Các protease nói chung đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Trong công nghiệp:
Trong sản xuất nƣớc chấm : Nƣớc mắm, tƣơng, chao,…
Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hƣơng vị thịt sau khi chế biến,…
Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,… Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ.
Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải.
Trong công nghiệp sữa, các protease nhƣ renine, pepsine đƣợc dùng trong sản xuất formate, sữa đông tụ.
Trong nông nghiệp :
Protease đƣợc dùng để sản xuất dịch thủy phân làm giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.
Trong mỹ phẩm :
Ngƣời ta trộn một lƣợng nhỏ protease vào kem xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già.
Trong y học :
Protease đƣợc dùng để sản xuất môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi vi sinh vật, sản xuất huyết thanh miễn dịch.
Sử dụng enzyme collagenase trong điều trị cơ gân, mạch máu… bị sơ cứng
Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch…
Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trƣng.
Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những ngƣời bị tiêu hóa kém…
Trong kỹ nghệ phim ảnh :
Protease từ vi khuẩn đƣợc dùng để tái sinh các nguyên liệu nhƣ phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ tƣơng gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý.
2.3. PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp trích ly enzyme.
Emzyme là loại protein đƣợc tạo thành trong tế bào, phần lớn chúng tồn tại trong tế bào. Các enzyme này thƣờng không có khả năng di chuyển qua màng tế bào. Để thu nhận enzyme nội bào, ngƣời ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phƣơng pháp. Các phƣơng pháp phá vỡ tế bào thƣờng đƣợc sử dụng để phá vỡ tế bào nhƣ:
Phương pháp cơ học. Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền nhƣ bột thủy
tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa…
Phương pháp vật lý nhƣ dùng sóng siêu âm.
Phương pháp hóa học nhƣ dùng các loại dung môi, butylic, acetone,
glycerol, ethylacetate.
Quá trình trích ly enzyme từ nội tạng và đầu tôm sú chịu tác động của các yếu tố: tỷ lệ dung môi trích, nhiệt độ, thời gian, pH.
Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly protease
Tỷ lệ dung môi với mẫu: mẫu mô động vật có nhiều thành phần khác nhau, ngoài protein của enzyme và các thành phần enzyme khác đặc biệt là hàm lƣợng lipit nhiều, ảnh hƣởng đến quá trình trích ly, ở tỷ lệ thích hợp sẽ trích ly đƣợc những protein - protease ra ngoài mô nhiều hơn.
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hƣởng lớn đến quá trình trích ly, hầu hết protease động vật rất dễ biết tính hay giảm hoạt tính khi tăng nhiệt độ, hay ở nhiệt độ thích
hợp enzyme hoạt động mạnh thủy phân protein lẫn nhau. Thƣờng nhiệt độ ly trích protease từ mô động vật ở nhiềt độ không quá 5oC.
Thời gian trích ly: đối với protease từ nguồn động vật dễ bị phân hủy vì hoạt tính protease mạnh và có sự hỗ trợ của các enzyme thủy phân khác có trong mô mẫu khi để ở thời gian lâu, hay thời gian ngắn thì quá trình hòa tan của enzyme từ mô tế bào mẫu. Chính vì vậy thời gian trích ly enzyme từ mô mẫu cần phụ thuộc loại mô mẫu và dung môi trích.
pH là yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme trong quá trình ly trích, có những enzyme acid thì cần phải trích ly ở pH acid thì thu protein của enzyme đó cao hơn, còn enzyme kiềm thì ngƣợc lại.
2.3.2. Phƣơng pháp làm sạch enzyme
Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme ta đang cần, ngƣời ta thực hiện những phƣơng pháp sau
Phương pháp gây biến tính chọn lọc
Phƣơng pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn lọc các loại protein tạp. Phƣơng pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu acid và bền nhiệt. Ngƣời ta đƣa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-70oC và pH ≤ 5. Ở điều kiện này những enzyme không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến tính. Sau đó, bằng phƣơng pháp ly tâm hoặc phƣơng pháp lọc để loại bỏ các thành phần không phải là enzyme mà ta mong muốn.
