Tài liệu Chương 5: Bản chất Hóa học và Tái bản của Vật chất Di truyền pdf

147 Chương Bản chất Hóa học Tái Vật chất Di truyền Trước tiên, cần nắm đặc tính thiết yếu vật chất di truyền sau đây: (1) Đặc tính thơng tin sinh học: chứa đựng thông tin cần thiết cho việc xác định cấu trúc tất protein đặc thù loài (các gene cấu trúc) điều khiển hoạt động sinh trưởng, phân chia biệt hoá tế bào; (2) Đặc tính tái bản: khả tự chép xác, đảm bảo thơng tin di truyền hệ sau giống với hệ trước; (3) Đặc tính hoạt động gene: gene gene có khả tổng hợp sản phẩm phân tử tham gia vào động sống tế bào (phiên mã dịch mã); (3) Đặc tính biến đổi: khả bị biến đổi từ nhiều trình khác (như đột biến, tái tổ hợp, yếu tố di truyền vận động) Chính biến đổi đa dạng tạo nguồn biến dị di truyền đa dạng phong phú cho chọn lọc tiến hoá Ngày biết vật chất di truyền nucleic acid mà hầu hết sinh vật loại deoxyribonucleic acid (DNA) số virus ribonucleic acid (RNA) Trong chương này, tìm hiểu thành phần hóa học cấu trúc chế tái vật chất di truyền đại phân tử DNA RNA I Bằng chứng vật chất di truyền nucleic acid Các thí nghiệm biến nạp vi khuẩn Năm 1928, Frederick Griffith đặt tảng cho việc xác định DNA vật chất di truyền thơng qua thí nghiệm biến nạp (transformation) phế cầu khuẩn Streptococcus pneumoniae Các vi khuẩn kiểu dại có vỏ bọc polysaccharide mọc thành khuẩn lạc hay dòng đặc trưng dạng nhẵn (S: smooth); chúng coi độc (virulent) có khả gây viêm phổi làm chuột chết Một nòi đột biến khả hình thành vỏ bọc mọc thành khuẩn lạc bé, xù xì (R: rough); chúng vi khuẩn không độc (avirulent) Griffith tiến hành thí nghiệm khác nhận thấy rằng: (1) Nếu tiêm vi khuẩn sống nòi S, chuột chết; (2) Nếu tiêm vi khuẩn sống nòi R, chuột sống; (3) Nếu tiêm vi khuẩn sống nòi S bị giết chết nhiệt, chuột sống bình thường; (4) Nhưng tiêm hỗn hợp gồm vi khuẩn nòi R sống vi khuẩn nòi S bị giết chết nhiệt, kết bất ngờ chuột chết Từ mẫu máu chuột chết ơng phân lập vi khuẩn nịi S cịn sống Điều chứng tỏ 148 cách mảnh vỡ tế bào vi khhuẩn nòi S bị giết nhiệt xâm nhập vào tế bào R sống làm biến đổi thành vi khuẩn S sống gây độc Quá trình gọi biến nạp chất mảnh vỡ tế bào S gây biến nạp đặc thù gọi tác nhân biến nạp (transformating agent) Vậy chất tác nhân gì? Nịi S sống Nòi R sống Nòi S chết S chết + R sống Hình 5.1 Thí nghiệm Griffith (từ trái sang 1-4 mô tả bài) Trong mười năm trời kể từ sau thí nghiệm Griffith, Oswald Avery với MacLeod McCarty tiến hành trở lại thí nghiệm biến nạp ống nghiệm (in vitro) Họ tinh chiết thành phần tác nhân gây biến nạp cho enzyme khác tác động thăm dị lên hoạt tính chất chiết Kết cho thấy hoạt tính chất chiết bị phân hủy deoxyribonuclease (DNase) - enzyme có khả phân cắt làm suy thối DNA, mà không bị tác động phân hủy ribonuclease (RNase) - enzyme làm suy thoái RNA, protease (như trypsin chymotrypsin) - enzyme phân giải protein Vào năm 1944, nhóm nghiên cứu Avery chứng minh rằng: DNA vật chất mang thông tin di truyền, protein Tính ổn định hàm lượng DNA sinh vật bậc cao Trước Avery cs cơng bố kết này, đa số nhà hóa sinh học tin gene protein Vì sau kết hiển nhiên đó, nhiều nhà khoa học cịn nghi ngờ tính phổ qt Vào lúc này, nghiên cứu chất hóa học nhiễm sắc thể khẳng định rằng, hầu hết DNA khu trú nhiễm sắc thể nhân Hơn nữa, phân tích hóa học A.E.Mirsky H.Ris 149 (USA) R.Vendrely (France) cho thấy hàm lượng DNA nhiễm sắc thể lưỡng bội luôn ổn định thể định hai lần hàm lượng DNA tế bào tinh trùng đơn bội Chẳng hạn, số liệu tương ứng bò xấp xỉ 6,6 3,3 picogam (1pg =10-12g) Các thí nghiệm virus 3.1 Thí nghiệm Hershey-Chase Năm 1952, Alfred D.Hershey Martha Chase tiến hành nghiên cứu đánh dấu đồng vị phóng xạ loại thể thực khuẩn (bacteriophage, thường nói gọn phage) gọi T2 vốn ký sinh vi khuẩn Escherichia coli Phage chứa lõi DNA lớp vỏ bảo vệ protein Dựa vào đặc điểm nguyên tử lưu huỳnh (S: sulfur) có protein nguyên tử phosphor (P) có nucleic acid, họ đánh dấu protein chất đồng vị phóng xạ S35 DNA P32 cách cho phage sinh trưởng mơi trường có S35 sinh sản có S32 Các virus đánh dấu sử dụng để theo dõi thành phần từ virus ban đầu vào tế bào chủ sau xuất phage hệ Hạt virus DNA Vỏ virus Hình 5.2 Thí nghiệm Hershey-Chase (a) Phage bám bề mặt màng tế bào vi khuẩn; (b) bơm lõi DNA vào để lại lớp vỏ protein bám ngoài; (c) tái bản, phiên mã tổng hợp hàng loạt protein virus; (d) lắp ráp lõi + vỏ để tạo virion; (e) enzym lysozyme phá hủy vách tế bào vi khuẩn phóng thích phage hệ Kết cho thấy phage hệ có DNA dạng ban đầu khơng có protein dạng (hình 5.2) Hơn nữa, lớp vỏ protein dạng ban đầu bám bên màng tế bào vi khuẩn, không thực chức sau DNA tiêm vào vi khuẩn Như vậy, vật chất di truyền phage T2 DNA, khơng phải protein 3.2 Thí nghiệm chứng minh vật chất di truyền số virus RNA 150 Sau này, năm 1956 A.Gierer chứng minh RNA tinh từ virus đốm thuốc (tobacco mosaic virus = TMV) có khả lây nhiễm khơng