Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ hoạt tính xúc tác của enzyme papain trong đu đủ

Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ hoạt tính xúc tác của enzyme papain trong đu đủ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

LÊ TH
ANH TH

ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ

LÊN HOẠT TÍNH XÚC TÁC

CỦA ENZYME PAPAIN TRONG ĐU ĐỦ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Mã ngành: 08

Người hướng dẫn

NGUYN TH
THU THY

NĂM 2008

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Thị Thu Thủy, người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cũng như truyền đạt những kiến thức chuyên môn sâu sắc, bổ ích để em có thể hoàn thành tốt đề tài luận văn này

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã tận tụy giảng dạy và truyền thụ những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập

Em chân thành cảm ơn quý thầy cô của bộ môn Sinh Lý- Sinh Hóa và phòng thực tập Sinh Hóa đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ trang thiết bị cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cố vấn học tập Nguyễn Hữu Lộc và tập thể các bạn lớp Công Nghệ Thực Phẩm K29 đã giúp đỡ và động viên em trong suốt khóa học qua cũng như thời gian thực hiện đề tài

Cần Thơ, ngày …tháng…năm 2008

Sinh viên thực hiện

TÓM LƯỢC

Với nền nông nghiệp phát triển lâu đời và phong phú như nước ta, có thể nói việc cung ứng các loại nguyên liệu trái cây không phải là khan hiếm về cả số lượng cũng như chất lượng; và đu đủ là loại cây ăn quả khá phổ biến, thân thuộc với người dân trên khắp đất nước Tuy nhiên, đu đủ chỉ chủ yếu được sử dụng cho tươi sống nên giá trị kinh tế vẫn chưa cao vì thời gian bảo quản tương đối ngắn Sự ra

đời chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết và tinh khiết (một loại protease) thu

nhận từ nhựa đu đủ xanh được xem như một phương pháp tích cực nhằm thúc đẩy giá trị của cây đu đủ vốn lâu đời này Trên cơ sở đó, đề tài tiến hành khảo sát khả năng trích ly enzyme từ nhựa đu đủ xanh và yếu tố bên ngoài (nhiệt độ, pH) ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân protein (casein) của papain trong khoảng nhiệt độ từ 30oC - 60oC, pH = 5,5 - 8,0 Từ đó có thể tìm ra được quy luật và nhiệt độ, pH thích hợp để enzyme thể hiện hoạt tính cao nhất

Kết quả thí nghiệm cho thấy, có khả năng trích ly và tinh chế chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết từ nhựa đu đủ xanh ở dạng bột mịn, trắng có độ ẩm thấp và bảo quản lạnh đông (-20 oC ) trong quá trình sử dụng

Có sự tương tác qua lại giữa nhiệt độ và pH môi trường lên hoạt tính xúc tác của enzyme papain

1.1 Giới thiệu chung 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu về cây đu đủ 2

2.2 Giới thiệu về papain trong đu đủ 3

2.2.1 Cấu tạo và hoạt tính 3

2.2.2 Cơ chế hoạt hóa và kìm hãm 5

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng 6

2.3 Giới thiệu về phản ứng thủy phân của papain 8

2.4 Giới thiệu về cơ chất casein 9

2.5 Phương pháp xác định hoạt tính papain (phương pháp Kunitz) 11

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 Phương tiện nghiên cứu 12

3.1.1 Địa điểm, thời gian thực hiện 12

3.1.2 Nguyên liệu 12

3.1.3 Hóa chất thí nghiệm 12

3.1.4 Thiết bị thí nghiệm 12

3.2 Phương pháp nghiên cứu 12

3.2.1 Phương pháp trích ly papain từ nhựa đu đủ 12

3.2.2 Phương pháp tinh chế papain bằng cồn 13

3.2.3 Phương pháp chuẩn bị casein 1% 14

3.3 Bố trí thí nghiệm 15

3.3.1 Thí nghiệm trích ly papain và tinh chế papain 15

3.3.2 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt tính của papain 15

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

DANH SÁCH HÌNH

Hình Tựa hình Trang

1 Cây đu đủ thu lấy nhựa 2

2 Cấu trúc không gian của papain 4

3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của papain 7

4 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme 7

5 Quy trình trích ly và tinh chế papain bán tinh khiết 14

6 Quy trình chuẩn bị dung dịch casein 14

7 Chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết 18

8 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 21

9 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết trong các điều kiện pH khác nhau 23

