Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú

Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU

TÔM SÚ (Penaeus monodon)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN NAM

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000***

TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU

TÔM SÚ (Penaeus monodon)

Luận văn kỹ sư

Chuyên ngành: công nghệ sinh học

Giáo viên hướng dẫn : Sinh viên thực hiện :

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007

ISOLATION, PURIFICATION AND CHARTERIZATION OF PROTEASE FROM THE HEPATOPANCREAS

AND HEADS OF BLACK TIGER SHRIMP

(Penaeus monodon)

Graduation thesis Major : Biotechnology

HCMC, 08/2007

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh

Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, cung cấp nhiều kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tại viện

Cô Nguyễn Lệ Hà, người đã tận tình hướng dẫn giải đáp những thắc mắc của tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Thầy Bùi Minh Trí và các anh chị cán bộ nghiên cứu của Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh đã hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi thực tập nghiên cứu đề tài tại trung tâm

Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K29 đã động viên, chia sẽ kinh nghiệm buồn vui trong suốt thời gian học tập bên nhau và cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu đề tài

Các bạn thực tập cùng phòng tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã giúp đỡ rất nhiều trong quá trình nghiên cứu đề tài

Con cảm ơn cha me, những người thân đã trang bị tinh thần lẫn vật chất và là hành trang cho con bước vào đời

Tháng 08 năm 2007 Nguyễn Văn Nam

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Nguyễn Văn Nam, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 08/2007

“TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI

TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon)”

Hội đồng giáo viên hướng dẫn:

 PGS-TS Nguyễn Tiến Thắng  Ths Nguyễn Lệ Hà

Để hiểu biết về tính chất và sự biến đổi của hệ protease nhằm có những biện pháp bảo quản hữu hiệu trong chế biến nguyên liệu tôm sau khi thu hoạch và tận dụng triệt để nguồn phế phụ phẩm của tôm để thu chế phẩm protease

Đề tài tiến hành khảo sát khả năng tách chiết protease từ mẫu đầu và nội tạng tôm của dung môi: nước cất, nước muối sinh lý, đệm phosphate và Tris-HCl với các tỷ lệ khác nhau Chọn ra dung môi với tỷ lệ chiết thích hợp thu DC; Khảo sát khả năng tủa của các tác nhân: cồn ethylic, acetone và muối sulfate amon với các nồng độ (tỷ lệ) khác nhau Chọn tác nhân tủa với nồng độ (tỷ lệ) thích hợp tủa DC thu CPT; Khảo sát các tính chất tối ưu cho hoạt động protease CPT của mẫu nội tạng từ tác nhân tủa tốt nhất; Tinh sạch protease CPT của các tác nhân tủa với nồng độ thích hợp từ mẫu nội tạng và mẫu đầu tôm bằng sắc ký lọc gel áp suất thấp, Bio-Gel P 100 Xác định trọng lượng phân tử protease sau tinh sạch bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE

Kết quả thí nghiệm: dung môi tách chiết HCl với tỷ lệ mẫu/dd HCl =1/7 (w/v); Tác nhân tủa cồn với tỷ lệ DC/dd cồn = 1/6 (v/v); Protease CPT tủa cồn của mẫu nội tạng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 47oC, pH 7,0, nồng độ muối ăn 3% Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy enzyme sau tinh sạch có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng từ 37.775 Da đến 69.257 Da

Tris-MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN IV

TÓM TẮT KHÓA LUẬN V DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT IX DANH SÁCH CÁC BẢNG X DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ XI

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1.ĐẶTVẤNĐỀ 1

1.2.MỤCĐÍCHVÀNỘIDUNGNGHIÊNCỨUCỦAĐỀTÀI 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1.KHÁIQUÁTCHUNGVỀENZYME 3

2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme 3

2.1.2 Định nghĩa về enzyme 4

2.1.3 Cấu tạo phân tử 4

2.1.4 Danh pháp quốc tế và phân loại 6

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme 6

2.2.KHÁIQUÁTPROTEASEVÀ PROTEASECỦATÔM 8

2.2.1 Giới thiệu về tôm 8

2.2.2 Khái quát protease 10

2.2.2.1 Định nghĩa protease 10

2.2.2.2 Protease của tôm 11

2.2.2.3 Tình hình nghiên cứu protease trong nước và ngoài nước 12

a) Nghiên cứu trong nước 12

b) Nghiên cứu ngoài nước 13

2.3.3.2 Chọn lựa và chuẩn bị gel 20

a) Chọn lựa gel 20

b) Chuẩn bị gel và bảo quản 20

2.3.3.5 Ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel 22

a) Ưu điểm 22

b) Nhược điểm 22

2.4.XÁCĐỊNHTRỌNGLƯỢNGPHÂNTỬBẰNGĐIỆNDISDS-PAGE 22

2.5.PHƯƠNGPHÁPXÁCĐỊNHKHẢNĂNGXÚCTÁCCỦAENZYME 24

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1.THỜIGIANVÀĐỊAĐIỂM 27

3.2.VẬTLIỆU,HÓACHẤTVÀDỤNGCỤNGHIÊNCỨU 27

3.2.1 Vật liệu 27

3.2.2 Hóa chất 28

3.2.3 Thiết bị 28

3.3.CÁCPHƯƠNGPHÁPPHÂNTÍCHĐÃÁPDỤNG 29

3.4.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 29

3.4.1 Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú 29

3.4.2 Thu nhận chế phẩm protease 29

3.4.3 Bố trí thí nghiệm 30

3.4.3.1 Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tôm sú thích hợp 31

3.4.3.2 Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC 32

3.4.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của CPT 33

a) Nhiệt độ 33

b) pH 33

c) Nồng độ muối ăn 34

3.4.4 Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel 35

3.4.5 Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 35

3.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 35

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1.XÁCĐỊNHDUNGMÔIVÀTỶLỆCHIẾTTÁCHENZYME 36

4.1.1 Khả năng tách chiết protease của nước cất ở các tỷ lệ khác nhau 36

4.1.2 Khả năng tách chiết protease của nước muối sinh lý ở các tỷ lệ khác nhau 38

4.1.3 Khả năng tách chiết protease của đệm phosphate pH 7,0 ở các tỷ lệ khác nhau 39

4.1.4 Khả năng tách chiết protease của đệm Tris-HCl pH 7,5 ở các tỷ lệ khác nhau 41

4.1.5 Lựa chọn dung môi tách chiết protein-enzyme thích hợp 42

4.2.XÁCĐỊNHTÁCNHÂNTỦATHUHỒICHẾPHẨMTỪDC 44

4.2.1 Khả năng tủa protease của cồn ở các tỷ lệ khác nhau 44

4.2.2 Khả năng tủa protease của acetone ở các nồng độ khác nhau 46

4.2.3 Khả năng tủa protease của (NH4)2SO4 ở các nồng độ muối bão hòa khác nhau 47

4.2.4 So sánh khả năng tủa thu CPT của các tác nhân 49

4.3.KHẢOSÁTMỘTSỐYẾUTỐẢNHHƯỞNGĐẾNHOẠTTÍNHPROTEASECỦACPT 51

4.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme proease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú 51

