Khảo sát khả năng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo, tạo dịch huyền phù cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhận hợp chất anthraquinone

Trang 1



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO TẠO DI ̣CH HUYỀN PHÙ CÂY

Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN

HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003-2007

Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ THU

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

Trang 2

ThS QUÁCH NGÔ DIỄM PHƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được hoàn thành với s ự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, các anh chị và các bạn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

PGS.TS Bù i Văn Lê ̣ , người đã tâ ̣n tình hướng dẫn và ta ̣o mo ̣i điều kiê ̣n để em thực hiê ̣n khóa luâ ̣n này

Thạc sĩ Quách Ngô Diễm Phương, người trực tiếp hướng dẫn, chỉ dạy và luôn động viên em trong những hoàn cảnh khó khăn nhất Đề tài này được hoàn thành với rất nhiều nhiệt tình và tâm huyết của chị Cảm ơn chị vì tất cả

Em cảm ơn Tiến sĩ Phan Phước Hiền, những chỉ dạy và giúp đỡ của thầy đã giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Thạc sĩ Kiều Phương Nam, người luôn gợi ý và cho em những lời khuyên bổ ích

Em cảm ơn anh Điền , anh Hoàng, anh Cường và các anh chi ̣ phòng sắc ký , Viê ̣n Công nghê ̣ Sin h ho ̣c và Công nghê ̣ Môi trường , ĐH Nông Lâm TP HCM Cảm ơn vì những giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị trong suốt thời gian chúng em thực tâ ̣p

Cảm ơn anh Bình cùng toàn thể các bạn sinh viên năm tư trường ĐH Khoa học Tự nhiên , ĐH Mở luôn sẵn sàng giúp đỡ và đô ̣ng viên tôi những lúc gă ̣p khó khăn trong đề tài

Cảm ơn lớp CNSH 29 thân yêu và các ba ̣n thân đã cùng tôi chia sẻ tất cả những nỗi buồn vui suốt bốn năm đa ̣i ho ̣c

Và trên hết , con cảm ơn bố m ẹ, chị gái và em trai yêu quý đã luôn chăm lo , ủng hộ, tin tưởng con , cảm ơn cả nhà vì đã cho con chỗ dựa vững chắc nhất trong cuô ̣c sống

Tháng 9/2007 Hoàng Thị Thu

Trang 4

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Khảo sát khả năng ứng du ̣ng kỹ thuâ ̣t nuôi cấy mô

sẹo, tạo dịch huyền phù cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhâ ̣n hơ ̣p chất

anthraquinone” đươ ̣c tiến hành ta ̣i trại thực nghiệm sinh học, Đại học Khoa học

Tự nhiên, Đa ̣i ho ̣c Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh và phòng sắc ký, Viê ̣n Công nghê ̣ Sinh ho ̣c và Công nghê ̣ Môi trường , Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 3/2007 đến hết tháng 8/2007

Kết quả thu đươ ̣c:

- Mô sẹo từ mẫu lớp mỏng tế bào cây D burmanni Vahl được hình thành

trên môi trường khoáng cơ bản Gamborg’s B5 bổ sung: NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2 mg/l), đườ ng 20 g/l, PVP (1,25 mg/l) ở pH 5,8, trong điều kiê ̣n ủ tối

- Các kỹ thuật sắc ký cột , sắc ký bản mỏng đươ ̣c sử du ̣ng nhằm cô lâ ̣p và ly

trích hợp chất anthraquinone trong cây D burmanni in vitro Hơ ̣p chất này đ ược sử

dụng như chất tham chiếu để định lượng anthraquinone trong các thành phần khác

nhau của cây Drosera burmanni Vahl

- Kết quả đi ̣nh lươ ̣ng anthraquinone bằng kỹ thuâ ̣t HPLC cho thấy : hàm lươ ̣ng anthraquinone trong rễ là 3,03% so với tro ̣ng lượng khô, nhiều hơn trong thân lá (2,78%); ở cây không có sắc tố đỏ là 2,8% trong khi ở cây có sắc tố đỏ là 0,78%; trong sinh khối huyền phù tế bào là 0,02% ( so vớ i tro ̣ng lươ ̣ng tươi ), trong khi không thấy có sự hiê ̣n diê ̣n của anthraquinone trong di ̣ch môi trường

Trang 5

SUMMARY

The thesis “Study on application of callus and suspension cultures in

Drosera burmanni Vahl to produce anthraquinone compound” was carried out

at Plant Biotechnology lab, University of Natural Sciences; and Chromatography room, Research Institute for Biotechnology and Enviromental Technology, University of Agriculture and Forestry, HCM city from March to August, 2007

Results:

- Callus of D burmanni Vahl was cultured successfully by using

Gamborg’s B5 medium (modified) supplemented with NAA (0,2 mg/l), 2,4-D (0,2 mg/l), succrose (20g/l), PVP (1,25 mg/l), pH was adjusted to 5,8 before autoclaving

- Column Chromatography and Thin Layer Chromatography were used to

purify anthraquinone compound in D burmanni This compound was

used as authentic sample for HPLC technique

- Roots of D burmanni contained 3,01% dry weight (DW) of anthraquinone,

larger than 2,78% in leaves

- Anthraquinone content of red-leaf D burmanni Vahl took 0,78% of DW,

compared with 2,78% DW in green-leaf trees

- Biomass of D burmanni’s suspension contained 0,02% of fresh weight of

anthraquinone, while no quantifiable amounts of anthraquinone has been found in spent medium

Ho Chi Minh city, September, 2007 Hoang Thi Thu

Trang 6

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các hình x

Danh sách các sơ đồ và biểu đồ xii

Danh sách các bảng xiii

Chương1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Ý nghĩa đề tài 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về Drosera burmanni Vahl 3

2.1.1 Vị trí phân loại 3

2.1.8.1 Ý nghĩa về sinh thái 12

2.1.8.2 Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa thực vật 12

2.1.8.3 Gía trị dược tính 12

2.1.8.4 Ứng dụng trong công nghiệp 14

2.1.8.5 Gía trị kinh tế 15

2.1.9 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 16

2.2 Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền phù tế bào để thu nhận hợp chất thứ cấp 17