10 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết ở điều kiện pH 5,5 và 8,0 24

11 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của nhiệt độ xử lý và pH lên hoạt tính của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết trong nhựa đu đủ 26

12 Quy trình thí nghiệm xác định hoạt tính của papain vi

13 Đường chuẩn Tyrosine vii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng Tựa bảng Trang

1 Thành phần dinh dưỡng của đu đủ có trong 304 g nguyên liệu 3

2 Thành phần acid amin trong papain 4

3 Thành phần các acid amin có trong casein 10

4 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo nhiệt độ 20

5 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo nhiệt độ ứng với từng pH 20

6 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo pH 22

7 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo pH ứng với từng nhiệt độ 22

8 Hoạt tính enzyme (Tu/mg) ở các mẫu xử lý nhiệt độ và pH khác nhau 25

9 Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý và pH môi trường lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain viii

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Giới thiệu chung

Với vô số công trình nghiên cứu, phát minh, thành tựu trong lĩnh vực khoa học ứng dụng, công nghệ sinh học ngày càng khẳng định vai trò khoa học mũi nhọn của mình từ những năm đầu thế kỷ XX đến nay Và công nghệ enzyme - một nhánh không phải là nhỏ bé và đơn giản của cây đại thụ công nghệ sinh học - cũng vì thế mà phát triển rực rỡ Enzyme được biết đến như một chất xúc tác sinh học nổi trội bởi khả năng thúc đẩy vận tốc phản ứng của chúng

Là một trong ba loại enzyme protease thu nhận từ nguồn gốc thực vật (enzyme tinh chế từ thực vật chỉ chiếm khoảng 4% tổng số enzyme thu nhận từ vi sinh vật, động vật và thực vật) - papain được nhiều người biết đến bởi khả năng thủy phân cơ chất protein mạnh mẽ và sâu sắc từ những bài thuốc sử dụng trong dân gian đến những công trình nghiên cứu đồ sộ với các chế phẩm tinh khiết hay bán tinh khiết trích ly từ nhựa trái đu đủ xanh Vì thế, việc papain được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm và cả lĩnh vực phi thực phẩm như y học, công nghiệp thuộc da, công nghệ xử lý chất thải,…cũng không phải là một điều khó hiểu

Đu đủ là loại cây ăn quả có nhiều giá trị dinh dưỡng và tác dụng trị liệu Đối với nước ta, đu đủ không phải là nguồn nguyên liệu khan hiếm nhưng lại chưa được tận dụng tốt để thu hiệu quả kinh tế cao, phần lớn là sử dụng dạng tươi sống Vì vậy, tại sao chúng ta lại không dựa vào thế mạnh ấy mà phát triển chế phẩm enzyme papain có giá trị thương mại cao?

Tuy nhiên, giống như một số enzyme khác, hoạt tính xúc tác của papain cũng chịu ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố cả môi trường ngoài và nội tại, trong đó nhiệt độ và pH là hai nhân tố được quan tâm nhiều nhất trong quá trình tinh chế cũng như sử dụng papain trong các lĩnh vực khác nhau Khảo sát các ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của papain là việc làm cần thiết, tạo cơ sở cho việc ứng dụng papain một cách hợp lý và hiệu quả nhất