Phương pháp kết tủa phân đoạn
Dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác nhau, thƣờng sử dụng muối (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Bằng cách này, ngƣời ta đƣợc một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme. Ngoài muối (NH4)2SO4 ra, còn có thể sử dụng một số dung môi hữu cơ nhƣ ethanol, acetone để kết tủa protein.
Phương pháp hấp thu chọn lọc
Có thể cho chất hấp thụ trực tiếp vào dung dịch enzyme hoặc cho dung dịch enzyme chảy qua một cột, trong cột có chứa chất hấp thụ. Chất hấp thụ đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ hydrocyapatite . Phƣơng pháp này có thể thực hiện một trong hai cách sau: hoặc là hấp thụ enzyme hoặc là hấp thụ protein tạp. Để tránh làm biến tính enzyme, thƣờng thực hiện quá trình hấp thụ ở nhiệt độ 0oC. Sau khi hấp thụ ta lại tiến hành chiết enzyme bằng các dung môi thích hợp.
Phương pháp sắc ký
Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nƣớc và tác nhân trao đổi ion , có thể áp dụng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography) để làm sạch enzyme. Thƣờng sử dụng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion sau:
o Nhựa trao đổi ion.
o Dẫn suất ester của cellulose nhƣ carboxymethyl-cellulose, diethylamino-ethyl-cellulose (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl- cellulose.
Dựa vào đặc tính phân cực của protein :
o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography). o Sắc ký giấy.
o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography).
o Sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc (Hydrophobic Interaction Chromatography – HIC)
Dựa vào kính thƣớc protein: sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography) Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand): ắc ký ái lực (Affinity Chromatography)
Hình 2.3. Nguyên tắc hoạt động của sắc ký 2.3.3. Giới thiệu phƣơng pháp sắc ký lọc gel
2.3.3.1. Bản chất của phƣơng pháp
Phƣơng pháp đƣợc sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lƣợng phân tử và phân tích định lƣợng tƣơng tác phân tử.
Hình 2.4. Tách các phân tử bằng lọc gel
Một số thông số vật lý của phƣơng pháp
Giới hạn tách (exclution limit): là kích thƣớc của phân tử nhỏ nhất không
chui vào bên trong hạt gel, nhƣ vậy tất cả chúng sẽ tách cùng một lƣợt ra khỏi cột. Thí dụ giới hạn tách của G-50 có phạm vi tách từ 1.500-30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn đều không chui vào hạt gel.
Phạm vi tách (Fructionation range): Thí dụ sephadex G-50 có phạm vi tách
từ 1.500-30.000 Da.
Độ ngậm nước (water regain): Là trọng lƣợng nƣớc mà 1 gam bột gel khô
hút nƣớc. Thí dụ G-50 có độ ngậm nƣớc là 5,0 0,3 g. Giá trị này chƣa tính đến lƣợng nƣớc bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích của cột.
Thể tích nền (bed volume): là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp thu
khi trƣơng nở trong nƣớc. G-50 có thể tích nền 9-11 ml/g gel khô.
Hạt gel (Gel particle): Hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thƣớc hạt xác định
bằng mesh hoặc đƣờng kính hạt (bead diameter) tính theo m. Hạt có kích thƣớc lớn (50-100 mesh, 100-300 m cho tố độ dòng chảy qua cột cao, nhƣng kết quả tách thấp. Ngƣợc lại những hạt mịn (400 mesh, 10-40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thƣờng ngƣời ta chọn hạt gel có kích thƣớc 100- 200 mesh (50-150 m).
Thể tích trống (void volume): Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel
trong cột. Xác định nhờ chất màu blue dextran có trọng lƣợng phân tử 2.000.000 Da.
Thể tích thổi (elution volume): là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần
tách ra khỏi cột.