có protein thuộc virus Kết phân tích virus hệ cho thấy chúng hồn toàn giống với virus sinh từ cho lây nhiễm virus nguyên vẹn Bằng chứng RNA thành phần di truyền TMV Fraenkel Conrat B.Singer tái xác nhận năm 1957 thí nghiệm "lắp ráp chéo" lõi RNA vỏ protein hao kiểu TMV S HR II Thành phần hóa học cấu trúc DNA Các nucleic acid (DNA, RNA) polymer sinh học, có trọng lượng phân tử lớn, gồm nhiều đơn phân (monomer) nucleotide nối với tạo thành chuỗi hay mạch polynucleotide - cấu trúc sơ cấp phân tử nucleic acid Cấu trúc nucleotide liên kết glycosid Hình 5.3 Bốn loại base DNA cấu trúc nucleotide (dAMP) Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, gốc đường pentose bốn loại base nitơ (các dẫn xuất purine pyrimidine) Về cấu trúc, nhóm phosphate nối với gốc đường nguyên tử carbon số (C5') liên kết ester base nitơ nối với gốc đường nguyên tử carbon số (C1') liên kết β-glycosid (Hình 5.3) Lưu ý: (1) Các base thành phần đặc trưng qui định tên gọi nucleotide mang chúng Trong DNA chứa bốn loại base bản: 151 adenine (A), thymine (T), guanine (G) cytosine (C); RNA chứa bốn loại khác thymine thay uracil (U) (2) Đường pentose RNA D-ribose DNA 2-deoxy-Dribose (ký hiệu D-: dạng đường quay phải để phân biệt với dạng Lquay trái khơng có thành phần nucleic acid tự nhiên) Hai gốc đường khác C2'; ribose nhóm -OH deoxyribose -H Sự có mặt thành phần đường nucleotide phân biệt hai loại ribonucleotide deoxyribonucleotide cấu tạo nên hai loại nucleic acid tương ứng RNA DNA (3) Cấu trúc "base + đường" gọi nucleoside; cách đọc viết tắt tương ứng với base A, T, G C DNA sau: deoxyadenosine (dA), deoxythymidine (dT), deoxyguanosine (dG) deoxycytidine (dC); cách gọi cho nucleoside RNA cần bỏ tiền ngữ "deoxy" (d), thay cho dT uridine (U) Và đọc đầy đủ tên gọi nucleotide cần thêm "đi" 5'-monophosphate, ví dụ hình 5.3 (4) Tính phân cực cấu trúc nucleotide cịn thể nhóm hydroxyl (-OH) hai vị trí C5' (hình thành liên kết ester với nhóm phosphate để tạo nucleotide) C3' (hình thành liên kết phosphodiester với nucleotide khác để tạo chuỗi polynucleotide) Cấu trúc chuỗi polynucleotide Đầu 5' Liên kết 3',5'-phosphodiester chiều 5'→3' chuỗi polynucleotide Đầu 3' Hình 5.4 Cấu trúc chuỗi polynucleotide DNA 152 Các nucleotide DNA RNA nối với mối liên kết 3',5'-phosphodiester gốc đường nucleotide với nhóm phosphate nucleotide kế tiếp, tạo thành chuỗi polynucleotide (nhờ xúc tác enzyme tương ứng DNA- RNA-polymerase) Vì chuỗi kéo dài theo chiều 5'→3' (đầu 5' mang nhóm phosphate tự đầu 3' chứa nhóm -OH tự do) có khung gồm gốc đường phosphate luân phiên nhau, base nhờ có trình tự đọc theo chiều xác định (hình 5.4) Thơng thường người ta biểu diễn trình tự base 5'→3' theo chiều từ trái sang phải Ví dụ cho thấy chuỗi RNA DNA khác base U T gốc đường nucleotide chúng chuỗi RNA 5'- AUAGACUACG-3' chuỗi DNA 5'- dAdTdAdGdAdCdTdAdCdG-3' Thành phần hóa học cấu trúc chuỗi xoắn kép DNA 3.1 Thành phần hóa học DNA Năm 1949, E.Chargaff áp dụng phương pháp sắc ký giấy vào phân tích thành phần hóa học DNA lồi khác (Bảng 5.1; xem Watson et al 1987, tr.73) khám phá ba điểm quan trọng sau đây: (1) Số lượng bốn loại base DNA không nhau; (2) Tỷ lệ tương đối base không ngẫu nhiên; tất mẫu DNA nghiên cứu tồn mối tương quan hàm lượng (%) base sau: A ≈ T G ≈ C, nghĩa tỷ số (A+G)/ T+C) ≈ 1; (3) Mỗi lồi có tỷ lệ (A+T)/(G+C) đặc thù Bảng 5.1 Thành phần base DNA số loài (từ nhiều tác giả) Sinh vật A% T% G% C% Phage lambda Phage T7 Mycobacterium tuberculosis Escherichia coli Aspergillus niger (nấm mốc) Saccharomyces cerevisiae Triticum (lúa mỳ) Zea mays (ngô) Salmo salar (cá hồi) Gallus domestica (gà nhà) Homo sapiens (người) 21,3 26,0 15,1 24,7 25,0 31,3 27,3 26,8 29,7 29,5 30,9 22,9 26,0 14,6 23,6 24,9 32,9 27,1 27,2 29,1 27,7 29,4 28,6 24,0 34,9 26,0 25,1 18,7 22,7 22,8 20,8 22,4 19,9 27,2 24,0 35,4 25,7 25,0 17,1 22,8 23,2 20,4 20,4 19,8 A+G T +C A+T G+C 1,00 1,00 1,00 1,03 1,00 1,00 1,00 0,98 1,02 1,08 1,01 0,79 1,08 0,42 0,93 1,00 1,79 1,19 1,17 1,43 1,34 1,52 153 3.2 Cấu trúc chuỗi xoắn kép Vào năm 1951-52, việc nghiên cứu cấu trúc ba chiều DNA phân tích nhiễu xạ tia X bắt đầu Maurice Wilkins Rosalind Franklin Các ảnh chụp 1952 (hình 5.5) gợi ý DNA có cấu trúc xoắn gồm hai ba chuỗi Lúc Anh cịn có số nghiên cứu khác nhằm phát triển lý thuyết nhiễu xạ Linus Pauling để tìm hiểu cấu Hình 5.5 Ảnh chụp DNA tinh thể tia X Franklin trúc DNA Tuy nhiên, giải pháp đắn chuỗi xoắn kép (double helix) bổ sung James Watson Francis Crick đưa năm 1953 Mơ hình (hình 5.6) phù hợp với số liệu Wilkins Franklin Chargaff Sự kiện mở bước ngoặt cho cho đời phát triển với tốc độ vũ bão di truyền học phân tử sinh học nói chung Liên kêt hydro Bộ khung đường-phosphate Hình 5.6 Các mơ hình cấu trúc DNA Bên trái mơ hình khơng gian lấp đầy Hình chuỗi xoắn duỗi thẳng cho thấy cặp base hai khung đường-phosphate hai bên, với thành phần mũi