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Trích ly và tinh chế papain bán tinh khiết từ nhựa đu đủ xanh cũng như khảo sát những tác động, ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của papain đối với cơ chất casein Từ đó, hiểu được quy luật biến thiên về hoạt tính của papain theo sự thay đổi của pH và nhiệt độ, nhằm ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm và phi thực phẩm khác

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây đu đủ

Họ đu đủ (danh pháp khoa học: Caricaceae, đồng nghĩa: Papayaceae) là một họ thực vật có hoa thuộc bộ Cải (Brassicales), có nguồn gốc từ khu vực nhiệt

đới Trung, Nam Mỹ và châu Phi, là một trong những

loài Caricaceae được trồng phổ biến ở vùng nhiệt

đới, bán nhiệt đới Chúng là các loài cây bụi hay cây gỗ nhỏ thân xốp và mập, thường xanh, tuổi thọ thấp, cao tới 5-10m và không có cành, nhiều loài có quả ăn được Cụm hoa mọc ở nách lá, kiểu xim hoa Lá hình chân vịt hay xẻ thùy, mọc so le Lá và quả xanh chứa nhựa mủ màu trắng Quả mọng, lớn Hạt có nội nhũ nhiều dầu Gần đây đu đủ được trồng nhiều chủ yếu để lấy nhựa nhằm tinh chế enzyme papain có giá trị thương mại cao hơn đu đủ tiêu thụ dạng tươi Đu đủ được xem là thực phẩm rất giàu vitamin C, A, E, K, các hợp chất folate và muối

Ở Việt Nam, đu đủ được biết đến rất lâu bởi các tác dụng của nó trong việc chữa

trị những bệnh thông thường như về đường tiêu hóa, chăm sóc sắc đẹp, đau lưng, viêm dạ dày mãn tính, ho do phế hư, tỳ vị hư nhược, chữa gai cột sống,… rất tốt

Ngoài ra, đu đủ là thực phẩm chứa nhiều carotenoids, chất này có khả năng chống oxy hóa mạnh, rất hữu ích trong việc phòng chống các bệnh tim mạch và ung thư, tăng sức đề kháng cho cơ thể nói chung và bảo vệ da khỏi tác hại của ánh nắng, giúp da tươi nhuận

Trong y học cổ truyền Nam Mỹ, đu đủ được đánh giá có hiệu lực trị bệnh tiểu đường, hen suyễn và chống ký sinh trùng đường ruột và điều trị hiệu quả bệnh ho lao nếu dùng đều đặn trong thời gian dài

(Nguồn: http://www.vnexpress.net/Vietnam/Suc-khoe/2005/03/3B9DBF70/ - 25k)

Đu đủ là cây trồng quen thuộc và được trồng khắp nơi ở Việt Nam nhưng do chủ yếu được tiêu thụ dạng tuơi sống như thực phẩm hằng ngày nên giá trị kinh tế rất thấp, trái cây thu hoạch lúc chín nên thời gian sử dụng và bảo quản không cao Tuy nhiên, gần đây một số vùng thuộc miền Trung như Đắc Lắc được sự hỗ trợ của chương trình hợp tác với vương quốc Bỉ, trồng đu đủ để thu enzyme papain nên có bước phát triển khá cao, tạo thu nhập cho người dân và nguồn papain dồi dào cho sinh học ứng dụng

Hình 1: Cây đu đủ thu lấy nhựa

Thành phần dinh dưỡng của đu đủ được thể hiện trong bảng 1

Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của đu đủ có trong 304 g nguyên liệu

(Nguồn: http://www.jtcwd.com/veggie/nutrition/papaya.html)

2.2 Giới thiệu về papain trong đu đủ

2.2.1 Cấu tạo và hoạt tính i Cấu tạo

Nhựa đu đủ xanh là một hỗn hợp gồm nhiều protease như: papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease, trong đó papain là protease có hàm lượng cao nhất, khoảng 95% tổng hàm lượng protease có trong nhựa và có ý nghĩa quan trọng nhất

