CPT với các tác nhân tủa: cồn 96o (tỷ lệ 1/6 v/v), acetone (65%) và muối sulfate amonium (70%) tủa DC từ mẫu đầu và mẫu nội tạng tôm đƣợc tinh sạch bằng sắc ký lọc gel.
Kết quả thu nhận enzyme qua các hình sắc ký đồ sau:
Hình 4.1. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch protease với Bio -Gel P100 của CPT tủa cồn từ DC mẫu nội tạng
Kết quả sắc ký lọc gel tinh sạch của mẫu nội tạng tủa cồn thu đƣợc 2 peak: Peak 1: từ ống 10 đến 18: 18 ml.
Peak 2: từ ống 23 đến 30: 16 ml.
Hình 4.2. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch protease với Bio-Gel P 100 của CPT tủa cồn từ DC mẫu đầu tôm
Peak 1: từ ống 14 đến 17: 8 ml. Peak 2: từ ống 20 đến 30: 22 ml
Hình 4.3. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch protease với Bio-Gel P 100 của CPT tủa acteone từ DC mẫu nội tạng.
Kết quả tinh sạch của mẫu nội tạng tủa bằng acetone thu đƣợc 2 peak: Peak 1: từ ống 9 đến 18: 20 ml.
Peak 2: từ ống 20 đến 30: 22 ml.
Hình 4.4. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch protease với Bio-Gel P 100 của CPT tủa acetone từ DC mẫu đầu
Peak 1: từ ống 9 đến 13: 10 ml. Peak 2: từ ống 21 đến 30: 20 ml.
Hình 4.5. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch protease với Bio-Gel P 100 của CPT tủa muối (NH4)2SO4 từ DC mẫu nội tạng
Kết quả sắc ký tinh sạch mẫu nội tạng khi tủa bằng muối sulfate amonium thu đƣợc:
Peak 1: từ ống 12 đến 18: 14 ml Peak 2: từ ống 21 đến 31: 22 ml.
Hình 4.6. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch protease với Bio-Gel P 100 của CPT tủa muối (NH4)2SO4 từ DC mẫu đầu tôm
Kết quả sắc ký tinh sạch của mẫu đầu khi tủa bằng muối sulfate amonium thu đƣợc 2 peak:
Peak 1: từ ống 9 đến 13: 10 ml. Peak 2: từ ống 21 đến 30: 20 ml.
Tiến hành xác định hoạt tính protease và hàm lƣợng protein từng peak sau tinh sạch. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.13 (Phụ lục chƣơng 4).
Qua kết quả so sánh hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của từng peak thu đƣợc sau sắc ký chúng tôi nhận thấy, peak 2 có hoạt tính protease và hàm lƣợng protein cao hơn. Chứng tỏ peak 2 có nhiều protein-enzyme mà chúng tôi quan tâm hơn. Để so sánh hiệu suất thu hồi protein-enzyme và độ tinh sạch sau sắc ký chúng tôi lựa chọn lƣợng enzyme thu hồi ở peak 2 của quá trình sắc ký để so sánh hoạt tính riêng và độ tinh sạch protease. Kết quả trình bày trong bảng 4.14 và đồ thị 4.22
Bảng 4.14. Hoạt tính riêng, độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch của protease sau sắc ký lọc gel
Enzyme tinh sạch từ CPT
Mẫu Nội Tạng Mẫu Đầu