tên Bên phải sơ đồ chuỗi xoắn kép với hai sợi đối song song Mơ hình Watson-Crick hay DNA dạng B có đặc điểm sau: 154 (1) DNA gồm hai chuỗi đối song song (antiparallel) uốn quanh trục trung tâm theo chiều xoắn phải, với đường kính 20Ao (1angstrom = 10-10m), gồm nhiều vòng xoắn lặp lại cách đặn chiều cao vòng xoắn 34 Ao, ứng với 10 cặp base (base pair, viết tắt bp) (2) Các khung đường-phosphate phân bố mặt chuỗi xoắn base nằm bên trong; chúng xếp mặt phẳng song song với thẳng góc với trục phân tử, với khoảng cách trung bình 3,4 Ao (3) Hai sợi đơn gắn bó với mối liên kết hydro (vốn lực hóa học yếu) hình thành cặp base đối diện theo nguyên tắc bổ sung "một purine - pyrimidine" Cụ thể là, DNA tồn hai kiểu kết cặp base đặc thù A-T (với hai liên kết hydro) G-C (với ba liên kết hydro) (xem hình 5.6 5.7) (4) Tính chất bổ sung theo cặp base dẫn đến bổ sung trình tự base hai sợi đơn chuỗi xoắn kép Vì vậy, DNA sợi kép có: A = T G = C (quy luật Chargaff); nghĩa (A+G) = A+T A+G đặc thù cho loài (T+C) hay tỷ số = , cịn tỷ lệ T +C G+C Hình 5.7 Hai kiểu kết cặp base DNA Cặp G-C nối với ba liên kết hydro (biểu thị đường chấm), có hình dạng xác cặp A-T nối với hai liên kết hydro Các mũi tên vị trí liên kết base với gốc đường Cần lưu ý rằng, hai đặc điểm quan trọng cấu trúc DNA phân cực ngược chiều hai sợi đơn (5'→3' 3'→5') nguyên tắc bổ sung cặp base Hai đặc điểm cho phép giải thích cách 155 chế di truyền cấp độ phân tử (tái bản, phiên mã dịch mã) Sơ lược đặc tính hóa lý nucleic acid 4.1 Các dạng DNA Mơ hình Watson-Crick hay DNA dạng B cấu trúc phổ biến Tuy nhiên, sau người ta phát nhiều dạng xoắn phải khác (A,C,D ); chúng có số biến đổi so với DNA-B (xem bảng 5.2) Bên cạnh dạng DNA xoắn phải, từ năm 1979 Alexander Rich đồng phát thêm dạng DNA xoắn trái nay, gọi DNA-Z Dạng DNA có khung zigzag uốn gập khúc theo chiều trái, vòng xoắn dài 45,6Ao chứa 12 cặp base (hình 5.8 bảng 5.2) DNA dạng Z chứa sợi gồm purine pyrimidine xếp xen kẻ nhau, thí dụ: GCGCGCGC -CGCGCGCG-Mặc dù Rich khám phá DNA-Z nghiên cứu hợp chất mơ hình, song cấu trúc dường có mặt tế bào sống tỷ lệ nhỏ chưa thật hiểu rõ chức Hình 5.8 DNA-B DNA-Z Bảng 5.2 Đặc điểm dạng DNA - A, B, C Z Dạng Chiều xoắn Số bp/vịng xoắn Đường kính chuỗi xoắn A Phải 11,0 23Ao B Phải 10,0 19Ao C Phải 9,3 19Ao Z Trái 12,0 18Ao *Nguồn: J.Kimball (từ internet) Về chi tiết, xem Watson et al 1987, tr.249 4.2 Biến tính hồi tính DNA 4.2.1 Khái niệm biến tính hồi tính Một đặc điểm quan trọng DNA hai mạch đơn bổ sung gắn với mối liên kết hydro, vốn lực liên kết hóa học yếu nên chúng bị phân hủy tác dụng enzyme, lượng làm cho hai mạch đơn chuỗi xoắn kép tách rời Nhờ DNA tái bản, gene biểu 156 sản phẩm Mặt khác, DNA phục hồi trở lại trạng thái ban đầu theo trình ngược lại, nghĩa có tính thuận-nghịch Bằng thực nghiệm, người ta chứng minh điều cách sử dụng tác nhân vật lý hóa học khác Chẳng hạn, đun nóng từ từ phân tử DNA lên tới nhiệt độ gần 100oC (thường 90-95oC), liên kết hydro chúng bị phá hủy hoàn toàn hai sợi bổ sung tách Hiện tượng gọi biến tính (denaturation) Ngược lại, làm nguội từ từ dung dịch đốt nóng chứa DNA bị biến tính hịan tồn, sợi đơn thường cặp đôi với sợi bổ sung chúng làm phục hồi chuỗi xoắn kép lúc đầu Hiện tượng gọi hồi tính (renaturation) Vï ng DNA giµu A-T đ- ợ c tá ch thành búp ng sợ i đơn ã Tm phụ thuộc vào hàm l- î ng G-C cña DNA % hyperchromicity DNA sợi kÐp giàu GC ch- a bịnóng chảy DNA E coli vớ i 50% G-C, cã Tm b»ng 69 o C 50 60 ã Cá c vù ng giàu A-T tá ch tr- c, cá c vù ng giàu G-C tá ch sau 70 80 Nhiệ độ oC t ã Hàm l- ợ ng G-C có thểđ- ợ c xá c ®Þ tõ Tm cđa DNA nh Hình 5.9 DNA biến tính phần Hình 5.10 Sự phụ thuộc Tm vào hàm lượng GC DNA khác Ở nhiệt độ vừa phải có mặt tác nhân gây ổn định alkali hay formamide, phân tử DNA bị biến tính phần Khi vùng giàu cặp AT tách phần trước, vùng giàu cặp GC giữ ngun đặc tính xoắn kép Điều lý giải cặp AT có hai liên kết hydro rõ ràng bền so với cặp GC có tới ba mối liên kết Nhiệt độ mà sợi DNA bị biến tính hay tách nửa gọi nhiệt độ nóng chảy (melting temperature), hay Tm Tm điểm pha phuyển tiếp (hình 5.9) tùy thuộc vào hàm lượng G-C DNA, nghĩa đặc trưng cho DNA lồi Ví dụ, DNA E coli với 50% G-C có Tm 69oC (hình 5.10) Nói chung, hàm lượng GC DNA biến thiên từ 22% nấm mốc nhầy Dictyostelium đến 73% Mycobacterium phlei Điều gây hiệu mạnh lên đặc tính hóa lý DNA, đặc biệt lên nhiệt độ nóng chảy, vốn tăng tuyến tính với hàm lượng GC Nhiệt độ nóng chảy (Tm) DNA nhiệt độ mà hai sợi bị biến tính hay tách nửa Ngoài ra, nồng độ ion thấp dung môi hữu thúc đẩy biến tính DNA 164 5'- TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG -3' Nhìn chung, gene người có đặc điểm sau: (1) Về gene nhân, kích thước gene đơn bội ~3,2 tỷ bp; tất mức độ phức tạp nằm lớp DNA đơn (~75%) Bộ gene người coi có chứa khoảng 25.000 gene mã hóa protein Trong đa phần gene phân đoạn với