4.3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú 52

4.3.3 Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú 53

4.4.TINHSẠCHPROTEASECPTBẰNG SẮCKÝLỌCGEL 55

4.5.XÁCĐỊNHTRỌNGLƯỢNGPHÂNTỬ-ĐIỆNDISDS–PAGE 59

1 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford 1

2 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Amano 3

3 Phương pháp sắc ký lọc gel 7

4 Điện di SDS-PAGE 9

a) Chuẩn bị hộp điện di 9

b) Chuẩn bị mẫu protein 10

c) Đưa mẫu vào các giếng 10

Phụ lục chương 4 80

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

NT: nội tạng DC: dịch chiết CPT: chế phẩm thô TN: thí nghiệm ĐC: đối chứng

HT: hoạt tính HTR: hoạt tính riêng HL: hàm lƣợng MW: molecular weight OD: optical density

SDS: sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine

UV: ultra viole

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Nội dung các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme 24 Bảng 4.5 Hàm lượng protein và hoạt tính protease từ DC của các dung môi của mẫu nội tạng và đầu 42 Bảng 4.9 Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm lượng

protease của CPT 49 Bảng 4.14 Hoạt tính riênng, độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch của enyzme

protease sau sắc ký lọc gel 58 Bảng 4.16 Trọng lượng phân tử protein mẫu nội tạng chạy điện di SDS-PAGE 62 Bảng 4.17 Trọng lượng phân tử protein mẫu đầu chạy điện di SDS-PAGE 62

DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 2.1 Tôm sú 9

Hình 2.2 Công thức cấu tạo protease 10

Hình 2.3 Nguyên tắc hoạt động của sắc ký 17

Hình 2.4 Tách các phân tử bằng lọc gel 18

Hình 2.5 Sắc ký lọc gel loại muối 21

Hình 2.6 Công thức cấu tạo chất màu Coomassie 26

Hình 3.1 Mẫu nội tạng và đầu tôm sú 27

Hình 4.1 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa cồn từ DC mẫu nội tạng 55

Hình 4.2 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa cồn từ DC mẫu đầu tôm 55

Hình 4.3 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P100 của CPT tủa acetone từ DC mẫu nội tạng 56

Hình 4.4 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P100 của CPT tủa acetone từ DC mẫu đầu tôm 56

Hình 4.5 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa muối (NH4)2SO4 từ DC mẫu nội tạng 57

Hình 4.6 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa muối (NH4)2SO4 từ DC mẫu đầu 57

Hình 4.7 Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu nội tạng 60

Hình 4.8 Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu đầu 60

Đồ Thị Đồ thị 4.1 Ảnh hưởng tỷ lệ (NT/nước cất) đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của DC nội tạng 36

Đồ thị 4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ (đầu /nước cất) đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của DC đầu tôm sú 37

Đồ thị 4.3 Ảnh hưởng tỷ lệ (NT/nước muối sinh lý) đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của DC nội tạng 38

Đồ thị 4.4 Ảnh hưởng tỷ lệ (đầu/nước muối sinh lý) đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của DC đầu 38

Đồ thị 4.5 Ảnh hưởng tỷ lệ (NT/đệm phosphate) đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của DC nội tạng 39

Đồ thị 4.6 Ảnh hưởng tỷ lệ (đầu/đệm phosphate) đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của DC đầu 40

Đồ thị 4.7 Ảnh hưởng tỷ lệ (NT/đệm Tris-HCl) đến hoạt tính protease và

hàm lượng protein của DC nội tạng 41

Đồ thị 4.8 Ảnh hưởng tỷ lệ (đầu/đệm Tris-HCl) đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của DC đầu 41

Đồ thị 4.9 Ảnh hưởng loại dung môi chiết đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của DC nội tạng 43

Đồ thị 4.10 Ảnh hưởng loại dung môi chiết đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của DC đầu 43

Đồ thị 4.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ (DC NT/cồn) đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của CPT 45

Đồ thị 4.12 Ảnh hưởng của tỷ lệ (DC đầu/cồn) đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của CPT 45

Đồ thị 4.13 Ảnh hưởng nồng độ acetone đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của CPT từ mẫu nội tạng 46

Đồ thị 4.14 Ảnh hưởng nồng độ acetone đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của CPT từ mẫu đầu 47

Đồ thị 4.15 Ảnh hưởng nồng độ phần trăm muối (NH4)2SO4 bão hòa đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của CPT từ mẫu nội tạng 48

Đồ thị 4.16 Ảnh hưởng nồng độ phần trăm muối (NH4)2SO4 bão hòa đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của CPT từ mẫu đầu 48

Đồ thị 4.17 Ảnh hưởng của các tác nhân đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của CPT từ DC mẫu nội tạng 49

Đồ thị 4.17 Ảnh hưởng của các tác nhân đến hoạt tính protease và hàm lượng protein của CPT từ DC mẫu đầu 50

Đồ thị 4.19 Yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính protease của CPT 51

Đồ thị 4.20 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease của CPT 53

Đồ thị 4.21 Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT 54

Đồ thị 4.22 Ảnh hưởng của quá trình tinh sạch sắc ký lọc gel đến HTR của enzyme 58

Đồ thị 4.23 Sự tương quan giữa giá trị Rf và Lg (trọng lượng phân tử) 61

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ 20 đến nay Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại lợi nhuận lớn cho nhiều nước, sản lượng và kim ngạch mua bán các chế phẩm enzyme trên thị trường thế gới tăng 20-30% mỗi năm Việt Nam là nước có nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzyme Trong đó protease là enzyme thủy phân có giá trị thương mại rất lớn Nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, mỹ phẩm đặc biệt trong y học hiện đại Chính vì thế đã có nhiều nghiên cứu tách chiết thu nhận protease từ nhiều nguồn gốc khác nhau: động vật, thực vật, vi sinh vât Gần đây, do những nhu cầu về vệ sinh, an toàn thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt, chi phí cho kiểm tra chất lượng và do đó, chế phẩm protease từ vi sinh vật ngày càng cao Trong khi đó, chế phẩm protease thu nhận từ thực vật và mô động vật luôn được coi là tuyệt đối an toàn nên ngày càng thu hút được sự quan tâm của các phòng thí nghiệm cũng như các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thương mại

Tôm là loại động vật thuỷ sinh đang đứng đầu trong ngành nuôi trồng thuỷ sản Với mức đóng góp 70 - 80% giá trị tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản nên hiện nay tôm là mặt hàng chế biến xuất khẩu chủ lực của ngành, chủ yếu là tôm đông lạnh Tôm là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao (chứa 21,04% protein – nghiên cứu của Nguyễn Việt Dũng về tôm sú) nên nó là mặt hàng rất được ưa chuộng trên thị trường quốc tế Tôm dùng cho chế biến được cung cấp từ hai nguồn: đánh bắt và nuôi trồng, trong đó nguồn tôm nuôi đang chiếm ưu thế và nuôi tôm ở Việt Nam trong những năm gần đây đã trở thành ngành kinh tế quan trọng Các sản phẩm chế biến tôm chủ yếu là tôm bỏ vỏ, bỏ đầu, tôm bỏ đầu bóc vỏ còn đuôi, tôm

thịt xẻ lưng … Trong quá trình gia công chế biến tôm thường loại ra các phế phụ phẩm như nội tạng, đầu và vỏ tôm Phế phụ phẩm này của tôm là nguồn thu nhận protease cao, mang lại lợi nhuận lớn cho công nghiệp sản xuất enzyme

Để hiểu về tính chất và sự biến đổi của hệ protease nhằm có biện pháp hữu hiệu trong bảo quản, chế biến nguyên liệu tôm sau khi thu hoạch và tận dụng triệt để nguồn phế phụ phẩm của tôm cho việc thu nhận protease chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú”

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Mục đích chung của đề tài là tách chiết và tinh sạch protease từ nội tạng và đầu của tôm sú cũng như tính chất của nó Để đạt điều này, đề tài tập trung vào các nội dung cụ thể sau:

 Xác định quy trình tách chiết protease từ nội tạng và đầu của tôm sú Xác định tỷ lệ dung môi tách chiết protease thích hợp

Xác định loại dung môi tách chiết protease thích hợp Xác định nồng độ tác nhân tủa thu hồi protein

Xác định tác nhân tủa thu hồi protein

 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động protease của chế phẩm enzyme

Khảo sát hoạt tính theo pH Khảo sát hoạt tính theo nhiệt độ Xác định độ bền của protease

 Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel

 Xác định trọng lượng phân tử của protease bằng điện di protein

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME

2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme

Khi con người chưa có khái niệm về enzyme là gì nhưng con người đã biết sử dụng nó trong chế biến bảo quản thực phẩm lên men cổ truyền Khoảng 5.000 năm trước công nguyên ở Jerico, người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì, nấu rượu vang, sản xuất dấm, tương chao,… ở các mức độ khác nhau, là những quá trình sinh học xưa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại

Những mốc thời gian quan trọng trong nghiên cứu và phát triển môn enzyme học Năm 1833, Payen và Persoz tách được diatase từ malt

Năm 1874, Hansen là người đầu tiên tách được renet từ bao tử cừu

Năm 1876, Kihne là người đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là enzyme

Năm 1897, hai anh em Buchner chứng minh dịch từ nấm men có thể chuyển hóa đường glucose thành cồn và CO2

Năm 1913, Rohm là người đầu tiên sử dụng enzyme trong chất tẩy rửa

Năm 1917, Boidin và Effront nghiên cứu α.amylase của B.Subtilis và ứng

dụng trong ngành dệt

Năm 1920-1928, Will Slitter tinh sạch được enzyme

Năm 1926, Samner kết tinh được urease; Northrop kết tinh được protease Năm 1928, Fleming phát hiện ra penicilline

Từ thế chiến thứ hai, bắt đầu sản xuất kháng sinh theo quy mô công nghiệp, sử dụng amyloglusosidase đường hóa tinh bột Sử dụng penicillineacylase trong sản xuất penicilline

Năm 1972, Boyer và các cộng sự đưa ra kỹ thuật di truyền Kỹ thuật này có tác động tích cực cho công nghệ enzyme

Năm 1984, Nito xác lập quá trình cơ bản tạo acry-lamide và một loạt các quá trình sản xuất có sự tham gia của enzyme

2.1.2 Định nghĩa về enzyme

Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hoá cao có vai trò và chức năng sinh học quan trọng bậc nhất đối với tế bào và cơ thể sống Enzyme có khả năng xúc tác với tốc độ đặc hiệu cơ chất vô cùng hoàn hảo, xúc tác đặc hiệu các phản ứng hoá học ở điều kiện bình thường mà các chất xúc tác hoá học khác không thể thực hiện nổi Enzyme tham gia xúc tác tất cả các phản ứng biến đổi trong tế bào và cơ thể sống Trong đó nhiều enzyme đóng vai trò điều hoà chủ đạo trong việc điều khiển sự phối hợp nhịp nhàng các phản ứng của quá trình trao đổi chất

Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hoá học rất khó xảy ra trong các điều kiện bình thường ở ngoài cơ thể (để tiến hành cần có nhiệt độ cao, áp suất cao, môi trường acid mạnh hay kiềm mạnh ) nhưng trong cơ thể, nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức “êm dịu nhẹ nhàng” nhiệt độ 37oC, áp suất thường, môi trường trung tính, ở nồng độ cao…

Cơ thể thiếu enzyme thì mọi quá trình chuyển hoá sẽ đình trệ, các hoạt động sống, sinh sản, phát triển của của cơ thể sống không được bình thường

Tóm lại: enzyme là protein xúc tác sinh học, do tế bào sống sản xuất ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hoá sinh, mà sau phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác

2.1.3 Cấu tạo phân tử

Enzyme có khả năng và hiệu lực xúc tác rất lớn ở nhiệt độ thường và có tính đặc hiệu rất cao cho nên cấu tạo phân tử của enzyme rất tinh vi và phức tạp Enzyme có bản chất protein, phân tử lượng lớn thường là 10.000 đến 1.000.000 Datol

Ví dụ phân tử lượng của ribonuclease là 12.000 Da, glutamt dehydrogenase là 1.000.000 Da, urease là 483.000 Da; đa số enzyem có hình dạng phân tử thuộc loại protein hình cầu Có loại enzyme đơn nguyên nhưng cũng có loại enzyme đa nguyên do nhiều đơn vị nhỏ tạo nên, mỗi đơn vị nhỏ là một chuỗi poplypeptit Dung dịch enzyme có tính chất dung dịch keo Enzyme không bền với nhiệt, ở nhiệt độ cao enzyme mất hoạt tính xúc tác Các yếu tố gây biến tính protein như acid hay kiềm, muối kim loại nặng làm cho enzyme mất hoạt tính

 Thành phần cấu tạo của enzyme

Enzyme có thể chia hai loại theo cấu tạo hoá học: Enzyme đơn giản và enzyme phức tạp Loại đơn giản chỉ là những phân tử protein đơn thuần, sản phẩm thuỷ phân chỉ gồm các acid amin Enzyme phức tạp ngoài phần protein còn có phần khác không phải protein apoenzyme thể hiện tính chất cơ bản của enzyme và tính đặc hiệu của nó Phần không phải protein được gọi là coenzyme, còn gọi là nhóm ngoại thường có chứa vitamin, phần này chung cho nhiều enzyme, trong quá trình xúc tác thì biến đổi Trong thành phần cấu tạo của nhiều enzyme có chứa kim loại

 Trung tâm hoạt động của enzyme

Mỗi hoạt động xúc tác của enzyme đều thông qua bộ phận đặc biệt của phân tử enzyme gọi là trung tâm hoạt động của enzyme Trung tâm này gồm những nhóm hoá học, những liên kết peptit tiếp xúc trực tiếp với cơ chất Một phần hoặc toàn bộ phân tử enzyme được coi là có khung cấu trúc thích hợp để duy trì hình dạng cần thiết đối với tính chất đặc hiệu và hiệu lực xúc tác Do vậy khi làm thay đổi hình dạng của chúng dẫn đến khả năng xúc tác bị thay đổi Trung tâm hoạt động của enzyme thường bao gồm những acid amin có nhóm hoá học có hoạt tính cao như serin (-OH), histidin (vòng inmidozol), cytein (-SH), lysin (-NH3), tryptophan (indol), glutamic (-COOH) Các gốc acid amin tạo nên trung tâm hoạt động không nhất thiết sắp xếp ở cạnh nhau trong cấu trúc bậc 1 nhưng gần nhau trong cấu trúc bậc 2, 3 và 4

2.1.4 Danh pháp quốc tế và phân loại

 Danh pháp: theo quy ước quốc tế, tên gọi của enzyme thường được gọi theo cơ chất đặc hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia Theo đó, tên một enzyme thường có hai phần

Phần đầu là tên cơ chất Trong trường hợp phản ứng đó là phản ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là tên gọi của hai cơ chất viết cách nhau hai chấm

Phần sau chỉ khái quát bản thân của phản ứng

Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme vì thói quen nên vẫn được gọi theo tên cũ, không theo hệ thống phân loại Ví dụ như trypsin, chimotrypsin, pepsin…

 Phân loại

Hội nghị sinh hoá quốc tế lần thứ V (1962) chia enzyme làm 6 loại ký hiệu E.C 1 Oxydoreductase là men Oxy hoá khử

2 Transferase Vận chuyển nhóm 3 Hydrolase Thuỷ phân

4 Lyase Phân cắt 5 Isomerase Đồng phân 6 Ligase Tổng hợp

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme

 Nồng độ cơ chất

Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc nồng độ cơ chất Nồng độ cơ chất tăng độ phản ứng xúc tác của enzyme tăng, nhưng khi nồng độ cơ chất tăng đến mức cao thì tốc độ phản ứng đạt đến cực đại không tăng nữa Thời điểm này enzyme bão hoà cơ chất

 Nồng độ enzyme

Tốc độ phản ứng xúc tác bởi enzyme tỷ lệ thuận với hàm lượng enzyme nhưng khi tăng cao nồng độ enzyme thì tốc độ cũng không tăng nữa do các sản phẩm được tạo ra nhiều sẽ tác dụng vào vị trí dị lập thể của enzyme làm cho phản ứng đạt ở mức độ bão hoà

 Tác dụng của nhiệt độ

Nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ của phản ứng enzyme lên đến tốc độ cực đại đến chừng nào enzyme chưa bị biến tính, mỗi khi tăng nhiệt độ lên 10oC tốc độ phản ứng sẽ tăng lên khoảng 2 lần Khi nhiệt độ tăng đến khoảng 60 – 70oC thì phần lớn các enzyme mất hẳn hoạt tính và nhiệt độ đó gọi là nhiệt độ tới hạn

Mỗi enzyme yêu cầu một nhiệt độ xúc tác tối ưu riêng ở nhiệt độ này enzyme đạt tốc độ cao nhất Nhìn chung nhiệt độ thích hợp của enzyme gần với nhiệt độ của cơ thể vào khoảng 40oC Ở các vi sinh vật chịu nhiệt độ cao, enzyme của chúng có nhiệt độ thích hợp, ví dụ amylase động vật có nhiệt độ cao, enzyme ứng dụng khoảng 45 – 50oC nhưng - amylase của vi sinh vật chịu nhiệt có nhiệt độ thích hợp là 70oC, đối với các enzyme của các vi sinh vật cảm ứng sống trong các suối nước nóng thì nhiệt độ thích hợp vào khoảng gần nhiệt độ sôi của nước Nhiều enzyme thực vật có nhiệt độ thích hợp khá cao như papain ở 800C vẫn còn khả năng hoạt động

 Tác dụng của pH

Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường; nó ảnh hưởng rất lớn đối với tốc độ của phản ứng enzyme Mỗi enzyme có một giá trị pH cho hoạt động của mình Rất nhiều enzyme có pH thích hợp ở vùng trung tính nhưng có enzyme hoạt động tốt ở vùng acid hay ở vùng kiềm pH ảnh hưởng đối với các phản ứng của enzyme do nhiều tác dụng rất khác nhau do pH tác dụng vào trạng thái ion hoá của phân tử enzyme nhất là do các nhóm hoạt động của enzyme, vào trạng thái ion hoá của cơ chất, vào độ bền vững của phân tử enzyme và ảnh hưởng đến sự kết hợp giữa phần protein và phần phụ không phải protein Đối với enzyme có những nhóm hoạt động đặc biệt có thể tồn tại dưới nhiều dạng ion khác nhau và thường chỉ ở một trạng thái có tác dụng xúc tác pH có tác dụng quyết định đối với trạng thái ion hoá của phân tử enzyme nói chung và các nhóm hoạt động của enzyme nói riêng, nên ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

 Tác dụng của ion kim loại

Sự có mặt hay vắng mặt ion kim loại không thể hiện rõ đối với một số enzyme nhưng nhiều enzyme chịu ảnh hưởng sâu sắc đến nồng độ và bản chất của ion kim loại Có một số ion kim loại hầu như tuyệt đối cần thiết cho sự hoạt động một số enzyme; nhưng cũng có những ion kim loại như Ag+, Hg+, Pb+ có độc tính cao với hầu hết các enzyme Một số ion kim loại ức chế enzyme này nhưng hoạt hóa enzyme kia Có những ion kim loại ức chế một enzyme ở nồng độ này nhưng lại hoạt hoá chính enzyme đó ở nồng độ khác Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn tác dụng với cả trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzyme

 Tác dụng của chất hoạt hoá

Chất hoạt hoá có khả năng làm tăng tác dụng xúc tác của enzyme Chất hoạt hóa thường có bản chất rất khác nhau Ví dụ các amino nhóm halogen như Cl-, Br-, I- có tác dụng hoạt hoá - amylase Glutathion có tác dụng hoạt hoá nhiều protease thực vật, một số enzyme oxy hoá khử có nhóm hoạt động – SH Cystein là acid amin hoạt hoá nhiều men có nhóm – SH hoạt động Tác dụng hoạt hoá của glutathion, cystein là do khả năng khử liên kết disulfur của phân tử enzyme Các enzyme nhóm – SH hoạt động thường chỉ hoạt động được khi các nhóm này ở dạng khử Nhiều ion kim loại cũng có tác dụng hoạt hoá enzyme

 Chất ức chế

Là những chất làm giảm tốc độ xúc tác của enzyme Chất ức chế có thể gây ra quá trình ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh và ức chế trên phức hợp enzyme cơ chất

2.2 KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA TÔM

2.2.1 Giới thiệu về tôm

Tôm sú còn gọi là tôm cỏ, tôm nương, tôm sú rằn, thuộc lớp giáp xác, bộ

mười chân, họ tôm he, giống tôm he, loài tôm sú, có tên khoa học là Penaeus monodon, tên thương mại là Black Tiger Shrimp Tôm sú được đánh bắt và nuôi

trồng hàng đầu thế giới Theo thống kê của tổ chức Lương thực Nông nghiệp thế giới (Food Agriculture Organization - FAO), sản lượng tôm sú năm 1997 chiếm

52% sản lượng tôm nuôi trồng toàn thế giới, với tốc độ tăng trưởng trung bình 2%/năm Trong các vùng nuôi tôm chủ yếu trên thế giới, Ðông Nam Á là vùng dẫn đầu chiếm 53,7% tổng sản lượng tôm toàn thế giới trong tổng số 54 quốc gia có ngành công nghiệp nuôi tôm phát triển (thống kê của FAO năm 1997)

Tôm càng xanh (Giant fresh water prawn)

Nuôi tôm đã phát triển mạnh trong những năm gần đây, trở thành ngành kinh tế quan trọng Năm 2002, giá trị xuất khẩu thủy sản đạt hơn 2 tỷ USD, trong đó xuất khẩu tôm đông lạnh chiếm 47% Năm 2004, xuất khẩu thủy sản đạt giá trị 2,4 tỷ USD, chiếm 8,9% tổng giá trị xuất khẩu cả nước trong đó tôm đông lạnh chiếm 53% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản Hiện nay, tôm sú vẫn là đối tượng chủ lực, thu hút sự chú ý lớn của người dân và chính quyền và cung cấp trong chuyển dịch cơ cấu kinh tế ven biển

2.2.2 Khái quát protease 2.2.2.1 Định nghĩa protease

Protease là những esterase thủy phân protein, chúng xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và cắt liên kết peptid giữa các L-acid amin thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton Và chúng thường tác động lên các liên kết ester đơn giản

Hình 2.2 Công thức cấu tạo protease

 Dựa vào sự phân bố có thể chia protease làm hai nhóm Protease nội bào

Protease ngoại bào

 Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất

Endopeptidase: enzyme thủy phân peptid ở giữa mạch

Exopeptidase: enzyme phân cắt các liên kết peptid ở đầu mạch  Dựa vào pH hoạt động

Protease acid tính Protease kiềm tính Protease trung tính

 Dựa vào nguồn thu nhận enzyme Protease động vật

Protease thực vật Protease vi sinh vật

 Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme

Serine protease (OH): trypsine, chymotrypsine, substilopeptidase, milk alkaline protease (MAP), Thrombin…

Thiol protease (SH): papain, bromeline… Aspartic protease (COOH): pepsin, renin…

Metallo protease: carboxylpeptidase A, collagenase (cần trung tâm hoạt động là Zn2+ hoặc Mg2+)

2.2.2.2 Protease của tôm

Sự tiêu hoá và trao đổi chất protein và các hợp chất nitơ khác giữa các loài giáp xác khác nhau rất nhiều Hầu hết, các cơ chế tiêu hoá và hấp thụ khác với động vật có xương sống Các enzyme tiêu hoá, đặc biệt các enzyme tiêu hoá protein ở giáp xác nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serin dạng trypsin và có khả năng hoạt động rất cao Ngoài ra, còn có enzyme chymotrypsin, astacine, collagenase…

Protease của tôm cũng như của các loài động vật thuỷ sinh khác là các protease nội bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó đến nội tạng và cơ thịt Đặc biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác

Có nhiều cách phân loại protease, tuỳ vào khả năng thuỷ phân khác nhau mà các protease có đặc tính khác nhau Nhóm enzyme này có tác dụng thuỷ phân protien, có tính đặc hiệu rộng rãi, chúng không chỉ thuỷ phân liên kết peptid mà còn có thể thuỷ phân các liên kết ester và cũng có thể xúc tác cho chuyển về gốc acid amin Tuy nhiên, mức độ tác dụng khác nhau

Phần lớn các nhóm enzyme thuộc protease của tôm thường có tính chất chung của một enzyme:

Hòa tan được trong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trung tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào những đặc tính này để tách chiết chúng

Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium), ethanol, acetone…để thu nhận chế phẩm enzyme

Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạt hóa hay ức chế

Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: nhiệt độ, pH môi trường

Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu cùng cộng tác viên về protease đầu tôm biển và Th.s Nguyễn Thị Mỹ Trang về protease đầu tôm bạc nghệ cho thấy các enzyme tiêu hoá protein là các enzyme hoạt động mạnh trong môi trường kiềm Theo Nguyễn Việt Dũng thì protease của tôm sú lại thể hiện hoạt tính cao ở môi trường gần trung tính

Khả năng hoạt động của các enzyme tiêu hoá protein khác nhau tuỳ theo loài Chuang (1985) nhận thấy khả năng hoạt động của protease thô được xác định như

khả năng hoạt động phân giải casein ở tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) và tôm đất (Metapenaecus ensis) thấp hơn ở Penaeus pencillatus, Penaeus monodon và Penaeus japonnicus

2.2.2.3 Tình hình nghiên cứu protease trong nước và ngoài nước

a) Nghiên cứu trong nước

Ở nước ta hiện nay, công bố nhiều công trình nghiên cứu protease Chủ yếu là nghiên cứu tách chiết tinh sạch và ứng dụng của enzyme các lĩnh vực công nghê ̣ thực phẩm và mỹ phẩm, dược phẩm

Nguyễn Liêu Ba và Lê Văn Nhương (2001), nghiên cứu thu nhận và tinh

sạch protease kiềm từ dịch nuôi cấy B.brevis B1

Lê Đức Mạnh và các cộng sự (1996) nghiên cứu thu nhận và bảo quản

protease từ chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn Bacillus subtilis

Phan Thị Hồng Hải và các cộng sự (2001), nghiên cứu tinh chế protease từ

sáng lá gan (Fasciolagigatica)

Đỗ Văn Ninh (2004), tối ưu hóa quá trình phân giải protein của protease trong thị cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phân

Vũ Văn Bội (2004), nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng protease

từ Bacillus subtilis S5

b) Nghiên cứu ngoài nước

Corvisat (1857) chiết tách trypsin từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên được thu nhận nhưng chưa tinh sạch

Danivevski (1862) chiết tách trypsin, amylase tụy tạng bằng phương pháp hấp phụ Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong chiết tách và nghiên cứu các tính chất của enzyme cũng như protein Tiếp theo đó là Hommarsten (1872) chiết tách được Chymosin Wurtz (1879) chiết tách được papain, Crassman và Ambros (1926) chiết tách được bromelain…

Theo Salem và các cộng sự (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0.3% enzyme so với cá gồm papain, trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark) Kết quả cho thấy với 0.3% papain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%

Liang và các cộng sự (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trà trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain được tăng lên

Nielsen (2001) nghiên cứu cải tiến phương pháp xác định mức độ thủy phân protein cho kết quả nhanh chóng và chính xác

Stein (2004) sử dụng protease nội sinh thủy phân nội tạng cá tuyết Đại Tây Dương cho hiệu suất thủy phân khá cao

2.2.3 Ứng dụng của protease

Các protease nói chung được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau

 Trong công nghiệp:

Trong sản xuất nước chấm : Nước mắm, tương, chao,…

Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hương vị thịt sau khi chế biến,…

Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,… Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ

Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn Đặc biệt ứng dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải

Trong công nghiệp sữa, các protease như renine, pepsine được dùng trong sản xuất formate, sữa đông tụ

 Trong nông nghiệp :

Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân làm giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm

 Trong mỹ phẩm :

Người ta trộn một lượng nhỏ protease vào kem xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già

Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị tiêu hóa kém…

 Trong kỹ nghệ phim ảnh :

Protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh các nguyên liệu như phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý

2.3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp trích ly enzyme

Emzyme là loại protein được tạo thành trong tế bào, phần lớn chúng tồn tại trong tế bào Các enzyme này thường không có khả năng di chuyển qua màng tế bào Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp Các phương pháp phá vỡ tế bào thường được sử dụng để phá vỡ tế bào như:

Phương pháp cơ học Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa…

Phương pháp vật lý như dùng sóng siêu âm

Phương pháp hóa học như dùng các loại dung môi, butylic, acetone, glycerol, ethylacetate

Quá trình trích ly enzyme từ nội tạng và đầu tôm sú chịu tác động của các yếu tố: tỷ lệ dung môi trích, nhiệt độ, thời gian, pH

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protease

Tỷ lệ dung môi với mẫu: mẫu mô động vật có nhiều thành phần khác nhau, ngoài protein của enzyme và các thành phần enzyme khác đặc biệt là hàm lượng lipit nhiều, ảnh hưởng đến quá trình trích ly, ở tỷ lệ thích hợp sẽ trích ly được những protein - protease ra ngoài mô nhiều hơn

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly, hầu hết protease động vật rất dễ biết tính hay giảm hoạt tính khi tăng nhiệt độ, hay ở nhiệt độ thích

hợp enzyme hoạt động mạnh thủy phân protein lẫn nhau Thường nhiệt độ ly trích protease từ mô động vật ở nhiềt độ không quá 5oC

Thời gian trích ly: đối với protease từ nguồn động vật dễ bị phân hủy vì hoạt tính protease mạnh và có sự hỗ trợ của các enzyme thủy phân khác có trong mô mẫu khi để ở thời gian lâu, hay thời gian ngắn thì quá trình hòa tan của enzyme từ mô tế bào mẫu Chính vì vậy thời gian trích ly enzyme từ mô mẫu cần phụ thuộc loại mô mẫu và dung môi trích

pH là yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme trong quá trình ly trích, có những enzyme acid thì cần phải trích ly ở pH acid thì thu protein của enzyme đó cao hơn, còn enzyme kiềm thì ngược lại

2.3.2 Phương pháp làm sạch enzyme

Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme ta đang cần, người ta thực hiện những phương pháp sau

 Phương pháp gây biến tính chọn lọc

Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn lọc các loại protein tạp Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu acid và bền nhiệt Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-70oC và pH ≤ 5 Ở điều kiện này những enzyme không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến tính Sau đó, bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại bỏ các thành phần không phải là enzyme mà ta mong muốn

 Phương pháp kết tủa phân đoạn

Dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác nhau, thường sử dụng muối (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme Bằng cách này, người ta được một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme Ngoài muối (NH4)2SO4 ra, còn có thể sử dụng một số dung môi hữu cơ như ethanol, acetone để kết tủa protein

 Phương pháp hấp thu chọn lọc

Có thể cho chất hấp thụ trực tiếp vào dung dịch enzyme hoặc cho dung dịch enzyme chảy qua một cột, trong cột có chứa chất hấp thụ Chất hấp thụ được sử dụng rộng rãi như hydrocyapatite Phương pháp này có thể thực hiện một trong hai cách sau: hoặc là hấp thụ enzyme hoặc là hấp thụ protein tạp Để tránh làm biến tính enzyme, thường thực hiện quá trình hấp thụ ở nhiệt độ 0oC Sau khi hấp thụ ta lại tiến hành chiết enzyme bằng các dung môi thích hợp

 Phương pháp sắc ký

Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước và tác nhân trao đổi ion , có thể áp dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography) để làm sạch enzyme Thường sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion sau:

o Nhựa trao đổi ion

o Dẫn suất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose, diethylamino-ethyl-cellulose (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl-cellulose

Dựa vào đặc tính phân cực của protein :

o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography) o Sắc ký giấy

o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography)

o Sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction Chromatography – HIC)

Dựa vào kính thước protein: sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography)

Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand): ắc ký ái lực (Affinity Chromatography)

Hình 2.3 Nguyên tắc hoạt động của sắc ký 2.3.3 Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel

2.3.3.1 Bản chất của phương pháp

Phương pháp được sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lượng phân tử và phân tích định lượng tương tác phân tử

Hình 2.4 Tách các phân tử bằng lọc gel  Một số thông số vật lý của phương pháp

Giới hạn tách (exclution limit): là kích thước của phân tử nhỏ nhất không

chui vào bên trong hạt gel, như vậy tất cả chúng sẽ tách cùng một lượt ra khỏi cột Thí dụ giới hạn tách của G-50 có phạm vi tách từ 1.500-30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn đều không chui vào hạt gel

Phạm vi tách (Fructionation range): Thí dụ sephadex G-50 có phạm vi tách

từ 1.500-30.000 Da

Độ ngậm nước (water regain): Là trọng lượng nước mà 1 gam bột gel khô

hút nước Thí dụ G-50 có độ ngậm nước là 5,0 0,3 g Giá trị này chưa tính đến lượng nước bao quanh hạt Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích của cột

Thể tích nền (bed volume): là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp thu

khi trương nở trong nước G-50 có thể tích nền 9-11 ml/g gel khô

Hạt gel (Gel particle): Hạt gel hình cầu có nhiều lỗ Kích thước hạt xác định

bằng mesh hoặc đường kính hạt (bead diameter) tính theo m Hạt có kích thước lớn (50-100 mesh, 100-300 m cho tố độ dòng chảy qua cột cao, nhưng kết quả tách thấp Ngược lại những hạt mịn (400 mesh, 10-40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt Thường người ta chọn hạt gel có kích thước 100-200 mesh (50-150 m)

Thể tích trống (void volume): Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel

trong cột Xác định nhờ chất màu blue dextran có trọng lượng phân tử 2.000.000 Da

Thể tích thổi (elution volume): là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần

Gel polyacrylamide: Tạo bởi quá trình đồng polymer hoá của acrylamide và N,N’-methylene bisacrylamide (Bio-Rad cung cấp – Biogel –P là tên thương mại)

Gel agarose: Là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ galactose và anhydrogalactose Mạng gel được ổn định nhờ liên kết hydro nhiều hơn là do các liên kết ngang Hãng Bio-Rad cung cấp agarose với tên thương mại là Bio-gel A

Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thương mại là ultragel, nó cho phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng áp suất để tách

2.3.3.2 Chọn lựa và chuẩn bị gel

a) Chọn lựa gel

Chủ yếu người ta sử dụng gel trong 2 trường hợp: Loại bỏ phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ ra khỏi hỗn hợp chứa các đại phân tử (thí dụ là quá trình loại muối (desalting) ra khỏi dịch chứa protein và nucleic acid Cỡ hạt hay sử dụng 100-200 mesh (10-40 m) hay 200-400 mesh (20-80 m) Hạt nhỏ hơn cho kết quả tách tốt hơn, nhưng thời gian thực hiện lại rất dài

b) Chuẩn bị gel và bảo quản

Gel dextran và acrylamide thương mại ở dạng bột không ngậm nước do vậy phải cho chúng ngậm nước (cho nở) trước khi sử dụng Quá trình này thường khoảng 3-4 giờ ở 20 o C đối với loại gel có liên kết nhiều, riêng P-300 và G-200 nên kéo dài thời gian trên tới khoảng 72 giờ (3 ngày đêm) Có thể rút ngắn thời gian nở trong nước ở nhiệt độ cao (có thể đun) Gel agarose và gel polyacrylamide agarose thương mại ở dạng ngậm nước, do vậy không cần cho nở Trước khi nhồi gel mới vào cột phải loại bỏ những hạt siêu mịn bằng cách lắng – nghiêng (2-3 lần là đủ) và loại bọt khí bằng cách vừa khuấy vừa hút khí (bơm nước) trong khoảng 1-2 giờ Sau đó bổ sung chất bảo quản sodium aride (0,02%)

2.3.3.3 Dựng cột và chuẩn bị mẫu

a) Dựng cột lọc gel

Để tách phân đoạn, tốt nhất nên sử dụng cột dài hơn 100 cm có tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng nằm trong khoảng từ 25-100 Để tách nhóm chất chỉ cần sử dụng cột dài khoảng 50 cm với tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng trong khoảng 5-10 Đối với gel dextran và polyacrylamide sử dụng đệm có pH từ 1,0-10,0, trong khi gel agarose chỉ ổn định trong khoảng pH -10,0 và pH chọn lựa phải đảm bảo không làm mất hoạt tính của chất cần tách

b) Chuẩn bị mẫu

Cho mẫu quá nhiều vào cột làm giảm độ phân tách, ít quá làm mẫu bị loãng Để tách nhóm chất có thể cho nhiều mẫu vào cột, tới 10-25% tổng thể tích cột Để phân tích chỉ được phép đưa một lượng mẫu đưa một lượng mẫu nhỏ vào cột 1-5% tổng thể tích cột ( là thể tích nước tương đương chiều cao nền cột đã nhồi)

Tốc độ dòng chảy nền điều chỉnh ở mức thấp hơn một chút so với dòng chảy tự do Thông thường đối với gel có kích thước lỗ nhỏ , nên sử dụng tốc độ 8-12 ml/cm2 mặt cắt ngang (15-25 ml/h), còn đối với gel lỗ lớn 2-5 ml/ cm2 (5-10 ml/h) Dòng chảy có thể theo cách chảy tự do hoặc nhờ bơm nén Phương pháp lọc gel bằng cách cho chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel lỗ nhỏ Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng chảy ổn định, nên phải dùng bơm nén Thông thường là nén theo chiều trong lực, tuy nhiên cũng có tác giả sử dụng cách nén ngược từ dưới lên

2.3.3.4 Một số ứng dụng của phương pháp lọc gel

Hình 2.5 Sắc ký lọc gel loại muối

2.3.3.5 Ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel

a) Ưu điểm

Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác động (cofactor) và các điều kiện môi trường khắc nghiệt

Sự phân tách có thể được thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cường độ ion cao hoặc thấp, ở 370C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm

Kỹ thuật này cho phép thu lại lượng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và dễ dàng khử muối

b) Nhược điểm

Chậm (tốc độ thấp - thời gian dài)

Yêu cầu các cột có kích thước lớn tương đối so với lượng mẫu

Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, thường khó đạt được sản phẩm tinh khiết hoàn toàn Vì lý do này, sắc ký lọc gel thường được sử dụng với những kỹ thuật khác nhau như sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ

2.4 XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE

Sau khi thực hiện các bước ly trích và tinh sạch enzyme bước kế tiếp kiểm tra lại độ tinh sạch protein dựa vào kỹ thuật điện di Kỹ thuật điện di có thể cho ta xác định được trọng lượng phân tử protein mong muốn

Kỹ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein Trong kỹ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT) Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các

protein đều được tích điện âm Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường

Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết

Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel) Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp:

Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên): duỗi thẳng các phân tử protein trong mẫu có cấu trúc bâ ̣c cao về da ̣ng cấu trúc bâ ̣c 1 và các protein này được dồn lại và tạo một lớp băng mỏng

Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới): tạo ra các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu

Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí Kỹ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử từ 10.000 - 200.000 Da Những phân tử protein có trọng lượng lớn hơn 200.000 Da thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2,5%

Ngoài kỹ thuật SDS-PAGE là phương pháp điện di trong điều kiện làm biến tính protein (Denaturing condition), người ta còn dùng một số kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính (Nondenaturing condition) không có sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một số vấn đề về SDS gây ra một số ảnh hưởng đến đặc tính của protein như tạo liên kết (cross- linked) giữa các protein với nhau Một số protein không có sự tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng với những protein khác người ta sử dụng kỹ thuật điện di tập trung điểm đẳng điện (Isoelectric focussing gel electrophoresis)

2.5 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME

Người ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt tính hoạt động của enzyme Người ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt tính hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng

Bảng 2 1 Nội dung các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme

Một số phương pháp xác định hàm lượng protein trong dung dịch với độ nhạy của chúng khác nhau, hoặc do dựa vào sự có mặt của một số amino acid, do thành phần amino acid của protein khác nhau là khác nhau, nên kết quả phân tích sẽ bị ảnh hưởng Có 5 phương pháp xác định hàm lượng protein trong dung dịch, trong đó 3 phương pháp cổ điển, 2 phương pháp hiện đại Trong 5 phương pháp thì 4 phương pháp dựa vào phản ứng hoá học, 1 phương pháp đo quang phổ

Thời gian

3 Thời gian, lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành

Nồng độ enzyme

càng cua của N tham gia liên kết peptide với Cu+2) Hàm lượng của chúng (peptide & protein) tỷ lệ với độ đậm của màu

Người ta thường sử dụng albumine bò (bovine serum albumin) để dựng đường chuẩn và đo ở bước sóng 540 nm, đối chứng là dịch biuret và đệm hoặc nước Có một số tác nhân gây cản trở: đệm chuẩn bị từ amino acid, đệm Good’s, đệm Tris Phương pháp biuret có ưu điểm là cho cùng kết quả ổn định đối với các loại protein khác nhau, dễ dàng thực hiện Nhược điểm chủ yếu là độ nhạy kém (1 mg)

2.5.2 Phương pháp Lowry

Là phương pháp khá nhạy (5 g) Đây là phương pháp tương tự như phương pháp biuret bổ sung thêm chất Folin-ciocalten làm tăng độ màu của dung dịch, như vậy dịch màu xanh dương xuất hiện là do:

- Liên kết càng cua giữa N tạo liên kết peptide với Cu+2

- Sự khử chất Folin-ciocalten do tysosine và tryptophan trong phân tử protein tạo ra

Các bước thực hiện giống như phương pháp biuret, độ nhạy cao hơn 100 lần Tuy nhiên nó bị ảnh hưởng rất mạnh bởi đệm Good’s, NH4)2SO4 (nồng độ >15%), glycine (nồng độ >0,5%) và mercaptan Ngoài ra protein có hàm lượng tysosine và tryptophan khác nhau do vậy kết quả không mấy ổn định

2.5.3 Phương pháp Bradford

Do hạn chế trên người ta đã có cải tiến khắc phục bằng cách sử dụng chất màu liên kết với protein (Bradford, 1976, Biorad, 1984) Chất màu Coomassie gắn với protein trong dung dịch có tính acid sẽ làm thay đổi đỉnh hấp phụ từ bước sóng 465 nm (của Coomassie) lên bước sóng 595 nm liên kết với protein.Thường sử dụng globulin hoặc albumin máu bò làm protein chuẩn Phép đo rất tiện vì chỉ sử dụng một loại chất Màu xuất hiện trong gần 2 phút và ổn định trong gần 1 giờ Độ nhạy của phương pháp cao ( 1-20 g), đôi khi nhạy hơn cả phương pháp Lowry,

phương pháp Bradford cũng cho kết quả khác biệt với các loại protein khác nhau Nó chỉ bị ảnh hưởng bởi triton X-100, sodium dodecyl sulfate

Hình 2.6 Công thức cấu tạo chất màu Coomassie 2.5.4 Phương pháp BCA [Bicinchoninic Acid] (1985)

Phương pháp này tương tự như phương pháp Biuret và Lowry Phân tử protein tương tác với ion Cu+2 tạo ra Cu+1

, ion này sẽ tạo phức với bicinchoninic acid làm thay đổi màu táo xanh của BCA thành màu mận chín đỏ ở bước sóng 562 nm Phương pháp này nhạy tương đương phương pháp Lowry và Bradford Ưu điểm chính của nó là đơn giản và không bị triton và sodium dodecyl sulphate cản trở

2.5.5 Phương pháp đo phổ

Chủ yếu là nhờ sự có mặt của tyrosine và tryptophan nên dịch protein hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 280 nm Tất nhiên là đối với protein có hàm lượng….khác nhau, kết quả hấp thu sẽ không giống nhau Tuy nhiên đây là phương pháp rất nhanh, đơn giản Dịch tế bào chứa nhiều chất cũng hấp thu ở bước sóng này do vậy chúng cũng là tác nhân cản trở phép đo, chủ yếu là nucleic acid Để khắc phục người ta sử dụng tỷ lệ hấp thu A 280/A 260 để xác định hàm lượng protein, công thức thực nghiệm cho phép xác định hàm lượng protein trong dung dịch chứa tới 20% nucleic acid

Phương pháp này có ưu điểm là xác định nhanh, chỉ yêu cầu một lượng mẫu nhỏ, so với phương pháp so màu nó không bị ảnh hưởng bởi phần lớn đệm và (NH4)2SO4 Đặc biệt nó thường được sử dụng để phát hiện các peak chứa protein trong phương pháp sắc ký cột

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM

Thời gian tiến hành đề tài ngày 12/03/2007 đến ngày 20/07/2007 tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới

3.2 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU

3.2.1 Vật liệu

Mẫu đầu và nội tạng tôm sú được phân tách từ tôm sú sống, loại 40 - 50 con/kg được nuôi ở Cần Giờ Tôm được chở trong thùng sục khí về phòng thí nghiệm, rửa sạch và giết chết bằng cách trộn với nước đá vụn, tỷ lệ tôm /đá là 1:3, sau đó tách lấy đầu hoặc nội tạng Đầu và nội tạng được tách riêng 20 cái/bao nylong được bảo quản trong tủ đông sâu -20oC để sử dụng dần trong thí nghiệm, thời gian bảo quản không quá 4 tuần

Hình 3.1 Mẫu nội tạng và đầu tôm sú

3.2.2 Hóa chất

Hóa chất pha đệm Tris-HCl 0,05 M pH 7,5

Hóa chất pha đệm phosphate: muối NaH2PO4.2H2O và muối Na2HPO4.12H2O

Muối sinh lý Cát thạch anh

Hóa chất tủa protein: Cồn 96o, acetone, muối (NH4)2SO4

Hóa chất để xác định hàm lƣợng protein: Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml, thuốc thử Bradford (Coomasie Brilliant Blue, Ethanol tuyệt đối, Acid Phosphoric)

Hóa chất để xác định hoạt tính enzyme: Dung dịch Tyrosine 1mg/ml; HCl 0,1M; Na2CO3 0,4M; dung dịch Trichloacetic acid 0,4M (TCA); thuốc thử Folin; dung dịch đệm phosphate 0,1M; casein dạng bột

Hóa chất dùng trong sắc ký lọc gel Hóa chất dùng trong điện di SDS-PAGE

Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad gồm phễu đổ gel, flow adaptor, vòi hút chân không để khử khí cho dung dịch

Cối inox nghiền mẫu Ống nghiệm