HTR (U/mg) Độ tinh sạch Hiệu suất (%) HTR (U/mg) Độ tinh sạch Hiệu suất (%) CPT tủa cồn 106,06 2,80 67,28 32,43 4,89 56,90 CPT tủa acetone 57,07 1,80 66,02 38,94 6,24 72,75 CPT tủa (NH4)2SO4 78,26 3,60 82,75 46,35 8,68 76,67 0 20 40 60 80 100 120 CPT tủa cồn CPT tủa acetone CPT tủa (NH4)2SO4 Enzyme sau sắc ký H oạ t tí nh r iê ng c ủa e n z y m e ( U /m g )
HTR mẫu NT HTR mẫu Đầu
Đồ thị 4.22. Ảnh hƣởng của quá trình tinh sạch lọc gel đến HTR của enzyme
Kết quả ở bảng 4.13 cho thấy, khi tủa protein bằng tác nhân cồn, acetone hay muối sulfate amon hoạt tinh riêng của protease từ mẫu nội tạng và mẫu đầu tôm sú qua bƣớc tinh sạch đều tăng lên rất đáng kể. Sau qua trình tủa, hoạt tính riêng
protease của CPT tăng lên rất nhiều so với DC vì quá trình tủa đã loại bớt đƣợc một số tạp chất và enzyme không thể hiện hoạt tính protease. Các protein lạ này sẽ bị loại bỏ tiếp tục qua quá trình sắc ký. Dựa trên nguyên tắc phân đoạn của sắc ký lọc gel với Bio-Gel P 100 cho phép thu đƣợc những phân tử protein trọng lƣợng phân tử nằm trong khoảng 5.000 Da đến 100.000 Da. Protein-enzyme ra khỏi cột gel đƣợc đo hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm bằng hệ thống detector trong hệ thống sắc ký và đƣợc thể thể hiện dạng sắc ký đồ bằng phần mền LP-Data View trên máy tính. Dựa vào sắc ký đồ chúng ta thu những phân đoạn dịch protein-enzyme của từng peak. Do đó, enzyme sau sắc ký loại bỏ hầu hết những tạp chất, protein có kích thƣớc nằm ngoài giới hạn tách của Bio-Gel P 100 nên HTR của enzyme sau tinh sạch cao nhất.
Kết quả tinh sạch bằng sắc ký lọc gel cho thấy, enzyme thu đƣợc nhờ tác nhân tủa cồn của mẫu nội tạng cho HTR cao nhất (106,06 U/mg), sau đó là muối (NH4)2SO4 (78,26 U/mg). Nhƣng độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch của tác nhân tủa muối (NH4)2SO4 thì cao hơn tủa cồn, tủa acetone ở mẫu nội tạng và mẫu đầu. Điều này chứng tỏ, dùng muối (NH4)2SO4 thích hợp cho việc tủa thu CPT protease từ DC mẫu nội tạng và đầu tôm sú. Tuy nhiên xét về mặt kinh tế và quy mô sản xuất công nghiệp thì tác nhân tủa cồn vẫn mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn.
4.5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ- ĐIỆN DI SDS – PAGE
Tiến hành chạy điện di dịch enzyme thu đƣợc từng peak sau sắc ký của mẫu đầu và mẫu nội tạng. Sau sắc ký lọc gel Bio-Gel P 100 thu đƣợc 12 mẫu, tiến hành 2 lần điện di: lần thứ nhất là 6 mẫu enzyme peak 1 và peak 2 của mẫu nội tạng; Lần thứ 2 là 6 mẫu enzyme peak 1 và peak 2 của mẫu đầu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thứ tự cho mẫu vào giếng nhƣ sau: Giếng 1: Thang protein chuẩn. Giếng 2: Peak 1 mẫu tủa cồn. Giếng 3: Peak 2 mẫu tủa cồn. Giếng 4: Peak 1 mẫu tủa acetone.
Giếng 5: Peak 2 mẫu tủa acetone.
Giếng 6: Peak 1 mẫu tủa muối (NH4)2SO4. Giếng 7: Peak 2 mẫu tủa muối (NH4)2SO4
Hình 4.7. Kết quả điện di enyzme sau tinh sạch lọc gel của mẫu nội tạng.