cấu trúc phức tạp (xem chương 6) Các gene chứa từ 75 exon (đoạn mã hóa protein) có chiều dài biến thiên từ 100 khoảng 2.400.000 bp (gene gây rối loạn dưỡng DMD xem dài với 2,4 triệu bp chiếm ~ 1,5% nhiễm sắc thể X mà định khu) Trình tự Alu có mặt khắp gene (2) Về gene ty thể, gene mạch vòng với 16.569 bp chứa ~ 40 gene V Tái DNA Sau khám phá cấu trúc DNA, Watson Crick đề xuất ba kiểu truyền thơng tin di truyền có tế bào: (1) Tái (replication): DNA→DNA; (2) Phiên mã (transcription): DNA→RNA; (3) Dịch mã (translation): RNA→Protein Các kênh truyền thông tin di truyền gọi Giáo lý Trung tâm (Central Dogma) sinh học phân tử Sau đến năm 1970, Baltimore Temin qua nghiên cứu chế hoạt động gene RNA virus Sarcoma bổ sung thêm kênh RNA→DNA, gọi phiên mã ngược (reverse transciption) ngược hướng với kênh phiên mã phổ biến Điều minh họa hình 5.16 Dịch mã Phiên mã Tái Phiên mã ngược Hình 5.16 Các kiểu truyền thơng tin di truyền (trái), mơ hình tái DNA theo kiểu bán bảo toàn Watson Crick đề xuất Các nguyên tắc đặc điểm chung tái DNA Tái (replication) đặc tính quan trọng vật chất di truyền, nhờ sống trì liên tục, lồi bảo tồn tính chất đặc trưng mình, thường giống bố mẹ Vậy DNA gene nói chung tái nào? 165 Trong khám phá mơ hình cấu trúc DNA, Watson Crick đưa dự đốn xác (dựa nguyên tắc bổ sung cặp base) tái DNA phải diễn theo kiểu bán bảo tồn (semiconservative) hình 5.16 Đến 1956, S Luria Max Delbruck đề nghị ba kiểu tái có: bán bảo tồn, bảo tồn (conservative) phân tán (dispersive) Tuy nhiên, nhiều thí nghiệm sau nhanh chóng khẳng định tái DNA diễn theo kiểu bán bảo tồn Điển hình thí nghiệm Meselson Stahl năm 1958 đối tượng E coli phương pháp đánh dấu đồng vị phóng xạ N15 (nitơ nặng) kết hợp với ly tâm siêu tốc (ultra-centrifugation) Đầu tiên cho vi khuẩn sinh trưởng môi trường N15; đưa trở lại môi trường N14 (nitơ nhẹ) sau một, hai ba hệ có lấy mẫu DNA Để tách DNA nặng nhẹ, người ta cho trộn lẫn mẫu với cesium chloride (CsCl) trước đem ly tâm Khi ly tâm, DNA có tỷ trọng nặng (heavy), nhẹ (light) trung bình (intermediate) tách thành vạch tương ứng khác ống nghiệm (hình 5.17) DNA cha mẹ Hình 5.17 Thí nghiệm Meselson-Stahl tái bán bảo toàn DNA Các kết cho thấy sau hệ, 100% DNA sợi kép có tỷ trọng trung bình, nghĩa sợi nặng (từ dạng cha mẹ) sợi nhẹ (được tổng hợp mới) Kết cho phép dự đóan kết luận tái xảy theo kiểu bán bảo tồn dự đốn Watson Crick rằng, sợi DNA làm khuôn cho tái riêng chúng Dưới nguyên tắc đặc điểm chung tái DNA (i) Tái theo kiểu bán bảo toàn gián đoạn (discontinuous); (ii) Sự tái bắt đầu nhiều vị trí đặc thù phân tử DNA diễn đồng thời theo hai hướng ngược gọi khởi điểm tái hai hướng (bidirectional origin of replication) Nghĩa là, từ khởi điểm DNA sợi kép mở xoắn thành hình vịng mở sinh trưởng theo hai hướng đối lập tạo hai chạc tái (replication fork) Mỗi khởi điểm tái với hai chạc goi đợn vị tái 166 (replicating unit hay replicon) minh hoạ hình 5.18 Nói chung, DNA mạch vịng (bộ gene số virus, vi khuẩn, plasmid DNA bào quan eukaryote), phân tử có khởi điểm tái bản; DNA nhiễm sắc thể eukaryote có nhiều khởi điểm tái hoạt động theo trình tự đặc thù (xem hình 5.20) khởi điểm (Ori) chạc sinh trưởng chạc sinh trưởng Hình 5.18 Một khởi điểm hai chạc tái sinh trưởng theo hai hướng đối lập Ở cho thấy đoạn mồi RNA tổng hợp trước (iii) Quá trình tái DNA phụ thuộc vào hệ thống gồm nhiều protein enzyme khác (xem mục bên dưới); (iv) Tại chạc tái bản, trước tiên xảy tổng hợp đoạn mồi RNA (primer) DNA polymerase tự khơng thể bắt đầu tổng hợp Mặt khác, hai sợi đơn chạc phân cực ngược chiều enzyme DNA polymerase RNA polymerase xúc tác theo chiều 3' 5', phương thức tái DNA diễn hai sợi khuôn không giống nhau: sợi liên tục hay gọi sợi dẫn đầu (leading strand) sợi khơng liên tục hay cịn gọi sợi chậm (lagging strand) Kiểu tái gọi tái nửa gián đoạn (semi-discontinuous) Sự tổng hợp DNA không liên tục dạng đoạn ngắn R Okazaki phát năm 1969; sau chúng gọi đoạn Okazaki (Okazaki fragments) Sau đó, đoạn mồi cắt bỏ chỗ trống thay DNA, đoạn Okazaki nối lại enzyme DNA ligase 167 Các enzyme tham gia tái DNA Mặc dù nhóm sinh vật có hệ thống enzyme protein tái riêng, song chúng có enzyme với vai trò chung sau đây: (1) Protein nhận biết bám vào khởi điểm để từ hình thành nên "phức hợp mở" (open complex) Ở E coli, protein dnaA (2) DNA gyrase: mở cuộn DNA siêu xoắn phía trước chạc tái (3) Helicase: tháo xoắn DNA sợi kép chạc tạo thành vùng sợi đơn Ở E coli, gọi protein dnaB hay protein rep (4) Protein SSB (single strand binding protein): bám vào vùng DNA sợi đơn helicase tách ra, giữ cho tạm thời khơng dính trở lại nhờ sợi đơn làm khuôn (template) cho tái (5) Primase: tổng hợp RNA mồi Ở E.coli, cịn gọi protein dnaG (6) Các DNA polymerase xúc tác cho việc tổng hợp DNA nhờ có hoạt tính xúc tác: polymerase 5'→3', số cịn có hoạt tính đọc sửa: exonuclease 3'→5' Ở E coli, DNA polymerase III (7) DNA polymerase vừa cắt bỏ dần đoạn mồi trước nhờ hoạt tính cắt bỏ exonuclease 5'→3', vừa kéo dài đoạn Okazaki theo sau lấp chỗ trống Ở E coli, DNA polymerase I (8) DNA ligase: hàn liền khe hở đoạn DNA cách hình thành liên kết 3',5'-phosphodiester Bảng 5.5 Đặc tính DNA polymerase E coli người DNA polymerase E coli pol I pol II pol III Polymerase 5'→3' Exonuclease 3'→5' Exonuclease 5'→3' DNA polymerase người có có có α có có khơng β có có khơng γ δ ε Định vị Tái Sữa chữa Chức Polymerase 5'→3' Exonuclease 3'→5' Exonuclease 5'→3' Primase Kết hợp với PCNA* Mấu trượt (Processivity) Tổng hợp sợi nhân có khơng nhân khơng có ty thể có khơng nhân có có nhân có có có khơng khơng có khơng thấp có khơng khơng khơng khơng có có khơng khơng khơng có có khơng khơng có cao có có khơng khơng có chậm sửachữa hai dẫn đầu chậm 168 Lưu ý: (i) Ở E coli, ba loại protein dnaB, dnaC dnaG hợp thành phức hợp có tên primasome; protein dnaC bám protein dnaB Bảng 5.5 mơ tả đặc tính DNA polymerase E coli người đại diện cho nhóm tương ứng, prokaryote eukaryote (ii) Tất DNA polymerase cần có mồi với nhóm 3'-OH tự do; xúc tác tổng hợp chuỗi theo hướng 5'→3'; số enzyme có hoạt tính đọc sửa (proofreading activity) 3'→5' (iii) Ngược với E coli, tế bào người có năm loại DNA polymerase, ba loại chịu trách nhiệm tái DNA nhân DNA polymerase alpha, delta epsilon Polymerase δ chịu trách nhiệm cho tổng hợp sợi dẫn đầu (leading strand) chí sợi chậm (lagging strand) Polymerase α kết hợp với RNA primase coi có hoạt tính cho tổng hợp đoạn mồi RNA-DNA ngắn Có điều khơng chắn nói chức alpha sợi chậm Vì dường thiếu hoạt tính đọc sửa, nên tổng hợp DNA với độ xác cao khơng phải polymerase tổng hợp sợi chậm Polymerase ε hoạt động DNA polymerase I vi khuẩn Loại kháng nguyên nhân làm tăng sinh tế bào (proliferating cell nuclear antigen = PCNA) có vai trò tái lẫn sửa chữa Một chức dùng làm nhân tố trượt (processivity factor) cho DNA polymerase δ ε PCNA giữ DNA polymerase với sợi khuôn để tổng hợp DNA nhanh (iv) Ngồi cịn có số enzyme protein đặc thù tham gia vào khâu kết thúc tái bản, tổng hợp đầu mút (telomere) tham gia cắt nối trình tái tổ hợp Cơ chế tái DNA Trong phần này, tìm hiểu kỹ chế tái vi khuẩn E coli, nêu vấn đề liên quan eukaryote mà đại diện DNA người 3.1 Giai đoạn khởi đầu tái (initiation of replication) Đối với nhiễm sắc thể E coli, tái bắt đầu khởi điểm đặc thù gọi Ori (hình 5.18) Trong đó, nhiễm sắc thể eukaryote có nhiều khởi điểm tái hai hướng (hình 5.19) Qúa trình diễn biến khởi điểm lúc hình thành hai chạc tóm tắt (theo Kelman O'Donnell, 1994) sau: (1) Các protein bám khởi điểm dnaA tổng hợp để bám Ori tạo cấu trúc nucleoprotein chuyên hoá khởi điểm; (2) Sau đó, cấu trúc mở xoắn vùng DNA giàu AT để hình thành "phức hợp mở" (open complex); (3) Hai phân tử helicase dnaB chui vào phức hợp mở làm mở xoắn khởi điểm theo hai 169 hướng, tạo thành hai chạc tái (replication fork) Khi hai sợi đơn chạc tách protein SSB bám vào Nhờ sợi đơn dùng làm khuôn hiệu cho enzyme tái hoạt động Khởi đầu tái DNA tổng hợp đoạn mồi ngắn primase, mà E.coli phức hợp primasome (thể mở đầu) nói Kích thước đoạn mồi sinh vật khác không giống nhau, thường không vượt 12 ribonucleotide Ở E coli, theo kết nghiên cứu bà Okazaki cs (1985), đoạn dài 10-12 nucleotide Khởi điểm tái Các đầu mút khơng đầy đủ Hình 5.19 Nhiều khởi điểm tái (origins of replication) nhiễm sắc thể eukaryote Ở cho thấy đầu mút (telomeres) không tổng hợp đầy đủ, cụ thể đầu 5' 3.2 Giai đọan kéo dài (elongation) Một primosome tổng hợp xong mồi, lúc kéo dài chuỗi DNA bắt đầu Ở E coli, enzyme then chốt cho trình DNA polymerase III hoàn chỉnh (holoenzyme), phức hợp gồm mười polypeptide khác Mỗi phân tử cho sợi khn Sự kéo dài suốt q trình tổng hợp DNA E coli rõ ràng cần tới replisome (thể tái bản) kết hợp primasome DNA polymerase III hoàn chỉnh Tốc độ tổng hợp trung bình 1.000 nucleotide giây Sự tái DNA chạc, nói trên, xảy theo kiểu nửa gián đoạn (semi-discontinuous) Cụ thể q trình sau (hình 5.20): Trên sợi khn dẫn đầu (3'→5'): Trước tiên, enzyme primase hay primasome tổng hợp đoạn mồi RNA với đầu 3'-OH tự Sau đó, enzyme hồn chỉnh DNA polymerase III (replisome) bắt đầu kéo dài chuỗi DNA sinh trưởng theo chiều 5'→3' cách liên tục 170 Trên sợi khuôn chậm (5'→3'): Sự kéo dài diễn không liên tục dạng đoạn Okazaki Kích thước trung bình đoạn Okazaki E coli 1.000 - 2.000 nucleotide; eukaryote 100-200; nói chung 100-1.000 nucleotide Q trình địi hỏi "mồi hóa" nhiều lần có tính chu kỳ, với tham gia bốn enzyme sau: (i) primase tổng hợp đoạn mồi RNA; (ii) DNA polymerase III hoàn chỉnh kéo dài đoạn Okazaki; (iii) DNA polymerase I vừa cắt bỏ dần nucleotide đoạn mồi vừa lấp khoảng trống cách kéo dài dần đoạn Okazaki theo sau; Hướng tái chung Sợi chậm Sợi dẫn đầu Hình 5.20 Sự tái nửa gián đoạn chạc (iv) DNA ligase hàn liền khe hở lại hai đoạn Okazaki kề liên kết 3',5'-phosphodiester Quá trình diễn luân phiên vậy, cuối sợi DNA tổng hợp trở nên dài liên tục Còn eukaryote, vai trò enzyme protein tham gia vào giai đoạn kéo dài hai sợi khuôn phân tích 3.3 Giai đọan kết thúc (termination) Do đặc điểm cấu trúc nhiễm sắc thể hai nhóm prokaryote eukaryote hồn tồn khác nhau, đặc biệt cấu trúc đầu mút nhiễm sắc thể eukaryote phát gần (hình 5.21), nên chế kết thúc tái chúng khác 3.3.1 Vấn đề kết thúc tái prokaryote Để hoàn thành việc tái DNA, tế bào phải lấp đầy khoảng trống RNA mồi bị cắt bỏ để lại Đối với DNA mạch vịng vi khuẩn chẳng hạn, khơng có vấn đề lấp tất khoảng trống có đầu 3' DNA khác nằm phía trước dùng làm mồi Thật vậy, hai chạc tái khởi điểm (ori), di chuyển tốc độ, theo hai hướng đối lập xung quanh nhiễm sắc thể mạch vòng chúng gặp điểm kết thúc chung đối diện với ori Thực ra, theo Bastia cs (1997) 171 nhiều tác giả khác, vùng chứa trình tự đặc thù gọi điểm kết thúc tái (replication termini) Và trình tự đặc thù có protein kết thúc tái (replication terminator protein = RTP) bám vào phức hợp protein-DNA ngăn cản di chuyển chạc tái theo cách phân cực định hướng đặc thù Sự ngừng lại chạc tái vùng kết thúc tạo nên bước q trình hồn thành vịng tái sau đó, tách hai nhiễm sắc thể rời cách có trật tự nhờ xúc tác topoisomerase IV Lưu ý: (1) Các nghiên cứu gần cho thấy RTP E coli có trọng lượng phân tử ~36kD, mã hóa gene tus (ter) tế bào có ~80 protein trì ổn định suốt chu kỳ tế bào Còn RTP Bacillus subtilis dimer có trọng lượng phân tử tiểu đơn vị 14.500 kD, mã hóa gene rtp (2) Các trình tự trí (consensus sequences) vùng kết thúc tái E coli (R6K) B subtilis, theo Bastia cs (1997), sau: E coli (R6K) 5'NN(A/T)(A/T)(A/T)G(A/T)(A/G)TGTTGTAACTA(A/C)NN3' B.subtilis 5'ACT(A/G)AN(T/A)(A/G)(A/C)(A/T)(C/T)(T/A)(A/G)TG(T/A)AC/CTTCAN3' 3.3.2 Vấn đề kết thúc tái eukaryote Như biết, nhiễm sắc thể eukaryote chứa phân tử DNA sợi kép mạch thẳng kết hợp với nhiều loại protein, có đầu mút đặc trưng gọi telomere Một đọan mồi sợi loại bỏ khơng có cách để bù đắp lại khoảng trống đó, DNA khơng thể nới rộng theo chiểu 3'→5', chẳng có đầu 3' (a) (b) Hình 5.21 (a) Ảnh chụp cho thấy đầu mút nhiễm sắc thể - telomeres có màu vàng đặc trưng, (b) sơ đồ minh họa tổ chức telomere người nằm phía trước DNA mạch vòng Nếu sợi DNA ngắn bớt sau lần tái Vậy tế bào eukaryote 172 giải vấn đề nào? Kéo dài Chuyển dịch Kéo dài Hình 5.22 Mơ hình Carol Greider chế tổng hợp đoạn lặp telomere sợi giàu G nhờ telomerase Tetrahymena Từ hình dung bước tiếp theo: lấp khoảng trống sợi đối diện giàu C thực primase DNA polymerase, cuối cắt bỏ đoạn mồi Các kết nghiên cứu Elizabeth Blackburn đồng bà giải đáp cho vấn đề (hình 5.22) Các telomere khơng chứa gene; thay chúng có cấu trúc đơn giản gồm trình tự ngắn (6-8 cặp base) lặp lại nối tiếp ngàn lần đặc thù cho lồi Chẳng hạn, Tetrahymena, nhóm động vật ngun sinh có lơng tơ, (TTGGGG)n; Caenorhabditis: (CCCTCCC)n; bọn Oxytrichia thuộc Euplotes: (CCCCAAA)n Cịn động vật có vú người, 5'-TTAGGG-3' lặp lại khoảng 1.000-2.000 lần (theo Yakoob cs 1999, khoảng biến thiên phát tế bào giai đoạn khác 150-2000 lần) Các đoạn lặp gắn thêm vào đầu 3' sợi DNA, tái bán bảo toàn, mà enzyme gọi telomerase Nếu telomerase không cho phép chế tái bán bảo tồn, khơng thể sử dụng sợi DNA làm 173 khuôn cho sợi Blackburn cho thấy tính chất đặc thù nằm thân telomerase, RNA nhỏ enzyme Như vậy, telomerase ribonucleprotein enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase), tổng hợp DNA từ khuôn RNA Chẳng hạn, telomerase Tetrahymena có RNA dài 160 nucleotide có chứa trình tự 3'-CAACCCCAA-5' làm khuôn cho tổng hợp đoạn lặp 5'TTGGGG-3' telomere Tetrahymena (hình 5.22); người, phân tử RNA telomerase dài khoảng 450 nucleotide có chứa trình tự 3'-AAUCCC-5' (nằm đoạn ứng với vị trí 46-56) làm khuôn cho tổng hợp đoạn lặp telomere 5'-TTAGGG-3' sợi đơn có đầu mút 3' Sau đó, sợi đối diện, DNA polymerase hồn thành việc tổng hợp "các đầu mút không đầy đủ" (incomplete ends) sợi đối diện sau mồi hóa bên telomere đó; cuối đoạn mồi bị cắt bỏ khe hở nối lại Các nghiên cứu gần cho thấy rằng: enzyme telomerase có mặt tế bào mầm (germ cells), kể tế bào gốc phôi (embryonic stem cells); tế bào ung thư (cancer cells); eukaryote đơn bào Tetrahymena thermophila Trong đó, tế bào soma bình thường động vật có vú khơng thấy có telomerase Điều cho phép lý giải tế bào mầm tế bào ung thư có khả phân chia gần vơ hạn; hay nói cách khác, telomerase trì chiều dài telomere chìa khóa cho tế bào Ngược lại, hậu vắng bóng telomerase tế bào soma (do gene mã hóa bất hoạt) chỗ: sau lần nguyên phân (mitosis), tất 92 telomere tế bào soma người đồng loạt bị chừng 100 cặp base, nghĩa khoảng 16 đoạn lặp TTAGGG Theo lý thuyết, với tốc độ sau 125 lần nguyên phân telomere biến hoàn toàn Trên thực tế, thí nghiệm khác kể từ khám phá Leonard Hayflick vào đầu thập niên 