2.2.1 Khái niệm hợp chất thứ cấp 17

2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo 18

2.2.2.1 Khái niệm mô sẹo 18

2.2.2.2 Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo 19

2.2.3 Nuôi cấy dịch huyền phù 19

2.2.3.1 Khái niệm huyền phù tế bào 19

2.2.3.2 Nguyên tắc tạo huyền phù 19

Trang 7

2.2.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo huyền phù tế bào 20

2.2.3.4 Các phương pháp nuôi cấy huyền phù hiện nay 20

2.2.3.5 Các điều kiện nuôi cấy dịch tế bào ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp 22

2.2.4 Các phương pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù 22

2.2.4.1 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 22

2.2.4.2 Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao 22

2.2.4.3 Bổ sung tiền chất 22

2.2.4.4 Cố định tế bào 23

2.2.4.5 Cảm ứng sự phân hóa mô 23

2.2.4.6 Nhân tố cảm ứng (elicitor) 23

2.3 Các kỹ thuật sử dụng trong bài luận văn 24

2.3.1 Phương pháp ly trích – thu nhận hợp chất 24

2.3.1.1 Sắc ký cột 24

2.3.1.2 Sắc ký nhanh cột khô (Dry Column Flash Chromatography) 26

2.3.1.3 Sắc ký lớp mỏng điều chế 27

2.3.2 Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC trong định lượng hợp chất thứ cấp 28

Chương 3: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 31

Thời gian và địa điểm thực hiện 31

3.1 Nuôi cấy mô sẹo, tạo dịch huyền phù 31

3.1.1 Vật liệu 31

3.1.2 Phương pháp 33

3.1.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng và

nồng độ đường lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng 33

3.1.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho

việc kích ứng tạo mô sẹo 34

3.1.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hợp của 2,4-D khi kết hợp

với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo 35

3.1.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của các kiểu nuôi cấy lên sự

tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù 36

3.1.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của ánh sáng lên sự

hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo 37

3.2 Ly trích và cô lâ ̣p hơ ̣p chất anthraquinone trong cây D burmanni 38

3.2.1 Vật liệu 38

3.3 Định lượng hợp chất anthraquinone trong các nguyên liệu

nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC 40

3.3.1 Vật liệu 40

3.3.2.1 Xác định điều kiện, thông số kỹ thuật thích hợp 40

3.3.2.2 Xây dựng đường chuẩn 41

Trang 8

3.3.2.3 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của cách xử lý mẫu trong

định lượng hợp chất anthraquinone 41

3.3.2.4 Thí nghiệm 7: So sánh hàm lượng hợp chất anthraquinone trong

các bộ phận khác nhau của cây in vitro 43

3.3.2.5 Thí nghiệm 8: So sánh hàm lượng hợp chất anthraquinone trong

các mẫu cây có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ 44

3.3.2.6 Thí nghiệm 9 Xác định hàm lượng anthraquinone trong mẫu

dịch huyền phù đã tạo được từ thí nghiệm 4 45

3.4 Xử lý thống kê 45

Chương 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 46

4.1 Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù 46

4.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng và

nồng độ đường lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng 46

4.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho

việc kích ứng tạo mô sẹo 48

4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hợp của 2,4-D khi kết hợp

với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo 49

4.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của các kiểu nuôi cấy lên sự

tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù 54

4.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của ánh sáng lên sự

hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo 56

4.2 Ly trích và cô lâ ̣p hơ ̣p chất anthraquinone trong cây D burmanni 58

4.3 Định lượng hợp chất anthraquinne trong các nguyên liệu nuôi cấy

in vitro khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC 59

4.3.1 Xây dựng đường chuẩn 59

4.3.2 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của cách xử lý mẫu trong định

lươ ̣ng hợp chất anthraquinone 61

4.3.3 Thí nghiệm 7: So sánh hàm lượng hợp chất anthraquinone trong

4.3.4 Thí nghiệm 8: So sánh hàm lượng hợp chất anthraquinone trong

các mẫu có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ 64

4.3.5 Thí nghiệm 9 Xác định hàm lượng anthraquinnone trong mẫu

dịch huyền phù đã tạo được từ thí nghiệm 4 66

Chương 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 68

5.1 Kết luận 68

5.1.1 Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù 68

5.1.2 Định lượng hợp chất anthraquinone bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC 68

5.2 Đề nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC

Trang 9

DANH SÁCH CÁC CHƢ̃ VIẾT TẮT

2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid BAP : 6-benzylaminopurine

CRD : Completely Randomized Design (Hoàn toàn ngẫu nhiên) ctv : cộng tác viên

HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng ao áp) IAA : 3-indolyl-acetic acid

IBA : 3-indolebutyric acid MS : Murashige & Skoog, 1962 NAA : naphthalene acetic acid PVP : poly vinyl pyrrolidone

TCL : Thin Cell Layer (Lớ p mỏng tế bào)

TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký bản mỏng)

Trang 10

DANH SÁCH CÁC HÌNH

TRANG

Hình 2.1 Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl trên thế giới 4

Hình 2.2 Hình thái của Drosera burmanni Vahl 4

Hình 2.3 Lá D burmanni 5

Hình 2.4 D burmanni Vahl ngoài tự nhiên 7

Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của một số flavonoid và flavonoid glucoside 10

Hình 2.6 Mô ̣t số loa ̣i Drosera có giá trị kinh tế cao trên thế giới 15

Hình 2.7 Hệ thống nuôi cấy gián đoạn qui mô nhỏ trên các máy lắc 21

Hình 2.8 Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm 21

Hình 2.9 Sắc ký cô ̣t 24

Hình 2.10 Mô hình sắc ký nhanh cô ̣t khô 26

Hình 2.11 Sắc ký lớp mỏng 27

Hình 2.12 Sơ đồ hoa ̣t đô ̣ng các bô ̣ phâ ̣n của máy HPLC 29

Hình 3.1 Cây D burmanni Vahl nuôi cấy in vitro 31

Hình 4.1 Mô se ̣o được hình thành từ mẫu lớp mỏng cây D.burmanni trên môi trường Gamborg’s B5 bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D với nồng đô ̣ thay đổi 52

Hình 4.2 Mô se ̣o được hình thành từ mẫu lớp mỏng lóng thân cây D burmanni trên môi trườ ng Gamborg’s B5 bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D với nồng đô ̣ thay đổi 53

Hình 4.3.A Mô sẹo nuôi trong môi trường lỏng lắc 55

Hình 4.3.B Cụm tế bào quan dưới kính hiển vi 40X 55

Hình 4.3.C Tế bào đơn quan dưới kính hiển vi 40X 55

Hình 4.4 Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô se ̣o cây D burmanni 57

Hình 4.5 Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm 60

Trang 11

Hình 4.9 Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở ở 70 ppm 60

Hình 4.10 Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D burmanni được xử lý theo quy trình A 61

Hình 4.11 Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D burmanni được xử lý theo quy trình B 61