Có thể nói, tùy theo từng phương pháp phân tích mà số lượng acid amin có được trong phân tử papain có thể khác nhau Nếu theo nghiên cứu của Hill và Smith, papain được cấu tạo từ 185 acid amin thì khiphân tích bằng tia X hiện đại hơn, papain lại chứa đến 212 acid amin, được ổn định bởi 3 cầu nối disufua hình thành từ 6 gốc cystein ở vị trí 22-63, 56-95, 153-200, ba cầu nối này không có chức năng sinh học mà chỉ tăng tính chất bền vững của cấu trúc phân tử và một nhóm -SH tự do ở vị trí 25, trọng lượng phân tử khoảng 23406 Da Nó có bộ ba xúc tác tạo thành bởi ba acid amin: cystein-25, histidine-159, asparagine-158

Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng Đơn vị Nước

Năng lượng Cacbohydrat Xơ

Tro Calcium Magie Postassium Sodium Vitamin C Folate Vitamin A Vitamin E Vitamin K

270,043 118,56 29,822 5,472 1,854 72,960 30,4 781,28 9,12 187,872 115,52 863,36 3,405 7,0

g kcal g g g mg mg mg mg mg mcg IU mg mg

Theo tác giả Nguyễn Đức Lượng, thành phần acid amin trong papain đu đủ như sau:

Bảng 2: Thành phần acid amin trong papain

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Cấu trúc không gian của phân tử papain có dạng cầu với kích thước: 26 x 48 x 36 A0, mạch chính bị gấp lại thành hai phần riêng biệt bởi một khe Trung tâm hoạt động chính nằm trên khe này, nhóm sulfhydryl hoạt động của cystein 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe

Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm -SH của cystein 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159 Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các acid amin là:

Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Hình 2: Cấu trúc không gian của papain

ii Hoạt tính

Khoảng pH thích hợp để papain hoạt động là 6,0 - 8,0 Nhiệt độ thích hợp để hoạt động tùy vào từng cơ chất khác nhau và có thể duy trì hoạt tính đến 600C Một điều cần lưu ý là khoảng pH và nhiệt độ tối thích của papain sẽ không cố định mà thay đổi tùy vào nguồn thu nhận, cơ chất phản ứng, cách thức trích ly và tinh chếpapain; ứngvới mỗi nguồn nguyên liệu và phương pháp tinh chế mà ta sẽ thu được các chế phẩm enzyme có khoảng pH, nhiệt độ hoạt động thích hợp khác nhau Papain thủy phân protein, đóng vai trò vừa là một endopeptidase vừa là một exopeptidase Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành peptide

R R R R (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n +(HOH) (-NH-CH-COOH-)i +(H2N-CH-CO-)kTrong đó: i + k = n

Các exopeptidase thủy phân peptide chủ yếu thành acid amin

R R R R (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n +(HOH) n’H2N-CH-COOH+(H2N-CH-CO-)k’Trong đó: n’ + k’ = n

So với các protease có nguồn gốc từ động vật hoặc vi sinh vật khác, papain có khả năng thuỷ phân sâu hơn, vì vậy nó được dùng để thủy phân tiếp các liên kết peptide còn lại sau khi đã thủy phân bằng trypsin hay chymotrypsin Khả năng thủy phân cơ chất của papain còn phụ thuộc vào trạng thái của cơ chất, tức là có biến tính hay không Nếu cơ chất bị biến tính thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.2 Cơ chế hoạt hóa và kìm hãm

Papain cần nhóm sulfhydryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc Do trung tâm hoạt động của papain bao gồm các nhóm cystein 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hoá cho papain là các chất có tính khử như: cystein, glutation acid, hydrocyanic, hydrogenuasulfite, sodiumthiosulfat, trong đó cystein là chất hay được dùng để hoạt hoá nhất Khi có mặt các chất này thì nhóm -SH ở trung tâm hoạt động của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain Sự hoạt hoá càng được tăng cường khi có sự hiện diện của các chất có khả năng liên kết với các kim loại như EDTA

Để thu được enzyme có hoạt tính cao nhất, thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cystein và EDTA, trong đó cystein đóng vai trò chất hoạt hoá và EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ

Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hoá như: O2, ozon, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide, thủy ngân chlobezoate, cystine và các hoạt chất disulfua khác Các chất này ức chế hoạt tính của enzyme bằng cách phản ứng với nhóm -SH ở trung tâm hoạt động của papain và do vậy mà phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó

Nhiều chất ức chế papain chứa phenylalanine ở vị trí nhóm thế thứ 2 kể từ đầu mạch C là chất ức chế cạnh tranh của papain do chiếm một phần trung tâm hoạt động Điều đáng chú ý là papain rất bền đối với tác nhân biến tính như dung môi hữu cơ

Các chế phẩm enzyme sau khi bảo quản vài tháng có thể có độ hoạt động vào khoảng 30% Ngay cả khi được hoạt hoá, lượng sulfhydryl tự do vẫn nhỏ hơn 1 mol SH/1mol papain và thường không quá 0,5 mol/mol Nguyên nhân là do nhóm sulfhydryl đã bị khóa chặt bất thuận nghịch một phần và bản chất hoá học của hiện tượng này hiện nay vẫn chưa được giải thích một cách cụ thể

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng

Mang bản chất là một protein nên phản ứng xúc tác của papain cũng chịu ảnh hưởng của các nhân tố bên ngoài môi trường như nhiệt độ, pH, các ion kim loại nặng,… và yếu tố nội tại gồm nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, mức độ tinh khiết của papain được trích ly

i Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ

Tuy có bản chất là protein nhưng papain lại có thể chịu nhiệt độ tương đối cao Dạng chế phẩm enzyme khô khi được bảo quản trong điều kiện lạnh đông có thể không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC Còn ở dạng dung dịch, papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC và nếu tăng nhiệt độ cao hơn 100oC thì nó sẽ mất hoạt tính hoàn toàn ngay cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hoá vào dung dịch Điều này được giải thích là do khi ở dạng dung dịch ta tăng lên đến nhiệt độ trên 100oC thì cấu trúc tâm hoạt động của enzyme bị phá hủy hoàn toàn Do đó, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của chúng Một điều đặc biệt đáng chú ý là khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền thấp hơn cả papain trong nhựa nhựa, bởi lẽ trong nhựa nhựa còn có chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó Papain tự nó mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự tự phân hoặc oxy hoá Khi thủy phân các protein khác nhau thì tuỳ thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ phản ứng

thích hợp cho papain cũng khác nhau Sự phụ thuộc giữa nhiệt độ và vận tốc phản ứng được biểu thị ở hình 3

Hình 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của papain

ii Ảnh hưởng của nhân tố pH

Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,2-8,2 và pH tối thích 8,0 nhưng lại dễ bị biến tính trong môi trường acid có pH < 4,5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH >12 Khi phản ứng với cơ chất thì tuỳ thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ rất khác nhau Điểm đẳng điện của papain là pI = 9 Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được ổn định, có thể chịu được các pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút Người ta nhận thấy rằng, sự thay đổi pH có ảnh hưởng lớn đến trạng thái ion hóa của cả enzyme và cơ chất nên sẽ tác động đến quá trình hình thành phức hợp enzyme - cơ chất [ES], từ đó làm thay đổi vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác

Hình 4: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme

(Nguồn:http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Peptidase10.htm)

iii Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và kìm hãm

Papain chỉ thể hiện được hoạt tính xúc tác khi có nhóm –SH tự do, mà ở trạng thái thông thường, các phân tử papain lại liên kết với nhau bằng cầu nối S-S nên sẽ không thể hiện được nhóm –SH tự do, vì thế chất hoạt hóa sẽ có vai trò phá vỡ cầu nối S-S đó để tạo thành nhóm –SH tự do Hoạt tính xúc tác của papain được thể hiện khi có sự tham gia của các hợp chất mang tính khử như: cystein, glutation acid, hydrocyanic, hydrogenuasulfite, sodiumthiosulfat,

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hoá học, cấu tạo hoá học và tính chất vật lý của chúng Người ta phân chia thành chất kìm hãm cạnh tranh và chất kìm hãm không cạnh tranh

Chất kìm hãm cạnh tranh thường là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất Do đó, chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme làm cho chổ kết hợp cần thiết của enzyme với cơ chất bị chiếm mất, cơ chất mất một phần khả năng tương tác làm cho tốc độ phản ứng không tăng được Chất kìm hãm bất thuận nghịch đối với papain là các chất có khả năng phản ứng nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain, phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó, làm cho nó không thể gắn vào cơ chất được Các chất này thường là các chất oxi hóa mạnh như: O2, O3, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide, thủy ngân chlobezoate, cystine và các hoạt chất disulfua khác Thông thường, trong các thí nghiệm xác định hoạt tính của papain, chất được sử dụng để ngừng phản ứng thủy phân xảy ra tiếp tục là TCA (Trichloroacetic acid - CCl3COOH) vì nó có khả năng ức chế rất nhanh phản ứng

Chất kìm hãm không cạnh tranh sẽ kết hợp với enzyme ở một vị trí không phải là trung tâm hoạt động của enzyme Kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme, tạo thành một phức hợp Khi đó phức hợp này sẽ làm thay đổi theo hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme nhưng sau khi kết hợp với chất kìm hãm, chúng vẫn có khả năng tạo thành phức hợp khác với cơ chất

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.3 Giới thiệu về phản ứng thủy phân của papain

Cũng giống như tính chất chung của các loại enzyme khác, phản ứng thủy phân của papain cũng theo ba giai đoạn sau:

Giai đoạn đầu: enzyme papain sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng v phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất

Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất

Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do Hiện tượng này được xem xét trên cơ sơ phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất Nếu nồng độ cơ chất vượt quá ngưỡng cực đại của tốc độ phản ứng thì tốc độ phản ứng không có khả năng tăng theo Ở giai đoạn này các enzyme đã bão hòa cơ chất do đó nó không thể có tốc độ phản ứng cao hơn được Sự phụ thuộc giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất được biểu diễn ở hình 5

Các nghiên cứu cho rằng, nồng độ của nước không đổi trong suốt quá trình phản ứng do đó vận tốc phản ứng chỉ phụ thuộc vào nồng độ của cơ chất nên được xem là phản ứng đơn phân và bậc nhất

Theo Mischealis – Menten, cơ chế xúc tác tổng quát của phản ứng enzyme được trình bày theo phương trình bậc nhất sau:

E + S ES E + P

Trong đó: K1, K-1, K2, K-2 là những hằng số vận tốc phản ứng tương ứng

2.4 Giới thiệu về cơ chất casein

Casein là một phosphoprotein, chiếm khoảng 78 - 85% protein của sữa, mang tính acid vì có chứa gốc acid phosphoric H3PO4 trong thành phần Ngoài ra, casein còn có nhiều nhóm chức tự do khác như –NH2, =NH, –OH, –NH – CO, –HS,…chính nhờ các nhóm chức này mà casein có khả năng tham gia phản ứng hóa học, trong đó nhóm –COOH và acid amin –NH2 có ý nghĩa quan trọng nhất vì một phần các nhóm này ở trạng thái tự do và quyết định tính chất của casein, giúp casein tồn tại trạng thái lưỡng tính, tham gia phản ứng vừa như một bazơ, đồng thời như một acid Các casein đều có điểm đẳng điện ở pH = 4,6 và dễ dàng tham gia phản ứng với kim loại (K, Na, Mg,…) để tạo thành muối caseinate, các muối thì bền nhiệt và tan trong nước tốt hơn casein