Đặc tính hóa học của gel
Có 4 loại gel thƣờng đƣợc sử dụng.
Dextran: Có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia (Thụy Điển) cung cấp với tên thƣơng mại là Sephadex. Giới hạn tách của gel dextran 600.000 Da. Tuy nhiên nếu dextran đƣợc bổ sung thêm các liên kết ngang bởi N,N’- methylene bisacrylamide thì dextran có giới hạn tách gia tăng.
Gel polyacrylamide: Tạo bởi quá trình đồng polymer hoá của acrylamide và N,N’-methylene bisacrylamide (Bio-Rad cung cấp – Biogel –P là tên thƣơng mại)
Gel agarose: Là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ galactose và anhydrogalactose. Mạng gel đƣợc ổn định nhờ liên kết hydro nhiều hơn là do các liên kết ngang. Hãng Bio-Rad cung cấp agarose với tên thƣơng mại là Bio-gel A..
Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thƣơng mại là ultragel, nó cho phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng áp suất để tách.
2.3.3.2. Chọn lựa và chuẩn bị gel
a). Chọn lựa gel
Chủ yếu ngƣời ta sử dụng gel trong 2 trƣờng hợp: Loại bỏ phân tử có trọng lƣợng phân tử nhỏ ra khỏi hỗn hợp chứa các đại phân tử (thí dụ là quá trình loại muối (desalting) ra khỏi dịch chứa protein và nucleic acid. Cỡ hạt hay sử dụng 100- 200 mesh (10-40 m) hay 200-400 mesh (20-80 m). Hạt nhỏ hơn cho kết quả tách tốt hơn, nhƣng thời gian thực hiện lại rất dài.
b). Chuẩn bị gel và bảo quản
Gel dextran và acrylamide thƣơng mại ở dạng bột không ngậm nƣớc do vậy phải cho chúng ngậm nƣớc (cho nở) trƣớc khi sử dụng. Quá trình này thƣờng khoảng 3-4 giờ ở 20 o C đối với loại gel có liên kết nhiều, riêng P-300 và G-200 nên kéo dài thời gian trên tới khoảng 72 giờ (3 ngày đêm). Có thể rút ngắn thời gian nở trong nƣớc ở nhiệt độ cao (có thể đun). Gel agarose và gel polyacrylamide agarose thƣơng mại ở dạng ngậm nƣớc, do vậy không cần cho nở. Trƣớc khi nhồi gel mới vào cột phải loại bỏ những hạt siêu mịn bằng cách lắng – nghiêng (2-3 lần là đủ) và loại bọt khí bằng cách vừa khuấy vừa hút khí (bơm nƣớc) trong khoảng 1-2 giờ. Sau đó bổ sung chất bảo quản sodium aride (0,02%).
2.3.3.3. Dựng cột và chuẩn bị mẫu
a). Dựng cột lọc gel
Để tách phân đoạn, tốt nhất nên sử dụng cột dài hơn 100 cm có tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng nằm trong khoảng từ 25-100. Để tách nhóm chất chỉ cần sử dụng cột dài khoảng 50 cm với tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng trong khoảng 5-10. Đối với gel dextran và polyacrylamide sử dụng đệm có pH từ 1,0-10,0, trong khi gel agarose chỉ ổn định trong khoảng pH -10,0 và pH chọn lựa phải đảm bảo không làm mất hoạt tính của chất cần tách
b). Chuẩn bị mẫu
Cho mẫu quá nhiều vào cột làm giảm độ phân tách, ít quá làm mẫu bị loãng. Để tách nhóm chất có thể cho nhiều mẫu vào cột, tới 10-25% tổng thể tích cột. Để phân tích chỉ đƣợc phép đƣa một lƣợng mẫu đƣa một lƣợng mẫu nhỏ vào cột 1-5% tổng thể tích cột ( là thể tích nƣớc tƣơng đƣơng chiều cao nền cột đã nhồi).
Tốc độ dòng chảy nền điều chỉnh ở mức thấp hơn một chút so với dòng chảy tự do. Thông thƣờng đối với gel có kích thƣớc lỗ nhỏ , nên sử dụng tốc độ 8-12 ml/cm2 mặt cắt ngang (15-25 ml/h), còn đối với gel lỗ lớn 2-5 ml/ cm2 (5-10 ml/h). Dòng chảy có thể theo cách chảy tự do hoặc nhờ bơm nén. Phƣơng pháp lọc gel bằng cách cho chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel lỗ nhỏ. Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng chảy ổn định, nên phải dùng bơm nén. Thông thƣờng là nén theo chiều trong lực, tuy nhiên cũng có tác giả sử dụng cách nén ngƣợc từ dƣới lên.
2.3.3.4. Một số ứng dụng của phƣơng pháp lọc gel
Loại muối.
Tinh sạch phân tử sinh học. Xác định trọng lƣợng phân tử.
Nhƣ đã trình bày ở trên, gel chỉ thích hợp để tách các chất sinh học có tính ƣa nƣớc trong dung dịch nƣớc. Tuy nhiên đôi khi cũng nẩy sinh sử dụng phƣơng pháp này để tách các chất kỵ nƣớc trong dung môi hữu cơ (ethanol, acetone, dimethyl sulfoxide, dimethyl forenemide, acetonitrile,v.v…). Trong các trƣờng hợp này cần phải có chỉ dẫn cho từng trƣờng hợp cụ thể.
2.3.3.5. Ƣu và nhƣợc điểm của sắc ký lọc gel
a). Ưu điểm
Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác động (cofactor) và các điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt.
Sự phân tách có thể đƣợc thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cƣờng độ ion cao hoặc thấp, ở 370C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm.
Kỹ thuật này cho phép thu lại lƣợng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và dễ dàng khử muối.
b). Nhược điểm
Chậm (tốc độ thấp - thời gian dài)
Yêu cầu các cột có kích thƣớc lớn tƣơng đối so với lƣợng mẫu.
Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thƣớc phân tử, thƣờng khó đạt đƣợc sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thƣờng đƣợc sử dụng với những kỹ thuật khác nhau nhƣ sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ.
2.4. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE
Sau khi thực hiện các bƣớc ly trích và tinh sạch enzyme bƣớc kế tiếp kiểm tra lại độ tinh sạch protein dựa vào kỹ thuật điện di. Kỹ thuật điện di có thể cho ta xác định đƣợc trọng lƣợng phân tử protein mong muốn.
Kỹ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein đƣợc xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 đƣợc biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các
protein đều đƣợc tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thƣớc, những phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất định. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng và các phân tử tích điện dƣơng sẽ di chuyển về cực âm của điện trƣờng.
Để xác định phân tử lƣợng của một protein, ngƣời ta thƣờng so sánh với một thang phân tử lƣợng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lƣợng phân tử khác nhau đã biết.
Để đƣa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel). Trong phƣơng pháp này gel gồm 2 lớp:
Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên): duỗi thẳng các phân tƣ̉ protein trong mẫu có cấu trúc bâ ̣c cao về da ̣ng cấu trúc bâ ̣c 1 và các protein này đƣợc dồn lại và tạo một lớp băng mỏng.
Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dƣới): tạo ra các băng protein có trọng lƣợng phân tử, kích thƣớc khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu.
Hai lớp gel này đƣợc phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí. Kỹ thuật SDS-PAGE có thể xác định đƣợc những phân tử protein có trọng lƣợng phân tử từ 10.000 - 200.000 Da Những phân tử protein có trọng lƣợng lớn hơn 200.000 Da thƣờng đƣợc xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2,5%.
Ngoài kỹ thuật SDS-PAGE là phƣơng pháp điện di trong điều kiện làm biến tính protein (Denaturing condition), ngƣời ta còn dùng một số kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính