Nghiên cứu kỹ thuật vi ghép cây bưởi

Nghiên cứu kỹ thuật vi ghép cây bưởi

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT VI GHÉP CÂY BƯỞI

(Citrus grandis)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001-2005

Sinh viên thực hiện: HÀ THANH VÕ

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT VI GHÉP CÂY BƯỞI

(Citrus grandis)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001-2005

Sinh viên thực hiện: HÀ THANH VÕ

iii

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm tạ:

 Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

 Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

 TS Trần Thị Dung đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

 KS Trần Ngọc Tống đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực tập tốt nghiệp  Cử nhân Trần Thị Bích Chiêu, Kỹ sư Nguyễn Thị Thu Hằng, cử nhân Lưu Phúc Lợi đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp

 Ông Nguyễn Văn Hòa, bác Ba Lắm, ông Phạm Văn Y cùng các nhà vườn đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp

 Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27, các sinh viên đàn em K28, K29 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ trong thời gian thực tập tốt nghiệp

TÓM TẮT

HÀ THANH VÕ, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 “NGHIÊN

CỨU KỸ THUẬT VI GHÉP CÂY BƯỞI (Citrus grandis)”

Giáo viên hướng dẫn: TS TRẦN THỊ DUNG

Ở nước ta hiện nay dịch bệnh vẫn đang tiềm ẩn và khó phòng ngừa trên cây thuộc họ cam quýt Đặc biệt là bệnh do nòi virus tristeza với tác nhân truyền bệnh do

các loại côn trùng chích hút và bệnh vàng lá gân xanh do vi khuẩn Liberobacter

asiaticum đã gây thiệt hại rất lớn cho các nhà vườn ở khắp nước ta Vì vậy, nhu cầu

có được cây sạch virus và có khả năng kháng bệnh tốt là yêu cầu cần thiết phải làm của công tác giống

Đề tài được thực hiện trên đối tượng là các giống bưởi khác nhau, bưởi dùng làm gốc ghép gồm hai giống: bưởi Xim Vang ở Đồng Nai và bưởi Bồng ở Huế Chồi ghép là các giống bưởi khác nhau: bưởi Năm Roi, bưởi Da Xanh và bưởi Đường Lá Cam Mỗi chồi ghép được ghép lên một loại gốc ghép và mỗi cặp gốc ghép và chồi ghép được ghép với ba kiểu ghép khác nhau (ghép chữ T ngược (T), ghép mặt cắt (M), ghép hàm ếch (E))

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây bưởi 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3

2.1.1.1 Nguồn gốc 3

2.1.1.2 Phân loại 4

2.1.2 Đặc điểm hình thái của cây bưởi 4

2.1.3 Các giống bưởi dùng trong thí nghiệm 6

3.1.3.1 Các giống bưởi dùng làm chồi ghép 6

2.2.1.2 Citrus tatter leaf virus ( CTLV) 9

2.2.1.3 Citrus exocortis virus (CEV) 10

2.2.2 Môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt 10

2.2.2.1 Rệp muội hại cây trồng 10

2.2.2.2 Rệp sáp hại cây trồng 11

2.3 Các cách nhân giống của cây bưởi 13

2.3.1 Nhân giống cổ điển 13

2.3.1.1 Nhân giống bằng hạt 13

2.3.1.2 Nhân giống bằng cách chiết cành 13

2.3.1.3 Nhân giống bằng cách giâm cành 14

2.2.1.4 Nhân giống bằng cách ghép 15

2.3.2 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô 19

2.3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến vi ghép 20

2.3.2.2 Chuyển cây ra vườn ươm 22

2.3.2.3 Lịch sử hình thành và phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật 22

2.3.2.4 Một số kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật 23

2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về kỹ thuật vi ghép 24

2.4.1 Nghiên cứu trong nước 24

2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước 25

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

3.1.3 Môi trường nuôi cấy 28

3.2 Điều kiện nuôi cấy 29

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 Bố trí thí nghiệm 30

vii

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Tỷ lệ sống của cây vi ghép 35

4.2 Khả năng hình thành chồi mới của cây vi ghép 40

4.3 Chiều cao chồi của cây vi ghép 44

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D: 2,4 – Dichlorophenoxyacetic Acid B: Bồng

BNR: Bưởi Năm Roi

B-NR-E:Gốc ghép bưởi Bồng, chồi ghép Năm Roi và cách ghép hàm ếch B-NR-T: Gốc ghép bưởi Bồng, chồi ghép Năm Roi và cách ghép chữ T ngược B-NR-M: Gốc ghép bưởi Bồng, chồi ghép Năm Roi và cách ghép mặt cắt B-DX-E: Gốc ghép bưởi Bồng, chồi ghép Da Xanh và cách ghép hàm ếch B-DX-T: Gốc ghép bưởi Bồng, chồi ghép Da Xanh và cách ghép chữ T ngược B-DX-M: Gốc ghép bưởi Bồng, chồi ghép Da Xanh và cách ghép mặt cắt

B-ĐLC-E: Gốc ghép bưởi Bồng, chồi ghép Đường Lá Cam và cách ghép hàm ếch B-ĐLC-T: Gốc ghép bưởi Bồng, chồi ghép Đường Lá Cam và cách ghép chữ T ngược B-ĐLC-M: Gốc ghép bưởi Bồng, chồi ghép Đường Lá Cam và cách ghép mặt cắt CEV: Citrus exocortis virus

CTLV: Citrus tatter leaf virus CTV: Citrus tristeza virus DF: Độ tự do

DNA: Acid desoxyribonucleic DX: Da Xanh

ĐLC: Đường Lá Cam E: Cách ghép hàm ếch

F: Fitted values (giá trị lý thuyết)

FAO: Food and Agrculture Organization FFTC: Food and fertilizer technology center IAA: Indol-3-Acetic Acid

ix Mt MS: Môi trường Murashige&Skoog NAA: α – Naphthaleneacetic Acid NR: Năm Roi

P: Prob Level SS: Sum of Squares T: Cách ghép chữ T ngược XV: Xim Vang

XV-NR-E: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Năm Roi và cách ghép hàm ếch XV-NR-T: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Năm Roi và cách ghép chữ T ngược XV-NR-M: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Năm Roi và cách ghép mặt cắt XV-DX-E: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Da Xang và cách ghép hàm ếch XV-DX-T: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Da Xanh và cách ghép chữ T ngược XV-DX-M: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Da Xanh và cách ghép mặt cắt

XV-ĐLC-E: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Đường Lá Cam và cách ghép hàm ếch XV-ĐLC-T: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Đường Lá Cam và cách ghép chữ T ngược

XV-ĐLC-M: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Đường Lá Cam và cách ghép mặt cắt

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1: Quả bưởi Đường Lá Cam 6

Hình 2.2: Quả bưởi Đường Lá Cam xẻ dọc 6

Hình 2.3: Quả bưởi Da Xanh 7

Hình 2.4: Quả bưởi Da Xanh xẻ dọc 7

Hình 2.5: Vườn cây bị tàn phá do virus tristeza (cành chết khô và không có trái) 8

Hình 2.6: Cây bưởi bị nhiễm bệnh virus tristeza (cây lùn và lá bị vàng) 8

Hình 2.7: Triệu chứng bệnh “nổ lá” 9

Hình 2.8: Gốc cây bị bệnh bong vỏ gốc thân 10

Hình 2.9: Các môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt……… 11

cách ghép mặt cắt ở tuần 3……… ……… 43 Hình 4.6: Gốc bưởi Xim Vang (trái) và gốc bưởi Bồng (phải) với chồi ghép Năm Roi và cách ghép chữ T ngược ở tuần 1……… 44 Hình 4.7: Cây ghép ở tuần 1………44 Hình 4.8: Chồi ghép Năm Roi trên gốc ghép bưởi Bồng