1960 (Greider Blackburn 1996; Hayflick 1997; Shay cs 2004; ) xác nhận rằng: sau khoảng 30-50 lần nguyên phân, tế bào soma hẳn khả phân chia vào giai đoạn lão hóa (senescence) chết tự nhiên Cái gọi giới hạn Hayflick (Hayflick limit) Chính q trình rút ngắn telomere theo thời gian (nghĩa số lần nguyên phân) khiến người ta liên tưởng tới tồn gọi "đồng hồ di truyền cho lão hóa" (genetic clock for aging), bắt đầu tiến hành nghiên cứu "hiệu ứng vị trí telomere" (telomere position effect = TPE) (Borek 2002) Đó lý tế bào soma có số lần phân chia hữu hạn trước chúng chết lý tất 174 sinh vật phải chết Như thế, chết tất yếu phương diện sinh học, chết tự nhiên thân xác lý giải rõ ràng đầy đủ Và từ nghiên cứu mở triển vọng to lớn cho liệu pháp ung thư (cancer therapy) vấn đề lão hóa bệnh tật phát sinh từ người (Greider Blackburn 1996;Yakoob cs 1999; Borek 2002; Shay cs 1998, 2004) VI Tái gene RNA (RNA genomes) Đặc điểm tái gene RNA virus hậu chúng Ở virus có gene RNA, phương thức tái chúng rõ ràng khác với hệ thống tái DNA biết Trước hết, enzyme tổng hợp RNA khơng cần có mồi (primer), khơng có hội cho việc đọc sửa (proofreading) Ngoài ra, mặt di truyền RNA phân tử bền vững so với DNA nhóm hydroxyl có mặt ngun tử C2' gốc đường cho phép cắt đứt (thủy phân) liên kết phosphodiester hai ribonucleotide tạo thành dạng phosphodiester vịng nhóm hydroxyl C2' C3' gốc đường; sau cấu trúc vịng mở để lại nhóm phosphate vị trí C3' Sự kết hợp hai đặc điểm nguyên nhân làm hạn chế kích thước gene RNA Các gene sinh trưởng lớn, khơng thể tránh khỏi tỷ lệ sai sót cao trình tái (10-3-10-4) Vì vậy, thực tế, gene RNA lớn biết RNA sợi đơn với chừng 29.600 base Đó trường hợp virus gây bệnh sốt viêm phổi cấp (SARS) thuộc họ coronavirus phát hồi tháng 3/2002 số nước châu Á, Canada Đó lý virus RNA cho nhiều biến thể khác đến vậy, kích thước gene đâu có lớn Điều làm cho virus RNA thực trở thành mối hiểm họa chúng tiến hóa nhanh để xâm nhập vào hệ thống miễn dịch vật chủ Chẳng hạn, gene HIV có nhiều biến thể gây khó khăn cho việc bào chế vaccine thuốc chống lại tất biến thể HIV Dưới nêu khái quát hai kiểu tái virus RNA 2.Tái gene RNA Kiểu truyền thông tin trực tiếp từ RNA sang RNA xảy tế bào lây nhiễm virus RNA như: virus đốm thuốc nhiều virus thực vật khác, kể phage RNA MS2 Bộ gene RNA virus có mang gen mã hố enzyme tái đặc thù Sau tổng hợp tế bào chủ, enzyme sử dụng thân RNA virus làm khuôn để tổng hợp phân tử RNA bổ sung Đến lượt RNA lại làm khuôn để tổng hợp trở lại phân tử RNA virus hệ 175 Phiên mã ngược Phiên mã ngược (reverse transcription) kiểu truyền thông tin từ RNA sang DNA, xảy tế bào động vật người bị lây nhiễm số virus mang sợi RNA có khả gây khối u hai sợi RNA trường hợp HIV chẳng hạn Trên sợi RNA lõi virus có mang enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Khi xâm nhập vào tế bào chủ, enzyme sử dụng RNA virus làm khuôn để tổng hợp sợi DNA bổ sung (complementary DNA = cDNA) Sau đó, sợi cDNA làm khn để tổng hợp trở lại gene virus (cDNA→RNA), tổng hợp sợi DNA thứ hai bổ sung với (cDNA→DNA) trường hợp virus gây khối u mà kết tạo cDNA sợi kép Phân tử DNA sợi kép tổng hợp trước tiên q trình lây nhiễm xen vào DNA vật chủ trạng thái tiền virus (provirus) Vì vậy, provirus truyền lại cho tế bào thông qua tái DNA vật chủ, nghĩa tế bào cháu vật chủ bị chuyển sang tình trạng có mầm bệnh ung thư Các tế bào ung thư khả kiểm sốt sinh trưởng - phân chia điển hình tế bào bình thường; chúng tăng sinh nhanh tạo khối u (tumor) Đó chế gây ung thư virus Ngày nay, người ta tinh chiết enzyme phiên mã ngược để phục vụ cho kỹ thuật tạo dòng cDNA tái tổ hợp (chương 10) Câu hỏi Bài tập Trên sở đặc điểm mơ hình Watson-Crick, cho biết: (a) Mơ hình cho phép giải thích quy luật Chargaff nào? (b) Cơ sở đặc tính đối song song chuỗi xoắn kép DNA gì? (c) Mơ hình gợi lên khả tự tái DNA sao? Hãy xác định hàm tương đối (%) nucleotide DNA người, cá hồi (Salmo salar) gà (Gallus domesticus) Biết tỷ lệ (A+T)/(G+C) tương ứng loài 1,52; 1,43; 1,34 Dựa vào cấu trúc hóa học lập thể base (A,T,G C), giải thích: (a) Tại ADN tồn hai kiểu kết cặp A-T G-C mà khơng có kiểu khác? (b) Các kiểu kết cặp A-C G-T xảy gây hậu gì? Giải thích cho sơ đồ minh họa Giả sử tỷ lệ (A+T)/(G+C) sợi chuỗi xoắn kép ADN 0,25 (a) Hãy cho biết tỷ lệ sợi bổ sung phân tử? (b) Nếu cho 0,25 tỷ lệ (A+G)/(T+C), tỷ lệ sợi bổ sung 176 phân tử nào? Hãy điểm giống khác prokaryote eukaryote vấn đề sau: (a) Khởi điểm tái bản; (b) Các enzyme tham gia tái bản; (c) Các chế mở đầu, kéo dài, kết thúc tái Dựa vào hiểu biết thuyết di truyền nhiễm sắc thể, giải thích thí nghiệm Griffith biến nạp phế cầu khuẩn S pneumoniae So sánh cấu trúc nucleotide chuỗi polynucleotide cấu trúc phân tử DNA RNA Thế biến tính hồi tính DNA? Các tượng có ý nghĩa gene sinh vật kỹ thuật di truyền? Thế giá trị C (C-value) nghịch lý giá trị C (C-value paradox)? Cho thí dụ nêu ý nghĩa mặt lý luận hiểu biết 10 Sự tái gene RNA số virus khác với hệ thống tái DNA điểm nào? Tại kích thước gene RNA thường nhỏ, chúng lại có khả gây nguy hiểm thực vật chủ? Hãy giải thích chế gây ung thư virus Tài liệu Tham khảo Tiếng Việt Hồ Huỳnh Thùy Dương 1997 Sinh học Phân tử NXB Giáo Dục Phạm Thành Hổ 2000 Di truyền học Tái lần II, NXB Giáo Dục Phan Cự Nhân 2001 Di truyền học Động vật NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Phan Cự Nhân 1999 Công nghệ ADN tái tổ hợp Trong: Di truyền học tập II (Phan Cự Nhân, chủ biên) Trang: 257-303 NXB Giáo Dục, Hà Nội Hoàng Trọng Phán 1995 Một số vấn đề Di truyền học đại (Tài liệu BDTX cho giáo viên THPT chu kỳ 1993-1996) Trường ĐHSP Huế Hoàng Trọng Phán 1997 Di truyền học Phân tử NXB Giáo Dục Watson JD 1968 Chuỗi xoắn kép: Hồi ký việc phát minh cấu trúc DNA (Bản dịch Lê Đình Lương Thái Dỗn Tĩnh) NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 1984 Tiếng Anh Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Robert K, Walter P 2002 Molecular Biology of the Cell Garland Science, NY Bastia D, Manna AC, Sahoo T 1997 Termination of DNA replication in 177 prokaryotic chromosomes In: Genetic Engineering, Vol 19 (Setlow JK ed.) pp 101-119 Plenum Press, New York, USA Borek C 2002 Telomere Control and Cellular Aging: http://www.lef.org/magazine/mag2002/oct2002 report telo 01.html Donovan S and Diffley JFX 1995 Replication origins in eukaryotes In: Current Opinion in Genetics & Development (Herr W and Kingston R, eds.),Vol.5(2): 203-207 Current Biology Ltd, UK Greider CW and Blackburn EH 1996 Telomere, Telomerase and Cancer Scientific American, 2/96, p.92: http://www.genethik.de/telomerase.htm Hamlin JL and Dijkwel PA 1995 On the nature of replication origins in higher eukaryotes In: Current Opinion in Genetics & Development (Herr W and Kingston R, eds.),Vol.5(2): 153-161 Current Biology Ltd, UK Harley CB, Villeponteau B 1995 Telomeres and telomerase in aging and cancer In: Current Opinion in Genetics & Development (Herr W and Kingston R, eds.),Vol.5(2): 249-255 Current Biology Ltd, UK Hayflick L 1997 Mortality and Immortality at the Cellular Level A Review Copyright 2005BioProtNetwork:webmaster@ protein.bio.msu.su Kelman Z, O'Donell M 1994 DNA replication: enzymology and mechanisms In: Current Opinion in Genetics & Development (Stillman B and Green M, eds.),Vol.4(2): 185-195 Current Biology Ltd, UK Lingner J and Cesh TR 1998 Telomerase and chromosome end maintenance In: Current Opinion in Genetics & Development (Allis CD and Gasser SM, eds.),Vol.8(2): 226-232 Current Biology Ltd, UK Lewis R 2003 Human Genetics: Concepts and Applications 5th ed, McGraw-Hill, Inc, NY Price CM 1999 Telomeres and telomerase: broad effects on cell growth In: Current Opinion in Genetics & Development (Kadonaga JT and Grunstein M, eds.),Vol.8(2): 218-224 Current Biology Ltd, UK Russell PJ 2003 Essential Genetics Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc, Menlo Park, CA Shay JW and Wright WE 1998 Teleomerase, Cellular Senescence and Cancer Page maintained by: Cell Biology and Neuroscience Shay JW 2002 Telomeres, Aging, and Tumorigenesis Gac Méd Méx Vol.138 Suplemento No.1, 2002, pp.S2-S3 Shay J, Schneider E, Masoro EJ 2004 Is there a genetic clock for aging?: www.infoaging.org/b-tel-home.html Tamarin RH 1999 Principles of Genetics 6th ed, McGraw-Hill, Inc, NY 178 Twyman RM 1998 Advanced Molecular Biology BIOS Scientific Publishers Ltd/ Springer-Verlag Singapore Pte Ltd Watson JD, Hopkins NH, Roberts JW, Steitz JA, Weiner AM 1987 Molecular Biology of the Gene 4th ed, Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc, Menlo Park, CA Weaver RF, Hedrick PW 1997 Genetics 3rd ed, McGraw-Hill Companies, Inc Wm.C.Browm Publishers, Dubuque, IA Yakoob J, Hu G-L, Fan X-G, Zhang Z 1999 Telomere, telomerase and digestive cancer World Journal of Gastroenterology, 5(4):334-337 Một số trang web http://www.lef.org/magazine/mag2002/oct2002 report telo 01.html http://www.genethik.de/telomerase.htm http://www.infoaging.org/b-tel-home.html http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/ http://www.ornl.gov/hgmis http://www.horizonpress.com/pcr/ http://dir.niehs.nih-gov/dirlmg/repl.html ... vi khuẩn, không thực chức sau DNA tiêm vào vi khuẩn Như vậy, vật chất di truyền phage T2 DNA, khơng phải protein 3.2 Thí nghiệm chứng minh vật chất di truyền số virus RNA 150 Sau này, năm 1956... lần II, NXB Giáo Dục Phan Cự Nhân 2001 Di truyền học Động vật NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Phan Cự Nhân 1999 Công nghệ ADN tái tổ hợp Trong: Di truyền học tập II (Phan Cự Nhân, chủ biên) Trang:... thống di truyền, gene nhân (đã trình bày chương 4) gene tế bào chất (xem chương 9) Kích thước gene số sinh vật thường gặp giới thiệu bảng 5.3 5.4 Mối quan hệ kích thước gene tính phức tạp tiến hóa