Hình 4.8. Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu đầu
Dựa vào thang chuẩn trên gel điện di, tiến hành xác định giá trị Rf của từng vạch. Kết quả trình bày tronng bảng 4.15 (Phụ lục chƣơng 5). Từ đó xây dựng
1 2 3 4 5 6 7 Kdal 97.4 66.2 45 31 21.5 14.4 1 2 3 4 5 6 7 Kdal 97.4 66.2 45 31 21.5 14.4
phƣơng trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lg trọng lƣợng phân tử của các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel.
y = -1.0289x + 2.0786 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 Rf L g( tr ọn g l ư ợ n g p h ân t ử ).
Đồ thị 4.23. Sự tƣơng quan giữa giá trị Rf và Lg (trọng lƣợng phân tử)
Phƣơng trình hồi quy tuyến tính thu đƣợc từ đồ thị 4.22 là: Y = -1.0289x + 2.0786
Trong đó: Y là lg (trọng lƣợng phân tử protein)
X là Rf: tỷ số giữa khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách di chuyển của vạch màu bromophenol blue cuối cùng tính từ gel phân tách.
Từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính, có thể suy ra công thức tính trọng lƣợng phân tử của protein theo công thức sau:
Trong đó: M là trọng lƣợng phân tử (đơn vị: Kdal)
Xác định trọng lƣợng phân tử protein của enzyme thu đƣợc sau tinh sạch. Kết quả trình bày trong bảng 4.15 và bảng 4.16.
Bảng 4.16. Trọng lƣợng phân tử protein mẫu nội tạng chạy điện di SDS-PAGE
Mẫu Nội Tạng Tủa Giếng Vạch Rf Lg(Y) M (Kdal) Tủa Cồn (1/6) 2: Peak 1 1 0,349 1,721 52,565 2 0,488 1,577 37,755 3: Peak 2 1 0,233 1,84 69,257 2 0,349 1,721 52,565 3 0,488 1,577 37,755 Tủa Acetone 65% 4: Peak1 1 0,233 1,84 69,257 2 0,349 1,721 52,565 3 0,477 1,589 38,811 5: Peak 2 1 0,233 1,84 69,257 2 0,349 1,721 52,565 3 0,465 1,601 39,896 Tủa Muối (NH4)2SO4 6: Peak 1 1 0,244 1,828 67,373 2 0,465 1,601 39,896 7: Peak 2 1 0,116 1,96 91,25 2 0,465 1,601 39,896
Bảng 4.17. Trọng lƣợng phân tử protein của mẫu đầu chạy điện di SDS-PAGE
Mẫu Đầu Tủa Giếng Vạch Rf Lg(Y) M
(Kdal) Tủa Cồn 2: Peak 1 0 0 0 0 3: Peak 2 1 0,349 1,721 52.565 2 0,477 1,589 38.811 Tủa Acetone 4: Peak1 1 0,233 1,.840 69.257 2 0,349 1,721 52.565 3 0,477 1,589 38.811 5: Peak 2 1 0,233 1,840 69.257 2 0,349 1,721 52.565 3 0,465 1,601 39.896 Tủa Muối (NH4)2SO4 6: Peak 1 1 0,233 1,840 69.257 2 0,465 1,.601 39.896 7: Peak 2 1 0,349 1,721 52.565 2 0,465 1,601 39.896
Nhận xét:
Qua kết quả thực nghiệm chúng tôi nhận thấy, hầu hết các giếng đều xuất hiện vạch protein, những vạch này có vị trí gần giống nhau. Số vị trí vạch xuất hiện trên gel điện di chứng tỏ protein-enzyme thu đƣợc từ mẫu đầu và nội tạng tôm sú không chỉ là một loại enzyme thể hiện hoạt tính protease. Kết quả này phù hợp với cơ sở lý thuyết đã trình bày trong phần tổng quan. Tuy nhiên những vạch protein trên gel điện di cũng chƣa khẳng định đƣợc chúng là những protein thuộc enyzme mà đề tài quan tâm. Để hiểu biết chính xác hơn có thể sử dụng kỹ thuật lai phân tử để xác định hoạt tính protease của từng vạch.