ở tuần 2 (trái) và tuần 3 (phải) ……… 46 Hình 4.9: Lá chồi ghép Năm Roi trên gốc ghép bưởi Bồng ở tuần 4………….52 Hình 4.10: Chồi ghép Da Xanh trên gốc ghép bưởi Bồng ở tuần 2

(trái) và tuần 3 (phải)……….53 Hình 4.11: Chồi ghép Da Xanh trên gốc ghép bưởi Xim Vang

ở tuần 1 (trái) và tuần 3( phải)……… 54

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng Trang Bảng 2.1 : Thành phần rệp hại cây trồng thuộc họ cam quýt chủ yếu

ở Việt Nam………12

Bảng 3.1: Thành phần môi trường MS (Murashige & Skoog) 29

Bảng 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của kỹ thuật vi ghép đến tỷ lệ sống của cây vi ghép 35

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của kỹ thuật vi ghép đến khả năng hình thành chồi mới của cây vi ghép 40

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của kỹ thuật vi ghép đến chiều cao chồi của cây vi ghép 45

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của kỹ thuật vi ghép đến số lá được hình thành của cây vi ghép 51

xiii

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ Trang

Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ sống của 18 nghiệm thức……… ………39

Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ chồi bật mầm của 18 nghiệm thức……… 43

Biểu đồ 4.3: Chiều cao chồi của 18 nghiệm thứ.………50

Biểu đồ 4.4: Số lá của 18 nghiêm thức……… 55

Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Khí hậu Việt Nam là khí hậu nóng ẩm nhiệt đới rất thuận lợi cho các loại cây trồng khác nhau sinh trưởng và phát triển Trong nhiều loại cây trồng khác nhau ấy thì cây có múi là một chủng loại cây ăn trái chiếm vị thế quan trọng trên thế giới Thật vậy, ngoài vai trò cung cấp một lượng vitamin dồi dào cho sức khỏe con người, cây có múi còn là loại cây mang lại giá trị kinh tế cao và làm tăng ngoại tệ đáng kể nhờ xuất khẩu

Việt Nam là một trong những nước bản địa của vùng phát sinh cây có múi, và cho đến nay cây có múi giữ vị trí quan trọng trong ngành sản xuất trái cây Tuy nhiên những năm gần đây, dịch bệnh vàng lá greening cùng nhiều loại bệnh truyền nhiễm khác đã lây lan mạnh làm suy yếu cây, từ đó làm giảm năng suất và phẩm chất quả

Để có giống tốt cung cấp cho các nhà vườn, công tác giống có vai trò rất quan trọng trong việc cung cấp giống cho các nhà vườn Để có được giống sạch virus cũng như sạch các bệnh khác, thỏa mãn yêu cầu cấp thiết về chất lượng thì vi ghép cây là điều cần thực hiện trong sản xuất cây có múi hiện nay

Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học

Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu kỹ

thuật vi ghép cây Bưởi (Citrus grandis)”

1.2 Mục đích - yêu cầu 1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu các kỹ thuật vi ghép cây bưởi nhằm tạo ra cây bưởi in vitro sạch bệnh

1.3 Đối tượng nghiên cứu

Thực hiện vi ghép trên cây bưởi với gốc ghép là cây bưởi Bồng ở Huế và bưởi Xim Vang ở huyện Vĩnh Cữu, tỉnh Đồng Nai

Cành ghép là các giống bưởi cao sản được ưa chuộng trên thị trường hiện nay cụ thể là bưởi Năm Roi ở Vĩnh Long, bưởi Da Xanh ở Bến Tre, bưởi Đường Lá Cam ở Đồng Nai

1.4 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành ở quy mô phòng thí nghiệm

Theo Đường Hồng Dật (2000), ở Trung Quốc các thầy thuốc đã dùng vỏ quả cam quýt để phòng ngừa dịch hạch, chữa trị bệnh phổi và bệnh chảy máu dưới da

Bưởi còn là loại quả có tiềm năng kinh tế cao, trọng lượng quả lớn, cây có thể cho thu hoạch quả đạt năng suất cao

Theo Nguyễn Văn Kế (1990), sản lượng bưởi toàn cầu khoảng 5 triệu tấn trên tổng số 65 triệu tấn quả của họ cam quýt Riêng tại Việt Nam, Nam Bộ có khoảng 2000 hecta trồng cây họ có múi

Theo FAO (Tổ chức an toàn lương thực thế giới, 2002) thì diện tích trồng cam quýt và bưởi trên toàn thế giới khoảng 7.330.000 ha với sản lượng 103.300.000 tấn/năm, mang lại giá trị khoảng 3 tỷ USD Và cũng theo dự báo của FAO trong thời kỳ 2001 đến 2010, nhu cầu tiêu thụ cây cam quýt tăng cao hơn tốc độ tăng sản lượng, theo đó nhu cầu thị trường tiêu thụ tăng bình quân 3,6%/năm Trong khi sản lượng chỉ đạt 2,8%/năm (Viện nghiên cứu cây ăn quả miền nam, 2001)

Ngoài ăn tươi, quả bưởi còn có thể chế biến thành nhiều sản phẩm có giá trị kinh tế như các loại nước giải khát, lấy tinh dầu từ vỏ và hạt

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 2.1.1.1 Nguồn gốc

Alphonse de Candle (1886) cho rằng có một số giống bưởi tại quần đảo Malaysia cho thấy nơi đây có nguồn gốc canh tác bưởi lâu đời

Theo Webber và ctv (1967), trong quần đảo Friendly và Fiji còn tồn tại rất nhiều giống bưởi hoang dại, cho thấy đây có thể là vùng khởi nguyên của bưởi

Tuy nhiên, Webber và ctv (1967) cũng cho rằng dựa trên các dữ liệu hiện có Bưởi cũng có thể là cây bản địa của quần đảo Malaysia và Indonesia, từ hai nơi này bưởi đã lan truyền sang Trung Quốc, Ấn Độ rồi đến Iran, Palestin và vào Châu Âu

Theo Saunt (1990), bưởi có nguồn gốc ở Miền Nam Trung Quốc nơi chúng được trồng rộng rãi và phân bố tới khắp các nước Đông Nam Á, nơi đây có nhiều giống bưởi đã và đang được phát triển

Jorgenson (1984) cho rằng bưởi và nhóm cây có múi khác đã được mang đến vùng Đông Nam Á, bởi những người Trung Quốc đi lập nghiệp và do đó bưởi đã trở thành tự nhiên hoá trong vùng

Theo Nguyễn Văn Kế (1997), bưởi thuộc họ cam quýt có nguồn gốc Đông Nam Á (Thái Lan và Malaysia) sau đó lan rộng qua Ấn Độ, Trung Quốc, Iran

Tóm lại, bưởi được trồng nhiều nơi trên thế giới, có khả năng sinh trưởng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trải rộng từ 35 vĩ độ nam đến 35 vĩ độ bắc, từ đó phân bố rộng ra khắp thế giới Và cho đến nay, người ta vẫn chưa thể xác định chính xác nơi xuất xứ của cây bưởi