Hình 4.12 Sắc ký đồ HPLC của mẫu rễ cây D burmanni Vahl 63

Hình 4.13 Sắc ký đồ HPLC của mẫu thân lá cây D burmanni Vahl 63

Hình 4.14 Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D burmanni Vahl có sắc tố đỏ 65

Hình 4.15 Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D burmanni Vahl không có sắc tố đỏ 65

Hình 4.16 Sắc ký đồ HPLC của mẫu dịch môi trường sau khi lọc sinh khối tế bào 66

Hình 4.17 Sắc ký đồ HPLC của sinh khối tế bào từ dịch huyền phù 66

Trang 12

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

TRANG SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Con đường tổng hợp các hợp chất thứ cấp ở thực vâ ̣t 18

Sơ đồ 3.1 Quy trình ly trích và cô lập hợp chất anthraquinone 39

Sơ đồ 3.2 Quy trình xử lý mẫu 42

Sơ đồ 3.3 Quy trình xử lý di ̣ch huyền phù 45

Sơ đồ 3.4 Quy trình ly trích và cô lâ ̣p hợp chất anthraquinone (kết quả) 58

BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ mẫu lớp mỏng sống trên các loại môi trường khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy 46

Biểu đồ 4.2 Khối lượng mô sẹo tăng từ 1 mg ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy 54

ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1 Đường chuẩn tuyến tính giữa nồng độ anthraquinone tham chiếu và giá trị diện tích peak 59

Trang 13

DANH SÁCH CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 2.1 Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và

7-methyljuglone 8

Bảng 2.2 Các Naphthoquinone vi lượng được tách chiết từ Drosera 9

Bảng 2.3 Dược tính và một số hoạt tính ứng dụng khác của

dịch chiết Drosera 13

Bảng 3.1 Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng thành phần khoáng

và nồng độ đường lên sự phát triển mẫu cấy lớ p mỏng 33 Bảng 3.2 Bố trí nghiệm thức khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone

thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo 34 Bảng 3.3 Bố trí nghiệm thức khảo sát nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D

khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo 35 Bảng 3.4 Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các kiểu nuôi cấy

lên sự tăng sinh khối mô sẹo 36 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng

lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo 37 Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lượng anthraquinone trong

Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lượng anthraquinone trong mẫu cây có sắc tố đỏ và không có sắc tố đỏ 44 Bảng 4.1 Tỷ lệ mẫu sống ở các nghiệm thức sau 14 ngày nuôi cấy 46 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của thành phần khoáng lên sự phát triển của

mẫu cấy lớp mỏng 47 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường lên sự phát triển của mẫu cấy

lớp mỏng 48 Bảng 4.4 Tỷ lệ tạo mô sẹo trên các môi trường sử dụng kết hợp 2

loại hormone khác nhau 48

Trang 14

Bảng 4.5 Tỷ lệ mẫu tạo sẹo trên các môi trường khác nhau sau 21

ngày nuôi cấy 49 Bảng 4.6 Khối lượng mô sẹo tăng từ 1 mg mô sẹo ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy trên các kiểu nuôi cấy khác nhau 54 Bảng 4.7 Kết quả ảnh hưởng ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo 56 Bảng 4.8 Bảng tương quan nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak 59 Bảng 4.9 Kết quả so sánh hàm lượng anthraquinone trong các bộ phận khác

nhau của cây in vitro 62

Bảng 4.10 Kết quả so sánh hàm lượng anthraquinone trong các mẫu có và

không có sắc tố đỏ 64 Bảng 4.11 Kết quả đi ̣nh lượng anthraquinnone trong mẫu dịch huyền phù 66

Trang 15

Từ những năm đầu thập niên 70 của thế kỷ XX đến nay, các nhà khoa học đã công bố hàng loạt các công trình nghiên cứu về nuôi cấy tế bào đơn của nhiều loài thực vật nhằm thu nhận sản phẩm thứ cấp Như vậy việc áp dụng các kỹ thuật công

nghệ sinh học dựa trên các phương pháp nuôi cấy mô, nuôi cấy tế bào in vitro

không những góp phần vào việc sản xuất và thu nhận mà còn giúp ta đảm bảo được một cách chủ động số lượng các hợp chất có giá trị trị liệu

Ở Việt Nam, người ta đã thu thập được 3 loài Drosera trong đó Drosera burmanni Vahl gần đây đã được nghiên cứu về việc thu nhận hợp chất quinone từ nuôi cấy in vitro, khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất này cũng như nhân giống

thành công bằng tạo chồi trực tiếp

Trang 16

Do đó để hướng tới tự động hóa việc thu nhận và chủ động tăng sinh lượng chất quinone đã được nghiên cứu thành công, đề tài:

“KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO

TẠO DỊCH HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN

HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE ”

đã ra đời

1.2 Mục tiêu

 Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ cây Drosera burmanni Vahl

 Khảo sát khả năng tạo dịch huyền phù tế bào cây Drosera burmanni Vahl

 Khảo sát hàm lượng hợp chất quinone thu được từ nuôi cấy dịch huyền phù

1.3 Yêu cầu

 Tạo được mô sẹo và khởi đầu tạo dịch huyền phù cây D burmanni Vahl

 Phân tích định tính và định lượng được hàm lượng anthraquinone trong từng

thành phần khác nhau và trong dịch huyền phù cây D burmanni bằng máy

HPLC

1.4 Ý nghĩa của đề tài:

 Ý nghĩa khoa học: đây là một bước tiến quan trọng và cần thiết trong qui

trình ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào D burmanni Vahl để thu nhận hợp

chất quinone

 Ý nghĩa thực tiễn: cung cấp quy trình tạo mô sẹo, dịch huyền phù D burmanni Vahl cho mục tiêu thu nhận quinone

Trang 17

Họ: Droseraceae

Giống: Drosera

Loài: Drosera burmanni Vahl

Tên tiếng Anh: burmese sundew

Tên thông thường: cây bắt ruồi, cỏ trói gà, bèo đất, trường lệ burman

2.1.2 Phân bố

Drosera burmanni Vahl được tìm thấy ở đông bắc nước Úc, Ấn Độ, Trung

Quốc, Nhật, Sri Lanka và Đông Nam Á như Malaysia, Myanmar, Thái Lan,Việt Nam (Hình 2.1) [33], [34]

Ở Việt Nam, Drosera burmanni Vahl được tìm thấy ở Thái Nguyên, Thanh

Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phước Bửu tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu [1] và ở khu du lịch sinh thái Bắc Bình, Bình Thuận

Trang 18

h

Hình 2.1: Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl trên thế giới [30]