Khi tủa bằng muối (NH4)2SO4 chạy điện di xuất hiện vị trí vạch protein rất rõ, vị trí và số lƣợng vạch protein ở mẫu nội tạng và mẫu đầu rất giống nhau số lƣợng vạch protein-enzyme ở peak 2 nhiều hơn. Điều này rất phù hợp với kết quả xác định hoạt tính protease và hàm lƣợng protein sau sắc ký lọc gel. Kết quả này một lần nữa khẳng định khả năng tủa thu hồi CPT của muối (NH4)2SO4 tốt nhất.
Khi tủa bằng cồn: kết quả điện di enzyme thu hồi sau tinh sạch của mẫu nội tạng và mẫu đầu có sự khác biệt.
Mẫu nội tạng: kết quả điện di của enzyme ở peak 1và peak 2 có xuất hiện vạch protein, lƣợng protein tạp ở peak 1 nhiều hơn peak 2.
Mẫu đầu: kết quả điện di của enzyme ở peak 1 không xuất hiện vạch protein rõ ràng trong khi dó ở peak 2 cho kết quả vị trí vạch protein rất rõ, lƣợng protein tạp tƣơng đối cao.
Khi tủa bằng acetone: Kết quả chạy điện di cho thấy, vị trí vạch protein trên gel điện di giữa hai mẫu không có sự khác biệt.
Nhƣ vậy trọng lƣợng phân tử của protease chiết tách và tinh sạch từ mẫu nội tạng và đầu tôm từ 37.775 Da đến 69.257 Da.
Chƣơng 5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu đƣợc từ các thí nghiệm của đề tài, chúng tôi xin rút ra kết luận cho quá trình tách chiết, tinh sạch và khảo sát tính chất của protease từ đầu và nội tạng tôm sú.
Quá trình tách chiết protease từ nội tạng và đầu tôm sú:
Dung môi tách chiết: đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5 với tỷ lệ mẫu/dung dịch Tris-HCl = 1/7 (w/v) thích hợp nhất để thu DC.
Tỷ lệ DC/cồn = 1/6 (v/v) là tỷ tối ƣu để tủa protease từ DC thu CPT.
Nồng độ acetone 65% là nồng tối ƣu để tủa enzyme potease từ DC thu CPT. Nồng độ muối (NH4)2SO4 70% độ bão hòa là nồng độ tối ƣu để tủa protease từ DC thu CPT.
Điều kiện tối ƣu cho hoạt động của protease CPT mẫu nội tạng tôm sú: protease hoạt động tối ƣu nhất ở nhiệt độ 47oC và pH =7, nồng độ muối ăn 3%.
Sau khi tinh sạch enzyme thu đƣợc từ CPT tủa bằng cồn, acetone và muối (NH4)2SO4, HTR và hiệu suất tinh sạch sắc ký lọc gel Bio-Gel P 100 của enzyme thu đƣợc sau tinh sạch.
Mẫu nội tạng:
Khi tủa cồn: HTR enzyme tinh sạch tăng lên so với HTR enzyme của CPT từ 38,46 U/mg tăng lên 106,06 U/mg; Hiệu suất tinh sạch 67,28%. Khi tủa acetone: HTR enzyme tinh sạch tăng lên so với HTR enzyme của CPT từ 31,70 U/mg tăng lên 57,07 U/mg. Hiệu suất tinh sạch 66,02%. Khi tủa muối (NH4)2SO4: HTR enzyme tinh sạch tăng lên so với HTR enzyme của CPT từ 21,74 U/mg tăng lên 78,26 U/mg. Hiệu suất tinh sạch 82,75%.
Mẫu đầu:
Khi tủa cồn: HTR enzyme tinh sạch tăng lên so với HTR enzyme của CPT từ 6,63 U/mg tăng lên 32,43U/mg. Hiệu suất tinh sạch 56,90%.