2.1.1.2 Phân loại

Ngành hạt kín: Angiospermae Lớp hai lá mầm: Dicotyledones Bộ: Rutales

Họ: Rutaceae

Tên khoa học: Citrus grandis Osbeck

2.1.2 Đặc điểm hình thái của cây bưởi

Theo Nguyễn Văn Kế (1997), so với các cây khác trong họ cam quýt thì bưởi là cây lớn nhất, có gai, có thể cao đến 15 m, lá to, xanh đậm với cành lá to hơn cam quýt

Thân và tán cây bưởi: Bưởi thuộc dạng thân gỗ, là loại cây cao to nhất trong

họ citrus, cây cao 6 – 7 m, trong một năm có thể cho ra 3 – 4 đợt cành Hình thái tán

rất đa dạng: tán rộng, tán thưa, tán hình cầu, hình tròn hay hình tháp Phần lớn các giống bưởi có tán xòe như bưởi Chùm, bưởi Chua, bưởi Đường…nhưng cũng có tán đứng như bưởi Thanh Trà, bưởi Ổi Khi còn nhỏ cành có gai và rụng khi lớn

Lá bưởi: Lá có cánh tiếp giáp hay chồng lên phiến lá, số lá trên cành có liên

quan đến trọng lượng quả, ảnh hưởng đến năng suất, kích thước lá thay đổi tùy theo giống

Hoa bưởi: Hoa lưỡng tính mọc từ nách lá, hoa màu trắng, thơm có 5 cánh và 3

– 5 lá đài, 20 – 40 nhị đực hợp thành từng nhóm dính liền ở đáy, bao phấn có 4 ngăn, màu vàng mọc bằng hay nhô cao hơn đầu nướm nhụy cái Đầu nướm nhụy cái to, bầu noãn có 8 – 15 ngăn dính liền nhau tại một trục ở giữa, thường thì hoa tự thụ phấn, tuy nhiên hoa bưởi cũng có khả năng thụ phấn chéo

Quả bưởi: Thường nặng từ 0.8 – 3.8 kg nhưng thường biến động từ 0.9 – 1.5

kg với nhiều dạng: da sần, da láng, quả tròn, quả dẹp, dạng quả lê, núm cao Thịt quả từ trắng đến hồng, vàng, xanh vàng, quả bưởi gồm có 3 phần:

 Ngoại quả bì: Là phần vỏ ngoài của trái gồm có biểu bì, lớp cutin dày và các khí khổng Bên dưới lớp biểu bì là lớp nhu mô mỏng giàu lục lạp, nên khi trái còn xanh vẫn có thể quang hợp được Giai đoạn chín diệp lục bị phân huỷ, nhóm sắc tố caroten trở nên chiếm ưu thế, màu sắc trái thay đổi từ xanh sang vàng

 Trung quả bì: Giáp phần phía trong ngoại quả bì, lớp này gồm nhiều tầng tế bào hợp thành, có màu trắng, vàng nhạt hay hồng nhạt Trái càng lớn thì phần mô này càng xốp

 Nội quả bì: Gồm có tâm bì hay múi được bao quanh bởi lớp vách mỏng trong Bên trong vách là tép phát triển và chứa đầy dịch nước, dịch nước chứa đường và acid (chủ yếu là acid citric)

Phạm Hoàng Hộ (1992), đã phân biệt bưởi ra 2 loài khác nhau: bưởi và bưởi chùm

Bưởi: Citrus grandis (L.) Osb var grandis (Shaddock, Pumelo,

Pamplemousse): Đại mộc cao vào khoảng 10 m; gai ngay dài đến 10 cm, ở thân rộng đến 1 cm Lá có phiến to, dày, gân phụ 5 – 6 cặp, cũng có cánh rộng và có đốt gắn vào phiến Chùm hoa ngắn, trục có lông, cánh hoa trắng, dài 2 – 3.5 cm; tiểu nhị nhiều, dính nhau

Hình 2.1: Quả bưởi Đường Lá Cam

Hình 2.2: Quả bưởi Đường Lá Cam

10 – 14 cm, vỏ quả mỏng hơn 5 – 7 mm, múi không tróc dễ dàng, song chua và đắng, 2n = 28 Bưởi này được trồng ở Đà Lạt, người xứ lạnh ưa ăn bưởi đắng này với đường

2.1.3 Các giống bưởi dùng trong thí nghiệm

3.1.3.1 Các giống bưởi dùng làm chồi ghép

(a) Bưởi Năm Roi: Lá lớn, phiến lá dạng trứng ngược Cánh lá to dạng tam

giác, trái to (trọng lượng trung bình 1 kg/trái), dạng quả lê Trái có 11 – 16 múi, vỏ trái màu xanh đến vàng nhạt, khá ráo nước, còn tép bó chặt nhau, ngon ngọt, có vị chua ít, không đắng, tróc vỏ, múi tốt Đặc biệt có dòng bưởi năm roi được trồng hiện nay không hạt hoặc ít hạt Bưởi Năm Roi được trồng nhiều ở Bình Minh (Vĩnh Long) và Phú Hữu (Cần Thơ)

Bưởi Năm Roi có nhiều giống: bưởi năm roi 01 (BNR01), BNR02, BNR25, BNR04 Riêng cá thể giống bưởi năm roi 25 của ông Tô Văn Nho ở Mỹ Hoà - Bình Minh – Vĩnh Long đã được bộ Nông Nghiệp công nhận cho phép đưa vào sản suất ở các tỉnh phía Nam, theo quyết định số 2767 NN-KHCN/QĐ vào ngày 29/10//1997 [16]

(b) Bưởi Đường Lá Cam: Bưởi này có nguồn gốc ở Biên Hòa (Đồng Nai),

hiện nay là một trong những giống bưởi chủ lực trong các nhà vườn bưởi miền Đông Nam Bộ, được trồng khá tập trung ở huyện Vĩnh Cữu và huyện Tân Uyên.

Tán cây tròn đều, phân bố thấp, cành đều, lá xanh đậm, phiến hình mác, lá hình tim, bìa lá có khía tròn Quả hình quả lê thấp, màu xanh vàng khi chín, vỏ láng, dễ bóc, tép quả rất dễ tróc, màu vàng nhạt hoặc đồng nhất Nước quả nhiều hương vị thơm, rất ngon Khối lượng quả 1.300 g Năng suất 400 quả/cây Đây là giống đã được hai giải thưởng: giải I năm 1995 kỳ hội chợ Nông Nghiệp Quốc Tế tổ chức tại Cần Thơ và giải B trong kỳ hội thi “Cây có múi giống tốt” năm 1996 do VNCCAQMN tổ chức Cá thể

Hình 2.3: Quả bưởi Da Xanh

Hình 2.4: Quả bưởi Da Xanh xẻ dọc

thuộc giống đường lá cam mã số BC12 của ông Trần Văn Hoà ở Tân Bình - Vĩnh Cữu - Đồng Nai, đã được Bộ NNKH công nhận theo QĐ ngày 29/10/1997 Nhược điểm của giống này là số hạt khá cao (trung bình 60 – 90 hạt/ trái) Giống bưởi này dùng để lấy chồi ghép

(c) Bưởi Da Xanh: Bưởi có nguồn gốc ở tỉnh Bến Tre, được biết đến trong

những năm gần đây do phẩm chất rất ngon nên được sự chú ý của nhà vườn và người tiêu dùng Do mới phát triển nên diện tích còn khá nhỏ, chỉ tập trung ở xã Mỹ Thạnh An thuộc thị xã Bến Tre - tỉnh Bến Tre

Theo Phạm Ngọc Liễu (1998), trái của bưởi Da Xanh dạng hình cầu, màu sắc vỏ khi chín vẫn xanh, còn tép tróc khỏi vách múi tốt, có màu hồng đến đỏ không đều, tép bó khá chắc, nước quả khô, có vị ngon, ngọt và rất thơm Năng suất vượt trội với cá thể khác Nhược điểm là số hạt trên trái cao hơn các giống khác Giống bưởi này dùng để lấy chồi ghép

3.1.3.2 Các giống bưởi dùng làm gốc ghép

(a) Bưởi Xim Vang: Phân cành thấp, kích thước lá dài trung bình 3,0 cm chiều

rộng 2.5 cm Đây là giống có kích thước quả khá cao so với các giống khác cao 24,5 cm Hàm lượng vitamin C đứng hàng thứ 3, sau bưởi Đường Hồng và bưởi Đường Da Láng 37,8%, trọng lượng quả 1,999g Hiện nay, bưởi Xim Vang được trồng nhiều ở Đồng Nai (Nguyễn Văn Kế, 1995)

(b) Bưởi Bồng: Là giống bưởi ở Huế, theo những nghiên cứu khác nhau thì đây

Hình 2.5: Vườn cây bị tàn phá do virus tristeza (cành chết khô và không có trái)

Hình 2.6: Cây bưởi bị nhiễm bệnh virus tristeza (cây lùn và

2.2.1.1 Citrus Tristeza virus (CTV)

Virus gây bệnh này có nguồn gốc từ nhiều năm trước ở Trung Quốc Tristeza là bệnh tàn phá rất lớn trên citrus ở Bắc và Nam Mỹ, mặc dù có khoảng phân bố rất rộng trên thế giới Bệnh hiện không còn ở Argentina, Brazil và Uruguay, đây cũng là bệnh nguy hiểm ở Nhật Bản Bệnh cũng được xác định là có hiện diện ở nước ta [27]

Bệnh do virus dạng sợi dài (2 x 10 – 11 nm), tập trung và làm hỏng mạch dẫn nhựa libe trong cây, xuống rễ và làm suy dinh dưỡng như rụng lá, chết đọt, lùn cây và thường thối rễ Bệnh có thể lộ ra ở cây con mới trồng hay ở cây lớn bị

Hình 2.7: Triệu chứng bệnh “nổ lá” suy dinh dưỡng Cây có mang mầm bệnh có thể vẫn thấy khỏe mạnh trong liếp ươm nhưng sớm lộ triệu chứng ngay sau khi trồng Cây mang bệnh mãn tính sẽ bị lùn, phù gốc do mắt tháp phát triển quá khổ Hầu hết các giống cam quýt đều có triệu chứng sọc lõm ở gỗ thân và cành (stem pitting) Một dạng đặc trưng của bệnh là triệu chứng tổ ong khi dùng cam chua làm gốc ghép: khi tách vỏ ở vùng bên dưới mắt tháp sẽ thấy nhiều lỗ nhỏ xếp cụm trong gỗ [27]

Bệnh được truyền bởi một loài aphid có tên là Toxoptera citricida Kirkaldy

Người ta kiểm tra thấy rằng nếu 5 aphid tấn công cây thì 50% cây sẽ bị nhiễm và nếu 15 aphid tấn công cây thì 70% sẽ bị nhiễm Người ta cũng nhận thấy rằng các type khác nhau của virus này đều gây bệnh được [27]

CTV nhiễm trên tất cả các loài (nhân giống và tháp ghép) của cây citrus Nó được tìm thấy trên toàn thế giới và có nhiều giống khác nhau, trong các type khác nhau đó có các type tàn phá rất lớn Bệnh chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường, các dạng khác nhau của cây citrus và các nòi virus khác nhau Khi cây được ghép trên gốc kháng thì cây có khả năng phục hồi lại sau đó [27]

2.2.1.2 Citrus tatter leaf virus ( CTLV)

CTLV được phát hiện đầu tiên 1962, trên cây chanh Mayer thuộc Trung Quốc Sau đó một vài loài virus cũng được phát hiện trên giống chanh đó ở Australia và ở phía Nam châu Phi [27]

Bệnh do virus dạng sợi tóc và truyền bệnh bằng côn trùng hoặc các vector khác Con đường chủ yếu là lây qua nhân giống và tồn tại ở chồi Loại virus này được

truyền qua nhựa cây, có thể truyền khi cắt cành và công cụ làm vườn khi cắt cây bệnh trước [7]

Hầu hết các loài citrus khi nhân từ giống có chứa loài virus này không thấy triệu chứng Tuy nhiên, cây nhiễm đều bị lùn, chậm tăng trưởng, lá biến dạng và nổi u

Hình 2.8: Gốc cây bị bệnh bong vỏ gốc thân

2.2.1.3 Citrus exocortis virus (CEV)

CEV được phát hiện đầu tiên năm 1948, ở Australia và bây giờ nó có ở khắp nơi trên thế giới Bệnh làm chậm tăng trưởng trên cam Bệnh rất dễ lây qua ghép, ở các chồi ghép và không thấy triệu chứng khi nhân giống Thể viroid truyền qua cơ giới công cụ cắt và tỉa cành [27]

Mầm bệnh do một loài viroid của virus, viroid làm chết vỏ, khô, vỡ ra và có thể bóc vỏ được dễ dàng Nhựa thì không có dưới lớp vỏ của cây như vậy Bệnh có thể nhiễm ở hầu hết loài citrus khi nhân giống và luôn tiềm ẩn trong cây [27]

2.2.2 Môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt

Đối với cây thuộc họ cam quýt thì nguyên nhân truyền bệnh do công cụ làm cắt tỉa cành trong vườn, do các loại côn trùng truyền bệnh mà trong đó rệp là tác nhân chủ yếu Rệp sống chủ yếu bằng cách hút nhựa và chất kích thích sinh trưởng ở các bộ phận non của cây do đó thường làm cho cây giảm quang hợp, nếu tấn công trên trái thì làm trái nhỏ sẽ bị rụng, bị đen, kích thước trái nhỏ, dị dạng, giảm chất lượng quả từ đó làm giãm giá trị thương mại Đồng thời, rệp còn là tác nhân truyền bệnh virus gây hại rất lớn cho các cây thuộc họ cam quýt nói riêng và nhiều loại cây trồng khác nói chung Phân của các loài rệp này thải ra quyến rũ nấm bồ hống đến cộng sinh làm giảm khả năng quang hợp của cây, do phân của chúng chứa một lượng đường rất cao Đồng thời phân của chúng còn có thể hấp dẫn các loài kiến khác nhau đến tha chúng đi nơi khác để tiếp tục gây hại cho cây trồng [3, 7]

Rệp hại cây trồng được phân ra làm hai nhóm chủ yếu là nhóm rệp muội hay còn gọi là rầy mềm, nhóm thứ hai là nhóm rệp sáp

2.2.2.1 Rệp muội hại cây trồng

Nhóm rệp này chỉ có một họ duy nhất là Aphididae thuộc bộ cánh đều, có thân mềm, dài từ 1 – 2 mm, dạng hình quả lê, trần trụi, cuối bụng có phiến đuôi và hai ống bụng hai bên Có thể có cánh hoặc không có cánh tuỳ theo điều kiện sinh sống (thời

Hình 2.9: Các môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt

A: Rệp muội xanh Aphis citricola B: Rệp muội nâu Toxoptera citricidus C: Rệp muội đen Toxoptera aurantii