2.1.3 Mô tả hình thái

Drosera burmanni Vahl là loài cây cỏ, cao 5 - 30 cm, có nhiều màu sắc khác

nhau: xanh lá, xanh đậm, xanh có ánh vàng với lông tuyến màu đỏ hay toàn cây màu đỏ [6], [15], [33], [35]

Hình 2.2: Hình thái của Drosera burmanni Vahl [33], [35]

 Thân (Hình 2.2 A, B, C)

Thân không phân nhánh, rất ngắn, có khi chỉ cao 1 cm khi tăng trưởng trong bóng râm, không hình thành thân củ dưới đất Thân mang nhiều phát hoa [31]

Ghi chú

Khu vực phân bố của

Drosera burmanni Vahl

Khu vực không có sự hiện

diện của Drosera burmanni

Vahl

A

F E

D

C B

Trang 20

thẳng góc từ chồi nách hay chồi đỉnh gọi là phát hoa Phát hoa cao 5 - 6 cm, mỗi phát hoa có từ 5 đến 25 hoa, họp thành chùm hình bò cạp Hoa đối xứng tròn, lá đài 5, cánh hoa 5, tiểu nhụy 5, noãn sào một buồng, đính phôi trắc mô, bầu 5 lá noãn hàn liền nhau bởi mép bên [9], [14]

Hoa nở nhiều thời điểm khác nhau, tùy thuộc vào từng giai đoạn phát triển của cây Hoa thường nở vào buổi sáng Mỗi ngày nở một bông bắt đầu từ nụ thấp nhất (nụ được hình thành sớm nhất) Hầu hết hoa tự thụ phấn nhờ côn trùng Nếu sự thụ phấn không diễn ra, hạt phấn và nhụy sẽ tự thụ phấn khi hoa khép cánh

Hình thức: Sử dụng dịch nhầy để bắt dính con mồi (flypaper traps)

Cơ chế: Các lông tuyến bao phủ khắp bề mặt lá có vai trò như một cái bẫy

nhỏ Các keo dính tiết ra từ lông tuyến nhìn như những giọt sương và không bị khô đi trong ánh mặt trời (vì vậy mà loài cây này còn được gọi là “sundew”) Giọt keo dính này tác động như những giấy bắt mồi (flypaper) Các giọt keo thường không độc và có hương thơm, nhờ vậy nó thu hút con mồi đậu xuống bề mặt lá và bắt dính chúng Khi đó những lông tuyến nhạy cảm với protein sẽ uốn cong, từ từ cuộn con mồi lại và đẩy nó vào giữa lá Tuyến tiết trên bề mặt lá lúc này sẽ ngừng tiết keo dính mà tiết nhiều enzyme thủy phân tiêu hóa con mồi Lá sẽ hấp thu chất dinh dưỡng mà cây không thể lấy từ môi trường nghèo dinh dưỡng [25], [34], [35]

Trang 21

2.1.5 Đặc điểm sinh thái

Hình 2.4: D burmanni Vahl ngoài tự nhiên [3], [40]

Trang 22

2.1.6 Thành phần hóa học

Nhiều hợp chất naphthoquinone và các flavonoid đã được cô lập, xác định

cấu trúc và định lượng trong cây Drosera ngoài thiên nhiên cũng như in vitro

 Naphthoquinone

Các loại Drosera thường sản sinh 2 loại naphthoquinone chính là plumbagin

và 7-methyljuglone (Bảng 2.1) [21] Ngoài ra còn có các naphthoquinone vi lượng khác như droserone, hydroxydroserone và nhiều naphthoquinone glucoside (Bảng 2.2) mà không thể tìm thấy trong các loài cây khác [29]

Bảng 2.1: Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone [21]

D andersoniana D auriculata D binata D bulbosa D capensis D capillaris D cistiflora D dichotoma D erythrorhiza D intermedia D longifolia D lunata D macrophylla D madagascariensis D microphylla D modesta D natalensis D peltata

D adelae D aliciae

D aliciae x capensis D anglica

D auriculata D burkeana

D burmanii

D capensis D cistiflora D cuneifolia D dielsiana D filiformis D hamiltonii D hilaris D indica D intermedia D longifolia

D longifolia x rotundifolia

Trang 23

D platypoda D prolifera D pygmaea D regia

D rotundifolia D slackii

D stolonifera, spp Rupicola D venusta

D villosa

D madagascariensis D ramentacea D regia

D rotundifolia D spathulata

D stolonifera, spp Stolonifera D tracii

D trinervia D villosa

Bảng 2.2: Các Naphthoquinone vi lượng được tách chiết từ Drosera [21]

Droserone

Hydroxydroserone

Biramentaceonea Droserone-5-glucoside

Rossoliside

Hydroxydroserone-5-glucoside 2-Methylnaphtazarin-5-O-

D whittakeri D rotundifolia

D whittakeri D rotundifolia D ramentaceae

D rotundifolia D rotundifolia

D.spatulata D.rotundifolia D.rotundifolia D.spatulata

In vivo In vivo In vivo In vivo In vivo In vivo In vivo In vitro In vitro In vivo In vitro In vitro

a: Chất nhân tạo được sản xuất từ dịch chiết với dung môi hữu cơ b: Chất nhân tạo được sản xuất từ dịch chiết với dung môi methanol

Trang 24

Cấu trúc hóa học của các naphthoquinone và naphthoquinone-glucoside tách

chiết từ các loài Drosera[21]

R1 R2 R3 R4 R5

[1] CH3 H H H OH 7-Methyljuglone [2] H H CH3 H OH Plumbagin [3] H H CH3 OH OH Droserone

[4] OH H CH3 OH OH Hydroxydroserone [5] H H CH3 OH OGlc Droserone-5-glucoside

[6] OH H CH3 OH OGlc Hydroxydroserone-5-gluside R6 R7

[7] CH3 H Rossoliside

[8] H CH3 2-Methyl-hydrojuglone-4-glucoside

 Flavonoid

Drosera chứa phổ rất rộng các flavonoid, flavonoid glucoside nhƣ quercetin,

isoquercetin, kaempferol, astragalin, hyperin, gossypin và gossypitrin [20]

R3

R5 R1

OH

OGlc R7

OHR6

Trang 25

2.1.7 Phương pháp nhân giống  Nhân giống tự nhiên [3]

Nhân giống bằng cách gieo hạt

Thời gian gieo hạt tốt nhất là cuối mùa đông Hạt được gieo trên hỗn hợp đất trồng thích hợp Tốt nhất nên giữ hạt trong điều kiện mát và ẩm khoảng 6 tuần Sau đó cho hạt vào chậu đất có bọc túi nhựa và để trong điều kiện sáng Đến khi hạt nảy mầm thì bỏ túi nhựa ra và trồng các cây con vào chậu lớn

Nhân giống bằng cách cắt rễ

Cây bắt ruồi có thể được nhân giống từ các rễ dày Lấy những rễ khỏe từ cây mẹ, cắt thành đoạn dài 5 cm và đặt nằm ngang trên hỗn hợp đất dày 6 cm, phủ chúng với l lớp đất dày 1 cm Bọc những chậu đất này lại và đặt trong điều kiện sáng Khi cây mới bắt đầu mọc lên thì không bọc nữa Nhân giống bằng phương pháp cắt rễ tốt nhất vào đầu mùa tăng trưởng của cây

Nhân giống bằng cách cắt lá

Thời gian nhân giống tốt nhất là vào đầu mùa tăng trưởng của cây Lá được cắt ở cuống lá rồi đặt lên trên hỗn hợp đất và cát sao cho lông tuyến hướng lên Giữ cuống lá ngập trong đất nhưng không phủ lên các lông tuyến Bọc chậu đất lại và giữ trong điều kiện sáng Sự phát triển của cây xảy ra trong vài tuần

Nhân giống bằng cây mầm

Vào mùa thu, cây sẽ sản sinh ra những cây bé xíu (cây mầm) Thu thập những cây mầm này và trồng thành những cây mới Một cách để thu thập cây mầm là giữ những chậu chứa cây trút ngược xuống 1 tờ giấy và dùng tăm gạt cây mầm ra khỏi cây mẹ Gieo chúng trên hỗn hợp đất Cây sẽ mọc rễ và phát triển thành cây trưởng thành

 Nhân giống in vitro

Hầu hết những nghiên cứu trên thế giới về nuôi cấy mô Drosera đều cho thấy nhiều loài Drosera có tiềm năng nhân giống rất cao khi được nuôi cấy trong điều kiện in vitro thích hợp Cho đến nay, rất nhiều loài Drosera đã được nuôi cấy

Trang 26

in vitro thành công Hầu hết hạt, lá kết cụm như hoa, lá tách biệt, đôi khi cả rễ, hoa

và mầm cũng được sử dụng làm mẫu cấy để thiết lập quy trình nuôi cấy mô

Trong nước và trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về nhân giống in vitro cây D burmanni Vahl Cây sinh trưởng tốt nhất trên môi trường MS 1/2 (Murashige Skoog, với lượng khoáng cơ bản giảm một nửa), bổ sung than hoạt tính và casein hydrosylate 100 mg/l [3]

2.1.8 Tầm quan trọng 2.1.8.1 Ý nghĩa về sinh thái

Drosera burmanni Vahl thường mọc ở đất chua, vùng bạc màu nên là loài

chỉ thị cho vùng đất chua, bạc màu [14], [37]

2.1.8.2 Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa thực vật

Họ Droseraceae là một đối tượng điển hình cho các nghiên cứu về quá trình tiến hóa ở thực vật, bao gồm những thí nghiệm về phát triển và sinh lý học nhằm nghiên cứu vai trò chuyên biệt của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong tiến

hóa hình thái ở mức vĩ mô Bên cạnh đó, giống Drosera bao gồm rất nhiều loài

thích nghi với từng điều kiện môi trường khác nhau nên rất thích hợp cho những nghiên cứu về sự thích nghi cấu trúc và chức năng (bao gồm dinh dưỡng từ côn trùng và sự sản sinh mầm) trong các điều kiện môi trường khác nhau Ngoài ra, hạt phấn của giống cây này được tổ chức cố định thành bộ bốn, là trạng thái chuyển tiếp từ hình thức giao phấn sang tự thụ phấn trong quá trình tiến hóa của hệ thống thụ phấn ở thực vật

2.1.8.3 Giá trị dược tính

Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tiềm năng về giá trị dược

tính của Drosera (Bảng 2.3) Trong đó quan trọng nhất là các quinone, đặc biệt là

plumbagin, 7-methyljuglone và các flavonoid

Các hợp chất quinone được tìm thấy có khả năng chữa các căn bệnh hô hấp ở người như: hen suyễn, viêm phổi, ho gà và lao Chúng cũng có khả năng chống lại các virus, nấm, khuẩn và chống ung thư Tiêu biểu trong nhóm này là plumbagin và 7-methyljuglone [29].

Trang 27

Ngoài quinone, các flavonoid ly trích từ Drosera cũng có giá trị dược tính

cao như khả năng ức chế enzyme và chống oxi hóa Một số flavonoid có ảnh hưởng lớn đến chức năng của hệ miễn dịch Tiêu biểu nhóm này có thể kể đến quercetin và myricetin Chúng là những chất ức chế hiệu quả các enzyme glyoxylase mà những enzyme này giữ vai trò rất quan trọng trong việc điều hòa sự phân chia tế bào bằng cách giải độc -ketoaldehyde Trong y dược, quercetin được sử dụng để ngăn ngừa và điều trị ung thư, nó cũng có khả năng ức chế hoạt tính gây đột biến gen của benzopyrene, một hydrocacbon nhiều nhân thơm gây ung thư tiêu biểu

Bảng 2.3: Dược tính và các hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera [29]

Chống lão hóa và xơ cứng động mạch Grieve (1959)

Trang 28

Ở Vân Nam (Trung Quốc) Drosera burmanni Vahl (tên thông thường là cẩm

địa la) được dùng để chữa bệnh viêm ruột, lị, sưng, đau họng, ho do phổi nóng, khạc ra máu, đổ máu mũi và trẻ em bị cam tích Ở Quảng Tây, cây dùng để trị đòn ngã, tổn thương và bệnh mề đay [15]

Năm 1958 - 1959, bệnh viện Vinh dùng D burmanni Vahl dưới nhiều dạng

khác nhau (rượu thuốc, xi-rô, thuốc hãm, thuốc cao) để chữa bệnh ho gà [2]

Drosera burmanni Vahl cũng được công nhận là có giá trị trong việc chữa

các bệnh kiết lị, lao hạch, cam tích (suy dinh dưỡng nhưng bụng chướng to ở trẻ em) [9], [10]

2.1.8.4 Ứng dụng trong công nghiệp

Ở một số nơi trên thế giới, dịch chiết Drosera được dùng làm đông tụ sữa do giàu hàm lượng acid hữu cơ và enzyme Ngoài ra sắc tố của một số loài Drosera

còn được dùng để nhuộm vải [39]

Trang 29

2.1.8.5 Giá trị kinh tế

Sự đa dạng về giống loài, sự lạ mắt về hình thái khiến Drosera đem lại giá trị

kinh tế rất cao trong thị trường hoa cảnh thế giới (Hình 2.6) [42]

Hình 2.6: Mô ̣t số loa ̣i Drosera có giá trị kinh tế cao trên thế giới [42]

D brevicornis

D paleaceaD sewelliaeD pulchellaD pulchella

D villosa

D binata D binata D erythrorhiza D falconeri

Trang 30

2.1.9 Các nghiên cứu trong và ngoài nước  Trong nước

Đỗ Đăng Giá p (2003) đã khảo sát, thu thập, thuần dưỡng và thử nghiệm in vitro những loài cây bắt mồi ở khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phước Bửu [1]

Trần Thị Bích Chiêu (2004) khảo sát vòng đời và tái tạo chồi từ phát hoa cây

Drosera burmanni Vahl [13]

Quách Ngô Diễm Phương (2006) hoàn thiện qui trình nuôi cấy in vitro cây Drosera indica L và khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất naphthoquinone có

hoạt tính sinh học được tách chiết từ cây [12]

Hồ Thụy Bích Tuyền (2006) ly trích và khảo sát hoạt tính sinh học của hợp

chất quinone từ cây Drosera burmanni Vahl nuôi cấy in vitro [3]

Nguyễn Đa ̣i Hải (2006) đã n uôi cấy mô cây bắt ruồi (Drosera burmanni

Vahl) và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất chiết thô plumbagin [5]

 Thế giới

K Javaram và M N V Prasad (2005) đã công bố nhân nhanh chồi cây

Drosera burmanni Vahl trong môi trường MS có bổ sung 2 mg/l Kn và 1 mg/l BA

Sự tái sinh cây hoàn chỉnh từ phát hoa cũng được quan sát trên môi trường với nồng độ Kinetin thấp hơn (1 mg/l) Sự ra rễ cũng được thực hiện thành công trên môi trường MS cơ bản [24]

Mejia Hersikorpi và các cộng sự (2002) đã nhân giống thành công cây

Drosera rotundifolia từ lá của nó và tạo ra được cụm chồi đạt 20 - 30 chồi trên môi

trường MS có bổ sung 0,45 mg/l BA và 0,37 mg/l NAA [5]

Kawiak A., Królika A và Lojokowska E tái sinh D anglica, D binata đạt

số chồi lớn nhất trên môi trường Vacin và Went không có chất điều hòa sinh

trưởng, đối với D anglica là môi trường Fast bổ sung 0,05 M 6-benzyladenine

(BA) và 0,005 M -napthaleneacetic acid (NAA), còn môi trường nhân chồi tối ưu

cho D cuneifolia MS 1/2 bổ sung 0,2 M BA và 0,2 M NAA Môi trường lỏng làm gia tăng đáng kể khả năng nhân chồi của mẫu cấy D anglica và D binata [25]

Trang 31

Ingrid L I Hook (2001) đã nuôi cấy D binata, D rotundifolia, D capensis trong cả môi trường MS lỏng và có agar; nuôi cấy dịch huyền phù D rotundifolia trên môi trường Gamborg’s B5; nuôi dịch huyền phù D capensis trong môi trường

MS và McCowns Woody Plant (McC) [23]

Jozep Nahálka và cộng sự đã tạo mô sẹo và nuôi cấy thành công dịch huyền

phù để thu nhận plumbagin từ cây Drosophyllum lusitanicum trên môi trường MS

bổ sung 1 mg/l IBA và 0,5 mg/l NAA [28]

2.2 Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền phù tế bào để thu nhận hợp chất thứ cấp

2.2.1 Khái niệm hợp chất thứ cấp

Hợp chất thứ cấp hay sản phẩm trao đổi bậc hai là những sản phẩm được tạo ra trong tế bào nhờ các quá trình trao đổi chất xảy ra trong tế bào, sau đó chúng thoát ra khỏi tế bào đi ra môi trường ngoài

Phần lớn các sản phẩm bậc hai thường không có nhiều ý nghĩa sinh lý đối với bản thân tế bào Quá trình tạo ra các sản phẩm bậc hai chỉ thông qua những cơ chế chuyển hóa rất tự nhiên của tế bào, cũng có thể do sự sai lệch về thông tin di truyền trong tế bào dẫn đến hiện tượng sinh tổng hợp thừa [7].

Các loại hợp chất thứ cấp bao gồm những nhóm chính sau:

Các hợp chất trao đổi thứ cấp chứa nitrogen gồm: alkaloid, các độc chất chứa nitơ đã được glycosyl hóa, các amino acid không phải protein,…

Các chất trao đổi có phenol, isoprenoid, các polyketide Con đường tổng hợp ra chúng được trình bày trong sơ đồ 2.1 [43]

Trang 32

Hình các nhóm hợp chất thứ cấp chính trong thực vật

Sơ đồ 2.1: Con đường tổng hợp các nhóm hợp chất thứ cấp chính ở thực vật [43] 2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo

2.2.2.1 Khái niệm mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật…)

Mô sẹo có thể được kích thích tạo ra trong ống nghiệm bằng cách đưa một mẫu nhỏ của cây lên môi trường vô trùng có bổ sung hormone Dưới tác dụng của các hormone kích thích nội sinh hoặc các hormone nhân tạo, quá trình trao đổi chất

Trang 33

của tế bào sẽ thay đổi và bắt đầu hoạt động phân bào Vì vậy khi có sự mất cân bằng về các nồng độ hormone sinh trưởng trong thực vật thì mô sẹo hình thành Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo [7]

2.2.2.2 Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo

- Nhân giống in vitro các loài thực vật mà phương pháp nhân giống đỉnh sinh

trưởng ít hiệu quả hay khó thực hiện

- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

- Làm nguồn nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn cho chọn lọc dòng tế bào - Thu nhận các sản phẩm hoạt chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao - Nuôi cấy huyền phù tế bào

2.2.3 Nuôi cấy dịch huyền phù 2.2.3.1 Khái niệm huyền phù tế bào

Huyền phù tế bào là một môi trường lỏng được lắc liên tục, trong đó có sự hiện diện của các tế bào soma cô lập hoặc những cụm nhỏ các tế bào có khả năng sinh phôi có thể tái sinh thành một thực vật nguyên vẹn [7]

2.2.3.2 Nguyên tắc tạo huyền phù

Huyền phù được tạo ra từ những mảnh mô sẹo trong một môi trường lỏng được lắc liên tục Muốn cho huyền phù được tốt thì phải tạo được mô sẹo tốt tức là mô sẹo phải bao gồm các tế bào có khả năng sinh phôi Trong quá trình tạo huyền phù, những điều kiện sinh trưởng như môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ hay thành phần các chất kích thích cũng tương tự như lúc tạo mô sẹo hoặc nếu có

thay đổi thì chỉ thay đổi rất ít

Trong môi trường lỏng, từ mô sẹo có thể phóng thích ra những tế bào riêng lẻ hay những cụm tế bào từ vài chục đến cả trăm tế bào giúp tăng diện tích hấp thu các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy Ngoài ra hoạt động của máy lắc

cũng giúp cho sự trao đổi khí giữa môi trường và tế bào được thuận lợi hơn

Một huyền phù tế bào được cho là lý tưởng khi nó là một dịch mịn, hầu như gồm những yếu tố có khả năng sinh phôi, nói cách khác là những tế bào cô lập hay

Trang 34

hợp thành từng nhóm nhỏ từ vài đến khoảng 20 tế bào có khả năng duy trì tính toàn năng và tiến hóa thành phôi soma trên môi trường tái sinh trong điều kiện thích hợp

2.2.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo huyền phù tế bào [7]

- Hệ thống nuôi cấy - Ánh sáng, nhiệt độ - Mật độ tế bào khởi đầu - Môi trường nuôi cấy

- Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật - Sự tăng trưởng và cấy chuyền huyền phù tế bào - Điều kiện môi trường

- Cụm tế bào trong dịch huyền phù

2.2.3.4 Các phương pháp nuôi cấy huyền phù hiện nay [6], [20]

Có nhiều phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào khác nhau đã được phát triển, nhưng có hai phương pháp chính :

 Nuôi cấy gián đoạn

Tế bào thực vật được nuôi trong một thể tích (100 ml - 10 lít) hỗn hợp môi trường Trong giai đoạn phát triển của tế bào, số lượng tế bào ban đầu gia tăng cho đến khi dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt hoặc có sự tích lũy chất trao đổi đến mức kìm hãm Các môi trường nuôi cấy quy mô nhỏ được chuyển động liên tục trên máy lắc hay trong bình phản ứng được phối trộn đều Môi trường trong bình chứa thường chiếm 1/5 thể tích Máy lắc được điều chỉnh ở vận tốc 30 - 180 vòng/phút biên độ 3 cm Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm

Nhược điểm của phương pháp là không sử dụng trong nghiên cứu dài hạn về sự phát triển tế bào và sự trao đổi chất, khó nhận được sự ổn định trong sản xuất Các tế bào nuôi cấy gián đoạn không đồng nhất về kích thước và cấu tạo Để đảm bảo yêu cầu nuôi cấy phải cấy chuyền thường xuyên quần thể tế bào vào môi trường mới sau những khoảng thời gian bằng nhau

Trang 35

Hình 2.7: Hệ thống nuôi cấy gián đoạn qui mô nhỏ trên các máy lắc [44]. Nuôi cấy liên tục

Đây là một phương pháp quan trọng được dùng để sản xuất hợp chất sơ cấp hay thứ cấp trên quy mô lớn Kỹ thuật này đòi hỏi phải có hệ thống thiết bị phức tạp Sự chuyển động của môi trường nuôi cấy lớn trong các bồn phản ứng sinh học được thực hiện bằng cách khuấy với một turbin và (hoặc) sục không khí vô trùng vào môi trường từ dưới đáy Phương pháp nuôi cấy này cho phép giữ vô trùng cả hệ thống trong một thời gian dài

Trang 36

2.2.3.5 Các điều kiện nuôi cấy dịch tế bào ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp

- Chất điều hòa sinh trưởng (hormone thực vật) bao gồm các auxin như: IAA, NAA, 2,4-D ; các cytokinin như: BAP, kinetin…

- Nguồn đạm - Nguồn carbon - Ánh sáng

- Các yếu tố khác: pH môi trường, nồng độ phosphate, các loại khí (O2, CO2, …)

2.2.4 Các phương pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù [22]

Các phương pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù có thể kể đến:

2.2.4.1 Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy

Khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp của tế bào có thể chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố vật lý (như nhiệt độ, độ thông khí, tốc độ lắc, ánh sáng, pH…) và hoá học (như chất điều hoà tăng trưởng thực vật), thành phần các chất trong môi trường nuôi cấy…Tuỳ từng loại tế bào mà sự đáp ứng với các yếu tố kể trên sẽ khác nhau Khi xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu thì sự sản xuất và tích luỹ các

hợp chất thứ cấp trong tế bào in vitro sẽ cao hơn so với cây trồng ngoài thiên nhiên

Phương pháp này đã đạt được thành công lớn trong trường hợp của shikonin và berberine [31]

2.2.4.2 Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao

Hệ thống tế bào nuôi cấy là một quần thể tế bào có nhiều kiểu gen khác nhau, do đó các đặc tính sinh lý của tế bào sẽ khác nhau Phương pháp chọn lọc dòng tế bào là một kỹ thuật hữu hiệu để tăng sản lượng các hợp chất thứ cấp

2.2.4.3 Bổ sung tiền chất

Sự bổ sung các tiền chất hữu cơ xuất phát từ quan niệm cho rằng những hợp chất này có thể là chất trung gian hoặc là chất khởi đầu của một con đường sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp nào đó Sự bổ sung các tiền chất của quá trình sinh

Trang 37

tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn vào môi trường nuôi cấy giúp nâng cao hiệu quả sản xuất của tế bào trong một số trường hợp xác định Phương pháp này sẽ có giá trị khi giá thành của các tiền chất không quá đắt

2.2.4.4 Cố định tế bào

Trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để thu nhận các sản phẩm thứ cấp, việc cố định tế bào giúp kéo dài thời gian sử dụng, đặc biệt là trong các hệ thống phản ứng sinh học Mặt khác, những tế bào cố định ít bị tác động bởi điều kiện môi trường hơn so với tế bào tự do Tế bào cố định thường là những tế bào có khả năng tiết các sản phẩm thứ cấp ra môi trường ngoài Tế bào ở trạng thái cố định đôi khi tạo ra được các hợp chất thứ cấp có sản lượng cao hơn tế bào ở trạng thái lơ lững tự do Các chất được sử dụng để cố định tế bào là agarose, carageenan, alginate, agar, các sợi propylen,… Sự cố định tế bào giúp tăng sản xuất các hợp chất thứ cấp nhưng cũng không loại trừ khả năng chính những chất cố định lại là tác nhân kích thích sự sản xuất các hợp chất thứ cấp

2.2.4.5 Cảm ứng sự phân hoá mô

Dịch treo tế bào thường được sử dụng để thu nhận các sản phẩm thứ cấp Tuy nhiên, gần đây, nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc nuôi cấy những mô đã phân hoá như nuôi cấy thân, chồi, hay rễ tơ,…nhằm thu nhận hợp chất thứ cấp Các nghiên cứu chứng minh rằng có mối quan hệ mật thiết giữa sự sản xuất các hợp chất thứ cấp với sự phân hoá tế bào và sự phát sinh hình thái của thực vật

2.2.4.6 Nhân tố cả m ứng (elicitor)

Theo Rhoberts và Shuler (1999), tiến trình cảm ứng biểu hiện gene của các enzyme xúc tác tổng hợp các chất biến dưỡng thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật được biết đến như là sự cảm ứng (elicitation) [26] Elicitation trong sản suất hợp chất thứ cấp của tế bào thực vật xảy ra do sự tiếp xúc giữa tế bào thực vật với các biotic và abiotic elicitor Thuật ngữ “elicitor” được sử dụng đầu tiên cho các tác nhân kích thích bất kỳ dạng phản ứng phòng vệ nào của cây với các bệnh lý xuất hiện trên đồng ruộng Thực vật có thể sản xuất ra các chất kháng sinh biến dưỡng thứ cấp như các phytoalexin trong các phản ứng chống lại sự tấn công của vi khuẩn

Trang 38

Hình 2.9: Sắc ký cô ̣t [47]

Do đó, các vi sinh vật (đặc biệt là nấm và các thành phần của chúng) đã được sử dụng rộng rãi để cảm ứng sản xuất hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật [18]

2.3 Các kỹ thuật sử dụng trong bài luận văn

2.3.1 Phương pháp ly trích - thu nhận hợp chất [8] 2.3.1.1 Sắc ký cột

Luận văn sử dụng hệ thống sắc ký cột hở với chất hấp thụ là silica gel trong qui trình ly trích và thu nhận hợp chất anthraquinone (Hình 2.9)

 Khái niệm

Sắc ký cột hở là một hệ thống vật lý trong đó có một cột được nạp chặt chẽ bởi một chất hấp thụ và có một pha lỏng di động chảy xuyên ngang qua Tùy thuộc và loại chất hấp thu để nạp cột và pha động, người ta phân biệt một số cơ chế tách: sắc ký hấp thu, sắc ký phân chia, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực…

 Nguyên tắc của sắc ký cột

Sắc ký cột căn cứ trên khả năng mà phân tử chất tan có thể tương tác với pha tĩnh Những tương tác này sẽ lần lượt làm chậm sự di chuyển của những chất tan khác nhau, khi chúng di chuyển xuyên qua chất hấp thụ để ra khỏi cột Các

Trang 39

tương tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể là nối hydrogen, nối Val der Waal, tương tác lưỡng cực - lưỡng cực, tương tác acid - bazơ, sự tạo phức

 Chất hấp thụ silica gel

Silica gel là polimer ba chiều của những tứ diện oxid silicon SiO2.H2O Đây là những nguyên liệu có lỗ rỗng Hạt silica gel sử dụng cho sắc ký cột có diện tích bề mặt khoảng 100 - 800 m2

/g, đường kính hạt trung bình là 40 - 200 m và các lỗ rỗng trên bề mặt có đường kính trung bình 40 - 300 A0

Trên bề mặt các hạt silica gel có mang những nhóm silanol-OH Đây là trung tâm hoạt động có thể tạo nên những nối hydrogen mạnh với những hợp chất được sắc ký Vì thế, những hợp chất nào có khả năng tạo nối hydrogen mạnh hợp chất đó sẽ bị silica gel giữ mạnh lại trong cột Như vậy những hợp chất phân cực mạnh có chứa nhóm chức acid carboxilic, amin, amid sẽ hấp thụ mạnh vào silica gel trong khi những hợp chất kém phân cực như alkan, terpen (những hợp chất không chứa các nhóm chức có thể tạo nối hydrogen) sẽ ít bị giữ Ngoài ra một hợp chất có thể bị silica gel giữ lại mạnh hay yếu còn phụ thuộc vào độ phân cực của dung môi ly giải

 Nguyên tắc cơ bản khi sử dụng sắc ký cột

Lựa chọn dung môi giải ly: trong loại sắc ký cột hấp thu, hợp chất không phân cực sẽ được ly giải khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau Thông thường người ta bắt đầu bằng dung môi không phân cực để loại tương đối các hợp chất không phân cực ra khỏi cột và tăng dần độ phân cực của dung môi giải ly để đuổi các hợp chất có tính phân cực mạnh hơn Nhưng nếu thay đổi dung môi phân cực hơn một cách đột ngột sẽ làm gãy cột

Kích thước cột và lượng mẫu chất: Kích cỡ của cột tùy thuộc vào số lượng mẫu chất cần phân tách Kích thước cột cần đạt tỷ lệ về chiều cao – đường kính là 8:1 Trọng lượng chất hấp thụ và trọng lượng mẫu phải tuân theo một tỷ lệ tương ứng Trung bình thì trọng lượng chất hấp thụ phải lớn hơn 25 - 50 lần trọng lượng của mẫu cần sắc ký (tính theo trọng lượng) Tuy nhiên, với những hỗn hợp mà các hợp chất không dễ dàng tách riêng thì cần sử dụng cột lớn hơn với số lượng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100 - 500 lần)

Trang 40

Hình 2.10: Mô hình sắc ký nhanh cô ̣t khô [8]

2.3.1.2 Sắc ký nhanh cột khô (Dry – Column Flash Chromatography) [8]  Khái niệm

Sắc ký nhanh cột khô là một biến đổi của sắc ký cột nhanh, sử dụng áp suất kém để gia tăng vận tốc ly giải của pha động Kỹ thuật này khác với sắc ký nhanh là cột sắc ký được rút khô sau mỗi phân đoạn thu được

 Chất hấp thụ

Sử dụng silica gel loại dùng cho sắc ký lớp mỏng (Merk 60H hoặc 60 G; tức 40 - 15 m hoặc alumina loại dùng cho sắc ký lớp mỏng (10 m, diện tích bề mặt riêng lớn: 500 m2

.g-1)

 Mô tả hệ thống

- Phễu lọc xốp bằng thủy tinh Độ xốp của lỗ thuộc loại 3 hoặc loại D Phễu có đủ kích cỡ lớn nhỏ (loại 100; 150; 250; 500 ml…) thích hợp với lượng mẫu cần sắc ký (Bảng 1.4)

- Bình tam giác

- Hệ thống tạo áp suất bằng vòi nước (20 - 70 mmHg; chỉ cần áp suất vừa phải)

Định dạng
Số trang	108
Dung lượng	5,25 MB