Khi tủa acetone: HTR enzyme tinh sạch tăng lên so với HTR enzyme của CPT từ 6,24U/mg tăng lên 38,94 U/mg. Hiệu suất tinh sạch 72,75%. Khi tủa muối(NH4)2SO4: HTR enzyme tinh sạch tăng lên so với HTR enzyme của CPT từ 5,34 U/mg tăng lên 46,35 U/mg. Hiệu suất tinh sạch 76,67%.
Trọng lƣợng phân tử protease chiết tách từ mẫu nội tạng và đầu tôm sú trong khoảng 37.755 đến 66.200 Da.
5.2. ĐỀ NGHỊ
Hiện nay nhu cầu sử dụng protease trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm là rất lớn. Để góp phần đáp ứng nhu cầu này, chúng tôi xin đề nghị:
Tối ƣu hóa quá trình tách chiết và tinh sạch protease từ đầu tôm sú.
Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính protease sau tinh sạch để có cách bảo quản chế phẩm enzyme tinh sạch một cách thích hợp.
Tiếp tục nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của protease trong hệ tiêu hóa tôm để góp phần bảo quản tôm sau thu hoạch một cách hiệu quả hơn
Nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất các chế phẩm protease thƣơng mại từ nội tạng và đầu tôm và các loài động vật thủy sinh khác.
Nghiên cứu, phát triển ứng dụng chế phẩm protease nội tạng của động vật thủy sinh trong các lĩnh vực chế biến thủy sản, công nghệ thực phẩm, dƣợc mỹ phẩm và các lĩnh vực khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Đức Lƣợng, 2004. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Tiến Thắng, 2003. Một số kỹ thuật phòng thí nghiệm sinh học. Viện
Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Tiến Thắng, 2003. Công nghệ enzyme protein. Viện Sinh Học Nhiệt
Đới Tp. Hồ Chí Minh.
4. Đỗ Văn Ninh, 2004. Tối ưu hóa quá trình phân giải protein của proteza trong thịt cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phâm. Luận
án Tiến sĩ Kỹ thuật, Đại học Thủy Sản Nha Trang. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5. Nguyễn Việt Dũng, 1999. Nghiên cứu sự biến đổi của tôm sau khi chết và phương pháp bảo quản nguyên liệu. Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật, Đại học Thủy
Sản Nha Trang.
6. Phạm Thị Trân Châu, 1993. Công nghệ enzyme và ứng dụng protease trong công nghệ chế biến. Tạp chí Thủy sản, số 1.
7. Tạ Thị Yến, 2005. Nghiên cứu tách chiết và một số tính chất của protease trong
tôm sú (P.monodon) đang lột vỏ. Luận văn Kỹ sƣ Công nghệ chế biến Thủy sản,
Đại học Thủy Sản Nha Trang.
8. Đậu Thị Kim Dung, 2005. Khảo sát hoạt tính và tinh sạch protease từ hai chủng
nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki trên môi trường bán rắn.
Luận văn Kỹ sƣ Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
TIẾNG NƢỚC NGOÀI
9. Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical
Biochemistry 72: 248-254, 1976.
10.Rajni, H.K. The workshop 2005 “ Enzyme Technology and Biosensors”. Hanoi, 03/2005.
11.Stein Ivar Aspmo, Svein Jarie Horn, Vincent G. H. Eijsink, 2004. Enzymatic hydrolysis of Atlantic cod (Gadus morhua L.) viscera. Process Biochemistry.
INTERNET
12.http://bio.ioit-hcm.ac.vn/kho/nucleotide.jsp?which=003 13.http://www.fistenet.gov.vn/DMSP/index.asp?menu=tomsu 14.http://www.aginternetwork.org/en/
PHỤ LỤC Phụ lục chƣơng 3
1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Bradford
Trong các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein thì đây là phƣơng pháp có độ nhạy cao, có thể xác định tới 1 g, hoá chất đơn giản ít tốn thời gian. Một ƣu điểm lớn của phƣơng pháp này là ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu protein, nhất là amoniumsufate.
Nguyên tắc:
Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bƣớc sống thấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển