open Reading Frame-Encoded Functional Genes from Tilapia Lake Virus (TiLV)”, Molecular Biotechnology, 61, tr.945-957 Bacharach, E., Mishra, N., Briese, T., Zody, M C., Kembou Tsofack, J E., Zamostiano, R., Berkowitz, A., Ng., J., Nitido, A., Corvelo, A., Toussaint, N.C., Nielsen, S.C.A., Hornig, M., Pozo, J D., Bloom, T., Ferguson, H., Eldar, A & Lipkin, W., I., 2016 “Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass DieOffs of Tilapia”, MBio, 7(2), e00431-16 Behera, B K., Pradhan, P K., Swaminathan, T R., Sood, N., Paria, P., Das, A., Verma, D.K., Kumar, R., Yadav, M.K., Dev, A.K., Parida, P.K., Das, B.K., Lal, K.K & Jena, J K., 2018 “Emergence of Tilapia Lake Virus associated with mortalities of farmed Nile Tilapia Oreochromis niloticus (Linnaeus 1758) in India”, Aquaculture, 484, tr.168–174 Del-Pozo, J., Mishra, N., Kabuusu, R., Cheetham, S., Eldar, A., Bacharach, E., Lipkin, W.I & Ferguson, H W., 2017 “Syncytial Hepatitis of Tilapia ( Oreochromis niloticus L.) is Associated With Orthomyxovirus-Like Virions in Hepatocytes”, Veterinary Pathology, 54(1), tr.164–170 Dong, H.T., Siriroob, S., Meemetta, W., Santimanawong, W., Gangnonngiw, W., Pirarat, N., Khunrae, P., Rattanarojpong, T., Vanichviriyakit, R & Senapin, S., 2017a “Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection”, Aquaculture, 476, tr.111–118 Dong, H.T., Siriroo, S., Meemetta, W., Santimanawong, W., Gangnonngiw, W., Pirarat, N., Khunrae, K., Rattanarojpong, T., Vanichviriyakit, R., Senapin, S.11 Dong, H.T., Siriroo, S., Meemetta, W., Santimanawong, W., Gangnonngiw, W., Pirarat, N., Khunra, S., 2017b “A warning and an improved PCR detection method for tilapia lake virus (TiLV) disease in Thai tilapia farms”, Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific Retrieved from http:// www.enaca.org TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 57 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Dong, Ha Thanh, Senapin, S., Gangnonngiw, W., Nguyen, V V., Rodkhum, C., Debnath, P P., Delamare-Deboutteville, J & Mohan, C V., 2020 “Experimental infection reveals transmission of tilapia lake virus (TiLV) from tilapia broodstock to their reproductive organs and fertilized eggs”, Aquaculture, 515, tr.734541 Eyngor, M., Zamostiano, R., Kembou Tsofack, J E., Berkowitz, A., Bercovier, H., Tinman, S., Lev, M., Hurvitz, A., Galeotti, M., Bacharach, E & Eldar, A., 2014a “Identification of a Novel RNA Virus Lethal to Tilapia”, Journal of Clinical Microbiology, 52(12), tr.4137–4146 Ferguson, H W., Kabuusu, R., Beltran, S., Reyes, E., Lince, J A., & del Pozo, J., 2014 “Syncytial hepatitis of farmed tilapia, Oreochromis niloticus (L.): a case report”, Journal of Fish Diseases, 37(6), tr.583–589 Food and Agriculture Organization off the United Nations (FAO), 2017 “Outbreaks of Tilapia Lake Virus (TiLV) Threaten the Livelihoods and Food Security of Millions of People Dependent on Tilapia Farming”, FAO, Rome Global Information and Early Warning System (GIEWS) Special Alert No 338 - Global, 26 May 2017 Retrieved from http://www.fao.org/documents/ card/en/c/3ce1da5b-%0A1529-4e7c-8b887adfef8d138c (available on 11/01/2021) Jansen, M.D & Mohan, C V., 2017 “Tilapia lake virus (TiLV): Literature review” Penang, Malaysia: CGIAR Research Program on Fish Agri-Food Systems Working Paper: FISH2017-04 Retrieved from: https://digitalarchive worldfishcenter.org/handle/20.500.12348/121 (available on 11/01/2021) Jansen, M D., Dong, H T & Mohan, C V., 2019 “Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry?”, Reviews in Aquaculture, 11, tr.725– 739 Kembou Tsofack, J E., Zamostiano, R., Watted, S., Berkowitz, A., Rosenbluth, E., Mishra, N., Briese, T., Lipkin, W.I., Kabuusu, R.M., Ferguson, H., del Pozo, J & Bacharach, E., 2017 “Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse TranscriptionPCR”, Journal of Clinical Microbiology, 55(3), tr.759–767 OIE, 2017a “Hepatitis sincitial de la tilapia, Israel”, Immediate Notification Retrieved from https://www.oie.int/wahis_2/public/wahid php/Reviewreport/Review?page_refer=MapF 58 ullEventReport&reportid=23836 (available on 11/01/2021) OIE, 2017b “Tilapia Lake Virus (TiLV), Philippines”, Immediate Notification Retrieved from https://www.oie.int/wahis_2/public/wahid php/Reviewreport/Review?page_refer=MapF ullEventReport&reportid=31034 (available on 11/01/2021) OIE, 2017c “Tilapia Lake Virus (TiLV) – A Novel Orthomyxo-Like Virus”, World Organisation for Animal Health Retrieved from https://www.oie int/fileadmin/Home/eng/Internationa_Standard_ Setting/docs/pdf/A_TiLV_disease_card.pdf (available on 11/01/2021) OIE, 2017d “Tilapia Lake Virus Disease, Chinese Taipei”, Immediate Notification Retrieved from https://www.oie.int/wahis_2/public/wahid php/Reviewreport/Review?reportid=24033 (available on 11/01/2021) OIE, 2017e “Tilapia Lake Virus Disease, Malaysia”, Immediate Notification Retrieved from https://www.oie.int/wahis_2/public/wahid php/Reviewreport/Review?page_refer=MapF ullEventReport&reportid=24809 (available on 11/01/2021) OIE, 2017f “Tilapia Lake Virus Disease, Thailand”, Immediate Notification Retrieved from https:// www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/ Reviewreport/Review?page_refer=MapEve ntSummary&reportid=23832 (available on 11/01/2021) OIE, 2018 “Tilapia Lake Virus, Peru”, Immediate Notification Retrieved from https://www.oie int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/ Review?page_refer=MapFullEventReport&repo rtid=26027 (available on 11/01/2021) Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., & Surachetpong, W., 2019 “Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay”, Aquaculture, 507, tr.35–39 Surachetpong, W., Janetanakit, T., Nonthabenjawan, N., Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., & Amonsin, A., 2017 “Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016”, Emerging Infectious Diseases, 23(6), tr.1031–1033 Taengphu, S., Sangsuriya, P., Phiwsaiya, K., Debnath, P P., Delamare-Deboutteville, J., Mohan, C V., Dong, H.T & Senapin, S., 2020 “Genetic diversity of tilapia lake virus genome segment TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II from 2011 to 2019 and a newly validated seminested RT-PCR method”, Aquaculture, 526, tr.735423 Tattiyapong, P., Dachavichitlead, W., & Surachetpong, W., 2017 “Experimental infection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and red tilapia (Oreochromis spp.)”, Veterinary Microbiology, 207, tr.170–177 Thangaraj, R S., Ravi, C., Kumar, R., Dharmaratnam, A., Valaparambil Saidmuhammed, B., Pradhan, P K., & Sood, N., 2018 “Derivation of two tilapia (Oreochromis niloticus) cell lines for efficient propagation of Tilapia Lake Virus (TiLV)”, Aquaculture, 492, tr.206–214 Waiyamitra, P., Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Mongkolsuk, S., Nicholson, P., & Surachetpong, W., 2018 “A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia”, Aquaculture, 497, tr.184–188 Yin, J., Wang, Q., Wang, Y., Li, Y., Zeng, W., Wu, J., Ren, Y., Tang, Y., Gao, C., Hu, H & Bergmann, S M., 2019 “Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus”, Journal of Fish Diseases, 42(6), tr.817–824 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 59 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II MODIFIED SEMI-NESTED RT-PCR DETECTING TILAPIA LAKE VIRUS (TiLV) AND INITIAL ISOLATION OF TiLV VIRUS FROM VIETNAMESE TILAPIA Ngo Huynh Phuong Thao1*, Tran Hanh Triet1, Nguyen Hoang Thuy Vy1, Le Thi Thu Thao1, Bui Nguyen Chi Hieu1, Tran Thi Thanh Huong1, Nguyen Hoang Chi Mai2, Le Hoang The Huy3, Tran Nhut Linh4 ABSTRACT Tilapia Lake virus has been recently identified both in natural and cultured tilapia This research is one of the first studies on TiLV isolates from Vietnam During 2019-2020, 51 diseased tilapia samples were collected in Ho Chi Minh city and Vinh Long Semi-nested RT-PCR confirmed only 02 out of them (3.9%) as TiLV-positive Culturing these two TiLV-positive tissues (VL160 and VL167) on E-11 cell line provided good cytopathic effects However, these virus samples did not propagate in the second and third passage; thus, requiring an optimized procedure of subculturing TiLV Besides, the current study also modified the available semi-nested RT-PCR for detecting TiLV to obtain a better amplification efficacy by replacing the specific primers with Random hexamer/ OligodT in the reaction of cDNA synthesis Although the sensitivity and specificity of this modified semi-nested RT-PCR needs further investigations on various RNA dilutions, this modified protocol could be applied in diagnostic labs for better results of TiLV detection Keywords: Tilapia Lake virus, tilapia, semi-nested RT-PCR, E-11 cell line Người phản biện: TS Nguyễn Ngọc Phước Người phản biện: TS Lê Hồng Phước Ngày nhận bài: 16/11/2020 Ngày nhận bài: 16/11/2020 Ngày thông qua phản biện: 20/12/2020 Ngày thông qua phản biện: 05/12/2020 Ngày duyệt đăng: 25/12/2020 Ngày duyệt đăng: 25/12/2020 Biotechnology Center of Ho Chi Minh City University of Science, Vietnam National University Ho Chi Minh City Nguyen Tat Thanh University International University, Vietnam National University Ho Chi Minh City * Email: nhpthao.snn@tphcm.gov.vn; tilv.bc2@gmail.com 60 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 ... gây cá rô phi Quy trình semi – nested RT-PCR phát TiLV mẫu cá bệnh dựa theo công bố Dong et al (2017) Quy trình dựa vào đoạn trình tự số gen TiLV đơn vị thuộc Cục thú y Việt Nam ứng dụng chẩn. .. dụng vào trình tổng hợp cDNA phản ứng seminested RT-PCR chẩn đoán TiLV so sánh hiệu khuếch đại quy trình với Ngồi ra, chưa có nghiên cứu nuôi cấy chủng TiLV phân lập từ cá rơ phi ni Việt Nam Do... Mẫu cá rơ phi dương tính với TiLV (TiLVRIA2) cung cấp Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Mẫu mô phân lập từ trại cá rô phi Tp HCM bảo quản cồn 96o 2.2 Quy trình semi-nested RT-PCR chẩn đốn TiLV