 Gồm có 5 họ với 91 loài khác nhau phân bố rộng khắp các vườn cây ăn trái Asterolecaniidae có 2 loài

Coccidae với 19 loài (rệp sáp)

Diaspididae với 53 loài (rệp sáp vảy và rệp sáp dính) Margarodidae với 3 loài (rệp sáp trắng và sáp bông) Pseudococcidae với 14 loài (rệp sáp giả)

 Thành phần rệp hại cây trồng đã đƣợc thống kê tại Việt Nam

Bảng 2.1 : Thành phần rệp hại cây trồng thuộc họ cam quýt chủ yếu ở Việt Nam

Toxoptera aurantii Aphididae

Toxoptera citricidus Aphididae

Toxoptera citricola Aphididae

Icerya purchasi Margarodidae

Planocuccus citri Pseudococcidae

Planococcus citriculus Pseudococcidae

Chloropulvinaria

Saissetia coffeae Coccidae

Anonidiella aurantii Diaspididae

Chrysonphalus

(Theo Nguyễn Mạnh Chinh, 2002)

Hình 2.10: Hạt bưởi nảy mầm

2.3 Các cách nhân giống của cây bưởi

Để nhân giống các cây cam quýt nói chung và cây bưởi nói riêng ta có thể sử dụng các cách nhân giống khác nhau như gieo hạt, chiết cành, giâm cành, ghép

2.3.1 Nhân giống cổ điển

2.3.1.1 Nhân giống bằng hạt

Đây là cách nhân giống được bắt đầu khi loài người biết trồng cây ăn quả Đây là quá trình tạo cây con từ hạt, hạt được hình thành do sự thụ tinh của tế bào hạt phấn và tế bào noãn, cây mới mọc mang đặc tính của cả bố và mẹ hoặc nghiêng hẳn về bố hoặc mẹ Cách nhân giống này áp dụng chủ yếu để lấy cây con làm gốc ghép Rất ít vùng dùng cây con làm giống vì phải 8 – 10 năm mới có thể cho quả được [6 – 12]

 Các yêu cầu khi chọn hạt làm gốc ghép để nhân giống:

 Chọn những hạt mẩy không sâu bệnh từ quả tốt để làm giống

 Chọn cây thích hợp với điều kiện tự nhiên của địa phương có năng suất cao, phẩm chất tốt

 Chọn cây là những cây ổn định về mặt sinh trưởng, có từ 6 – 7 năm tuổi trở lên  Chọn cây sinh trưởng khỏe, có bộ rễ phát triển mạnh, cành phân tán cân đối, lá

tươi tốt, không sâu bệnh

2.3.1.2 Nhân giống bằng cách chiết cành

Cây có múi nói chung đều dễ nhân giống bằng phương pháp chiết nhánh bó bầu Nguyên liệu nhân giống là cành đã có búp sinh trưởng, chỉ cần bóc một khoảnh vỏ bó đất, khi cành ra rễ mới cắt khỏi cây mẹ Ưu điểm của phương pháp là vì chưa cắt khỏi cây mẹ nên cành được nuôi một phần bằng nhựa cây mẹ nên cành dễ sống hơn [14, 15]

 Bó chổ cắt bằng rêu ẩm

 Dùng bọc và dây buột chặt lại

Hình 2.11: Cách thực hiện chiết cành Cách thực hiện gồm các bước chủ yếu sau đây:

 Chọn cành dài khoảng 15 – 30 cm, cũng có thể làm vào mùa hè lúc đó vỏ cây còn cứng Sau đó, cắt lột bỏ lớp một lớp vỏ và cạo bỏ lớp vỏ cứng bên ngoài một cách nhẹ nhàng, có thể bổ sung indolebutyric acid lên bề mặt

lát cắt (là một loại hormon tạo rễ)

2.3.1.3 Nhân giống bằng cách giâm cành

Phương pháp này dựa trên khả năng hình thành rễ phụ (rễ bất định) của các đoạn cành đã cắt rời khỏi thân mẹ (hoặc các đoạn rễ) Ngày nay, phương pháp này được ứng dụng rộng rãi nhằm nhân giống các cây công nghiệp, cây lâm nghiệp Ở nước ta, việc nhân giống chanh bằng phương pháp giâm cành rất phổ biến nhằm tạo cây lùn, nhanh thu hoạch quả và chu trình kinh doanh khai thác ngắn nhưng hiệu quả cao [15]

Nhà giâm cành nói chung phải thoáng mát, kín gió, trao đổi không khí tốt Cành để thực hiện nhân giống là những cành bánh tẻ, phần lớn là những cành ra trong năm, có khi ra cùng trong vụ xuân hoặc hè Nguyên tắc chung là chọn những cành lưng chừng tán, ngoài bìa tán và những cành ở cấp cành cao (những cành không mang hoa, quả và những cành ổn định sinh trưởng chưa lâu)

Cắt cành giống vào thời gian không có nắng trong ngày: sáng sớm hay chiều tối vì cành lá sẽ mất nước đột ngột, tỉ lệ ra rễ kém

Cành cắt xong cần được phun nước cho ướt lá rồi dựng đứng vào trong xô hoặc thùng có chứa nước sạch, đậy lại bằng vải màu tối đã thấm ướt

Cành sau đó được xử lý lại, đối với cành dễ ra rễ có thể cắm thẳng vào nền giâm, hoặc xử lý hóa chất ra rễ ở nồng độ thấp (NAA, IAA hay IBA)

Phải thường xuyên duy trì độ ẩm từ lúc cắm cành cho đến lúc ra rễ Nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo rễ ở cây ăn quả là 21 – 26oC

Khi rễ của cành giâm mọc đủ dài, hơi chuyển từ màu trắng sang màu vàng và dẻo thì phải ra ngôi kịp thời trong vườn ươm hay túi polymer

2.2.1.4 Nhân giống bằng cách ghép

Ghép là phương pháp đem cành hay mầm nhánh của cây mẹ có nhiều ưu điểm như phẩm chất tốt, năng suất cao… gắn sang gốc một loại cây khác để tạo thành một thể mới thống nhất [12]

 Thay đổi được tính trạng đực khi ghép cây cái lên cây đực

 Nhược điểm

 Kỹ thuật ghép tiến hành phức tạp hơn giâm cành, chiết cành  Cần phải có kiến thức nhất định về cây tiến hành ghép  Cần phải nghiên cứu khi ghép khác họ khác loài

 Có khoảng 30 loại bệnh lây lan qua đường ghép do mycoplasma, virus, viroid, vi khuẩn

Biểu bì Nhu mô

Cương mô Libe

Tượng tầng

Nhu mô tủy

Thân cây hai lá mầm Mộc

Hình 2.12: Thân cây hai lá mầm

(a) Cơ sở kết hợp của gốc ghép và cành ghép

Cấu trúc thân cây cắt ngang có ba phần chính: lớp vỏ ngoài cùng có nhiệm vụ dẫn nhựa luyện từ lá xuống rễ, phần gỗ phía trong dẫn nhựa nguyên từ gốc lên cành lá, phần giữa gỗ và vỏ là tượng tầng mô phân sinh rất mỏng, có khả năng phân chia nhanh, tạo nên gỗ bên trong và vỏ bên ngoài

Việc kết hợp giữa gốc và cành ghép gồm 4 bước như sau:  Áp sát phần tượng tầng của gốc với cành ghép

 Lớp tế bào tượng tầng ngoài của gốc và cành ghép tạo ra những tế bào nhu mô dính lại với nhau gọi là mô sẹo

 Các tế bào nhu mô của mô sẹo phân hoá thành những tế bào tượng tầng mới, kết hợp với tượng tầng nguyên thủy của gốc và cành ghép

 Các tế bào tượng tầng mới tạo ra những mô mạch mới, gỗ bên trong và libe bên ngoài, hình thành sự kết hợp mạch giữa gốc và cành ghép giúp dinh dưỡng và nước được vận chuyển qua lại

(b) Điều kiện để ghép cành

Để đảm bảo việc ghép cành thành công cần phải lưu ý một số yếu tố sau [12, 14, 15]:  Các cây ghép với nhau phải cùng một họ để có khả năng kết hợp cao, tốt nhất là cùng loài, cùng thứ

 Gốc ghép, cành ghép cần có mức sinh trưởng tương đương nhau để có khả năng kết hợp tốt

 Hai bộ phận ghép phải được áp chặt nhau để tăng khả năng kết dính, chỗ ghép không được dơ, nóng hay bị ẩm ướt

Cành ghép Gốc ghép

Cài hai lưởi gà vào với nhau

Dùng kẹp kẹp lại

Cắt rời cành ghép khỏi gốc ghép

(c) Các phương pháp ghép

 Ghép áp

Khi gốc ghép và cành ghép có đường kính tương đương nhau ta đem chúng lại gần nhau và áp lại với nhau Dùng dao vát một miếng nhỏ để lộ tượng tầng ở gốc ghép và cành ghép, buộc chặt cành ghép và gốc ghép lại với nhau theo vị trí vết cắt Sau 40 – 50 ngày vết cắt sẽ liền sẹo, cắt bỏ ngọn gốc ghép và cắt rời gốc cành ghép

Phương pháp này cho tỷ lệ sống rất cao (90 – 95%) nhưng rất công phu và hệ số nhân thấp [12, 15]

 Ghép cành

Ghép cành là một phương pháp khá phổ biến trong nhân giống cây ăn quả, áp dụng trong các trường hợp cây khó lấy mắt hoặc trong những thời vụ mà nhiệt độ và ẩm độ thấp, sự chuyển động của nhựa trong cây kém Nhiều khi kết hợp giữa ghép đoạn cành và ghép mắt để tận dụng cành ghép [12, 15]

A : Gốc ghép được cắt chữ T B : Lấy mắt ghép từ cành ghép C : Mắt ghép đã sẵn sàng để ghép D : Mắt ghép được ghép vào vết cắt E : Buộc chặt mắt ghép vào gốc ghép Mắt

Hình 2.15: Chồi nách trên thân cây

 Ghép mắt

Người ta bóc lấy một mắt ở nách lá trên một cành bánh tẻ của cây mẹ và một mảnh vỏ trên gốc ghép Áp mắt ghép vào chỗ đã bóc vỏ trên gốc ghép rồi buột lại Khi mắt ghép nảy mầm sẽ tạo một cây ghép Ghép mắt có ưu điểm là hiệu suất lao động cao, thao tác đơn giản

Ghép mắt gồm các phương pháp ghép chủ yếu sau:

 Ghép cửa sổ

 

 Ghép chữ T

A: Gốc ghép

B: Gốc ghép được tạo “cửa sổ” C: Mắt ghép được đặt vào “cửa sổ” D: Dùng dây buộc chặt mắt ghép vào gốc ghép

Hình 2.16: Cách ghép cửa sổ A

A B C A : Gốc ghép được lấy một mảnh cả vỏ và thân

B : Mắt ghép cũng được lấy một mảnh tương tự C : Áp mắt ghép vào gốc ghép và buộc dây

2.3.2 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô

Trong trường hợp cây ăn quả lâu năm, kỹ thuật ghép đang chiếm vị trí hàng đầu trong nhân giống vì kết hợp được khả năng chống chịu của gốc hoang dã với mắt ghép có ưu điểm năng suất và phẩm chất tốt Tuy nhiên trong lúc ghép theo kỹ thuật truyền thống, do thời gian trồng gốc ghép kéo dài và kích thước mắt ghép khá lớn nên bệnh virus có thể truyền lây

Để khắc phục nhược điểm trên, kỹ thuật ghép đỉnh sinh trưởng gọi tắt là vi ghép được thử nghiệm và mang lại kết quả tốt Về nguyên tắc, vi ghép là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhưng qua dinh dưỡng của gốc ghép Đỉnh sinh trưởng làm mắt ghép có kích thước từ 0,2 – 0,5 mm, được tách từ búp non đang sinh trưởng mạnh của cây mẹ

bằng phương pháp này hoàn toàn sạch bệnh và mang đặc điểm di truyền của cây mẹ cho mắt ghép [14]

2.3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến vi ghép

 Chất điều hòa sinh trưởng

Sẽ có lợi hơn nếu các chồi ghép được đặt nuôi cấy trong môi trường MS có chứa chất điều hòa sinh trưởng Jonal và ctv (1983) đã chứng minh, thêm Cytokinin vào môi trường nuôi cấy (0,1 mg Zeatin/l nếu chồi nuôi cấy trong 48 giờ; 0,01 mg Zeatin/l nếu nuôi thêm 48 – 240 giờ) có hiệu quả đặc biệt kích thích sự tiếp hợp nhanh chóng của gốc ghép và chồi ghép Để mỗi lần ghép thành công, có một cách là nuôi chồi ghép trong môi trường nuôi cấy có chất điều hòa sinh trưởng trong một thời gian ngắn trước khi ghép 5 – 10 phút trong môi trường 10 mg/l 2,4 D hoặc 1 mg/l BAP làm tăng tỷ lệ thành công đối với cây có múi (Edriss và Burger, 1984) Starratino và Caruso (1998), đạt tỷ lệ cây ghép sống khá cao khi nhúng chồi ghép và mặt cắt gốc ghép vào môi trường có 0,5 mg/l BAP trong 20 phút trước khi cả hai ghép lại với nhau

 Sự hóa nâu và khô dần của chồi ghép

Chồi khô dần là nguyên nhân dẫn đến sự thất bại của kỹ thuật Để ngăn cản quá trình này, Piego Alfaro và Murashige (1987) đã dùng lớp vỏ mỏng môi trường dinh dưỡng có agar để liên kết nơi ghép Agar sẽ làm tăng sự phát triển của chồi và chất dinh dưỡng từ khối agar được tiết ra nuôi chồi trong suốt tuần thứ nhất đến tuần thứ ba

sau khi ghép; nếu không sẽ có kết quả là cây ghép rất yếu

Chồi bị hóa nâu nguyên nhân do các chồi ghép quá nhỏ hay thao tác quá chậm, có thể hạn chế bằng cách ngâm chồi trong dung dịch chống oxy hóa 2g/l Sodium Diethyldithiocarabamate (DIECA) hoặc nhỏ một giọt dung dịch lên trên mặt cắt của gốc ghép ngay trước khi ghép chồi lên Theo Navarro (1988) thì thao tác nhanh kỹ thuật ghép nhanh sẽ ngăn cản quá trình oxy hóa phenol và có hiệu quả hơn những chất chống oxy hóa

Với 0,5 mg/l NAA đã làm tăng đáng kể tỷ lệ sống của tổ hợp ghép (37,5%) cao hơn rất nhiều so với môi trường không có NAA (10,43%)

Hơn nữa khi có NAA thì không cần thường xuyên khử chồi phụ so với khi không có NAA phải khử chồi phụ mỗi tuần hoặc 15 ngày một lần vì NAA ức chế sự hình thành

và phát triển của các chồi phụ nhưng kích thích gốc ghép mọc nhiều rễ phụ và phát triển rất tốt

Khi kết hợp NAA và Kinetin với nồng độ trên, chồi ghép mau liền sẹo và phát triển tốt, sau 3 tuần kích thước chồi đạt 8 mm Tuy nhiên gốc có hiện tượng hình thành mô sẹo và không hình thành rễ cho dù ta cấy chuyền sang môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng sau 2 tuần Với 3 mg/l Adenin cây ghép có tác dụng ngược lại Hiện tượng mắt ghép bị nâu đen hay bị khô đều thấy ở tất cả độ tuổi gốc ghép

 Tuổi của gốc ghép

Thí nghiệm với gốc ghép ở độ tuổi khác nhau 15, 21, và 60 ngày cho thấy gốc già, cứng nên khó cắt và dễ bị dập nơi vết cắt nhưng ngược lại do vỏ dầy cứng nên giữ được mắt ghép khi ta đặt vào, mắt ghép ít bị rơi khỏi nơi ghép và dễ liền sẹo sau khi ghép Tuy nhiên chú ý phải nhẹ nhàng khi đặt mắt ghép vào tránh kẹp chặt làm tổn thương cành ghép Tuổi gốc ghép còn nhỏ thì nơi ghép dễ bị mô sẹo hoá và tốt nhất là

gốc ghép ở độ tuổi 15 ngày sau nảy mầm

 Độ lớn của mắt ghép

Chồi ghép có thể lấy trực tiếp hoặc nuôi cấy một thời gian ngắn trước khi ghép Tỷ lệ ghép thành công sẽ cao hơn khi nuôi lớn những đỉnh sinh trưởng độc lập cho đến khi chúng có kích thước lớn hơn trước khi chúng được ghép (17, 1)

Khi thử với gốc ghép có độ tuổi thích hợp là 14 ngày, mắt ghép gồm 3 kích thước tương ứng với tỷ lệ thành công:

0,10 – 0,15 mm (2 mầm lá): 20% 0,20 – 0,30 mm (4 mầm lá): 30%

 Khử chồi phụ

Trong nách lá mầm của gốc ghép có mắt ngủ, bình thường thì bị ưu thế ngọn ức chế Khi ghép, chồi ngọn bị khử nên chúng phát sinh rất nhanh, gây ức chế phát triển của mắt ghép Để tránh tình trạng này cần khử mắt chồi ngủ bằng cách khoét vào thân khi cắt bỏ hai lá mầm để loại chồi ngủ

Chồi ngủ cũng có thể phát sinh từ tượng tầng của mặt cắt trên gốc ghép, cần

phải loại bỏ chúng ngay khi phát hiện để tạo điều kiện cho chồi ghép phát triển nhanh

2.3.2.2 Chuyển cây ra vườn ươm

Cây ghép trong ống nghiệm có bộ rễ tự nhiên rất khoẻ, vì vậy khi đưa ra ngoài đất dễ sống Cần lưu ý rửa sạch môi trường dinh dưỡng để bộ rễ không bị nấm bệnh Đất phân làm bầu nên khử trùng để tránh gây nhiễm bệnh và trồng ở khu vực cách ly tốt

2.3.2.3 Lịch sử hình thành và phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1838, hai nhà thực vật học người đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi cơ thể sinh vật đều gồm nhiều tế bào tạo thành Các tế bào đã phân hoá đều mang các thông tin di truyền có trong các tế bào đầu tiên, tế bào là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schlieden và Schwann vào thực nghiệm

Năm 1922, Kotte học trò của Haberlandt là Robbins đã lập lại thực nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ của một cây hòa thảo Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh tạo nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô thực vật, khi White nuôi

cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua (Lycopercium esculentum L.)

với môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men Sau đó ít lâu White chứng minh là có thể thay thế nước chiết nấm men bằng ba loại hỗn hợp vitamine nhóm B: Thiamine (B1), Pyridoxine (B6), và Nicotinic acid Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều loại cây khác nhau Cũng trong thời gian này Gautheret ở Pháp đã tiến hành nuôi cấy mô tượng tầng một số cây gỗ Sau khi Went và Thimann phát hiện chất điều hoà sinh trưởng (hormone) đầu tiên, acid – indol acetic (IAA) và đã kết tinh được chất này

Năm 1939, Gautheret đã thành công trong duy trì sự sinh trưởng trong thời gian

vô hạn của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trường bằng thạch, bằng cách cấy

chuyền 6 tuần 1 lần

Năm 1941, Overbeck chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy mô họ cà (Datura) Sau đó vào năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nước dừa lên mô sẹo cà rốt Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công Chất napthyl acetic acid (NAA) và chất 2,4 – dichloro phenoxy acitic acid (2,4 – D) được bắt đầu sử dụng để trừ cỏ lá rộng trong nông nghịêp Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, 2,4 – D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào ở nhiều đối tượng thực vật trước đó rất khó nuôi cấy

Năm 1954, Skoog tình cờ thấy nếu thêm một ít chế phẩm đã được để lâu của acid desoxyribonucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá thì tác dụng kích thích sinh trưởng trở nên rất rõ rệt Năm 1955, chất này được xác nhận là 6-furfurylaminopurine và được Skoog đặt tên là kinetin, có tác dụng kích thích sự phân bào Sau này, người ta chứng minh rằng sự phân bào ở thực vật trong tự nhiên cũng do các chất hoá học tương tự kinetin điều khiển và gộp chung các chất này vào nhóm cytokinin Chất cytokinin đầu tiên được tách từ thực vật bậc cao là zeatin từ mầm ngô

Năm 1957, Skoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá Khi giảm tỷ lệ kinetin/auxin mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ, ngược lại thì khi tỷ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo Hiện tượng này được xác nhận trên nhiều loại cây trồng khác nhau và đóng góp rất lớn vào quá trình điều khiển sinh trưởng phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô thực vật là nhân giống cây trồng

2.3.2.4 Một số kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

 Nuôi cấy mô phân sinh  Nuôi cấy tế bào lát mỏng  Nuôi cấy hạt

2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về kỹ thuật vi ghép 2.4.1 Nghiên cứu trong nước

Lê Trần Bình (1993), thực hiện thành công vi ghép trong nhân giống cam chanh

Đoàn Thị Ái Thuyền và Nguyễn Văn Uyển (1999), vi ghép thành công cây cam quýt

Kết quả đạt được qua 2 nghiên cứu trên như sau:

 Cách ghép chữ T ngược cho kết quả tốt nhất trong thực hiện vi ghép

 Tuổi cây ghép từ 10 – 20 ngày sau khi nảy mầm là tuổi gốc ghép cho kết quả tốt nhất

 Mắt ghép càng lớn sẽ cho khả năng sống của cây ghép càng cao, mắt ghép có kích thước từ 0,1 – 0,15 mm cho tỷ lệ thành công của cây ghép là 20%; mắt ghép có kích thước từ 0,2 – 0,3 mm cho tỷ lệ thành công 30%; mắt ghép có kích thước từ 0,4 – 0,6 mm cho tỷ lệ cây sống 55%

 Trong một tuần mắt ghép đã đạt kích thước 1,2 – 2 mm và sau 4 tuần chồi ghép đã có kích thước 15 x 20 mm, rễ của gốc cũng mọc thêm nhiều rễ phụ Cây ghép có thể trồng ra đất được

Viện nghiên cứu cây ăn quả miền nam (1995) đã tiến hành vi ghép thành công cây thuộc họ citrus và tiến hành trồng thử nghiệm ở 6 tỉnh khác nhau Gốc ghép thứ nhất là cây Troyer và đỉnh sinh trưởng được ghép lên là các loại cây ăn quả có giá trị kinh tế Cây ghép được nuôi trong môi trường MS lỏng với 7,5% đường sau 40 – 60 ngày nuôi cây thì cây có từ 2 – 3 lá tuỳ theo giống, với cách ghép hình tam giác và đỉnh sinh trưởng có kích thước 0,1 – 0,16 mm Gốc ghép lần hai là gốc Volkameriana được gieo trên giá thể đất Cây ghép lần hai được nuôi trong thời gian từ 4 – 6 tháng thì có thể đem trồng ra vườn được

Lê Thị Thu Hồng (1997) đã tiến hành vi ghép trên cây thuộc họ cam quýt và kiểm tra tính chất sạch bệnh của cây vi ghép, kết quả cho thấy 52/53 cây đem kiểm tra đều sạch bệnh Từ nguồn vật liệu ban đầu đến năm 1998 đã sản xuất 5.755 cây sạch

bệnh trên gốc Volkameriana gồm 960 cây quýt Đường, 880 cây quýt Tiều, 240 cây Cam ngọt và 525 cây bưởi Năm Roi

2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước

Năm 1952, Morel và Martin đã thành công khi tạo được cây sạch virus bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ chồi nhiễm virus

Roistacher, 1972 đã xử lý cành ghép ở 500C bằng hơi nuớc nóng và loại bỏ được virus gây bệnh “nổ lá”, đồng thời ông cũng chứng minh được rằng có thể xử lý nhiệt để loại bỏ bệnh lùn cây không rõ nguyên nhân ở cam

Huang và Millikan, 1980; Ke và ctv 1993; Mantel và ctv, 1997; Navarro va Juarez, 1997; Perrin và ctv, 1994 đã ứng dụng thành công kỹ thuật vi ghép trên cây táo để tái sinh cây mới và tạo được cây sạch virus

Năm 1991, Navarro và ctv chứng minh rằng bệnh loét, bệnh greening và các dòng độc của virus tristeza đều có thể loại bỏ bằng kỹ thuật vi ghép

Năm 1992, Duran và cộng tác viên đã thành công khi tiến hành vi nhân giống và nuôi cấy mô cây cam ngọt

Năm 1995, Bowman đã thành công khi vi nhân giống gốc của cây citrus

Năm 1997, Turbull và ctv đã ứng dụng kỹ thuật vi ghép để kiểm tra khả năng tạo chồi trên cây thuộc họ Arabidopsis Họ đã sử dụng kỹ thuật vi ghép đơn giản (1 gốc ghép – 1 chồi ghép) để kiểm tra sự tương tác giữa gốc ghép với chồi ghép và kỹ thuật vi ghép hai chồi trên gốc để nghiên cứu tương tác giữa hai chồi ghép với nhau Qua nghiên cứu này, họ đã kết luận được rằng khả năng tạo chồi trên cây ghép do sự di chuyển từ gốc ghép sang chồi ghép và không có con đường ngược lại Với phương pháp vi ghép nhóm nghiên cứu có thể xác định những gen có liên quan đến các đặc tính của cây như thời gian ra hoa, hệ thống gen kháng và các phản ứng sinh học với stress

Cùng với kỹ thuật vi ghép này, A Starrantino và ctv đã ứng dụng để phục hồi các cây citrus bị nhiễm bệnh virus bằng cách vi ghép đỉnh sinh trưởng lên gốc được tạo từ hạt và thu được tỷ lệ sống 40% Sau khi nghiên cứu các phương pháp ghép khác

nồng độ 0.5 ppm trong 10 phút trước khi ghép thì có thể nâng tỷ lệ sống của cây lên 73% – 91%, nhưng thường đạt 63%

Năm 1999, Carimi và ctv đã tái sinh được phôi vô tính và hình thành cây khi nuôi cấy lớp mỏng tế bào nhụy của cây citrus

Ở Jamaica, Potluri và Sasikala đã tiến hành ghép đỉnh chồi (0.1 – 1 mm) lên gốc cây kháng và đã thu được kết quả rất tốt

J Dobranszki và ctv, 2000 đã nghiên cứu tìm ra phương pháp làm tăng tỷ lệ sống của cây táo vi ghép và tạo được điều kiện duy trì sự tiếp xúc tốt giữa gốc và chồi ghép Kết quả nghiên cứu cho thấy khi nhúng mặt cắt của gốc ghép và chồi ghép vào hỗn hợp acid citric 0.15 mg/l, ascorbic acid 0.1 mg/l và gibberellic acid 0.1 mg/l trước khi ghép sẽ tăng tỷ lệ sống của cây vi ghép lên đến 95% Một kết quả khác của nhóm là chồi ghép trước khi đặt vào vị trí ghép trên gốc ghép nếu được nhúng vào dung dịch agar 0.1% thì khả năng dính của chồi ghép vào gốc ghép tốt hơn, agar làm cho sự dung hợp giữa gốc và chồi ghép tốt hơn cây ghép thích nghi nhanh và đạt tỷ lệ sống 100%

Năm 2001, Emmarol E Mneney và Sinclair H Mantell đã thành công khi tiến hành vi ghép trên cây điều thu được kết quả tỷ lệ thành công của cách ghép là 60% - 80 %, vị trí ghép không có sự khác biệt nhau khi xét trên khă năng thành công Đồng thời các nhà khoa học đã tìm ra nồng độ các chất khống chế hoạt chất phenol của cây điều: với 200 µM ascorbic acid cho tỷ lệ thành công là 73%, 2mg/l Diethyl – dithocarabamate (DIECA) cho tỷ lệ thành công 55% và 3% (w/v) Polyvinyl purrolidone (PVP) cho tỷ lệ thành công 41%

Năm 2002, A Onay và ctv đã thành công khi tiến hành vi ghép trên cây đào lạc kết quả thu được tỷ lệ thành công khi ghép là 70% khi cây ở 1 năm tuổi và 90% cây sống khi đem ra ngoài trồng

Năm 2003, trường đại học Rajshahi ở Bangladesh đã thành công khi tiến hành tái sinh cây bưởi từ mô sẹo và kết quả thu được khi nuôi cấy trên môi trường MS có chất kích thích sinh tưởng BAP với nồng độ 1 mg/l kết hợp với NAA 5 mg/l cho khả năng hình thành mô sẹo tốt nhất và các cây đạt 95% sống khi trồng ra đất

Năm 2003, tổ chức FFTC (Food and fertilizer technology center) ở châu Á đã thành công khi vi ghép trong nhà kính tạo cây cam sạch virus ở tỉnh Nghệ An

Tháng 3 năm 2004, trường đại học của California đã thành công khi tiến hành ghép chồi lên gốc cây kháng và đã thu được kết quả rất tốt cũng như việc xác định ảnh hưởng của 2,4 – D, ABA và kinetin lên sự hình thành mô sẹo

Năm 2003 Bash, Jonh và ctv đã dùng kỹ thuật vi ghép kết hợp với xử lý nhiệt và hóa chất để tạo ra những cây citrus sạch bệnh Kết quả đã tạo ra những cây citrus sạch bệnh mặc dù trước đó họ đã dùng các đỉnh sinh trưởng dương tính với Citrus Tristeza Virus