Casein trong sữa gồm có 4 dạng: casein αs chiếm tỉ lệ cao nhất (chia làm 2 loại αs1 và αs2), casein β và casein K, trong đó casein K là protein duy nhất chứa glucid như galactose, N-acetylglucosamin và acid sialic

Casein αs: chiếm khoảng 45-55% tổng casein, lại phân chia thành 2 loại chính là αs1 và αs2

K2

K1

K-1

 Casein αs1: gồm 199 acid amin, có phân tử lượng 26642 Da, hàm lượng khoảng 12-15g/l sữa đã tách bơ Loại casein này có tính lưỡng cực, một đầu ưa béo, một đầu ưa nước do sự phân bố điện tích không đều.

 Casein αs2: gồm 207 acid amin, phân tử lượng 25230 Da, hàm lượng khoảng 3-4g/l sữa đã tách béo Đây là loại casein có tính ưa nước cao nhất trong các loại casein do phân tử có chứa nhiều nhóm phosphoryl và gốc cation nhất
Casein β: chiếm khoảng 25-35% tổng casein, gồm 209 acid amin, có phân tử lượng 23983 Da, hàm lượng khoảng 9-11g/l sữa đã tách bơ Đây là loại casein có tính ưa béo cao nhất

Casein K: chiếm khoảng 8-15% tổng casein, gồm 169 acid amin, có phân tử lượng 19007 Da Có thể nói, casein K là loại casein có tính chất khác biệt so với các loại casein khác như khi thêm CaCl2 vào mixen thì chỉ còn casein K là ở trạng thái hòa tan, không kết tủa mà lại chứa glucid nên có tính háo nước Đặc biệt, casein K có khả năng ổn định các casein khác bằng cách ngăn cản sự kết tủa của các loại casein này bởi ion Ca2+, nhờ tạo ra trong sữa một phức hệ mixen dưới dạng keo bền vững (Lâm Xuân Thanh, 2003)

Bảng 3 thể hiện thành phần casein, bao gồm 17 loại acid amin khác nhau với tỉ lệ tương đối như sau

Bảng 3: Thành phần các acid amin có trong casein

Acid amin Tỉ lệ (%) Glutamic acid

Proline Leucine Lysine Valine Aspartic acid Serine Tyrosine Isoleucine Phenylalanine Threonine Arginine Alanine Methionine Glycine Tryptophan

20,2 10,2 8,3 7,4 6,5 6,4 5,7 5,7 5,5 4,5 4,4 3,7 2,8 2,7 2,5 2,4 (Nguồn: http://www.casein.com/prodúct.htm)

2.5 Phương pháp xác định hoạt tính papain (phương pháp Kunitz)

Hoạt tính của enzyme được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau nhưng có thể tổng kết thành ba nhóm chính:

Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành sau một thời gian nhất định và lượng enzyme đã xác định trước Phương pháp này được áp dụng rộng rãi và đã được xác định là tương đối chính xác

Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhất định của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định

Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm

Trong phần nghiên cứu này, hoạt lực xúc tác của papain được xác định dựa vào phương pháp Kunitz (theo nhóm đo lượng sản phẩm tạo thành) trên cơ sở khả năng hấp thụ ánh sáng của Tyrosine sinh ra trong quá trình thủy phân bởi papain, sử dụng cơ chất casein

Đầu tiên, một đường chuẩn được xác lập dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng của Tyrosine có dãy nồng độ khác nhau ở bước sóng ánh sáng 280 nm

Thí nghiệm được tiến hành trên một hỗn hợp được chuẩn bị gồm papain cần xác định hoạt tính; dung dịch đệm phosphate (hòa tan papain và casein); EDTA (giúp gây kết tủa kim loại trong chế phẩm papain), cơ chất casein 1% trong dung dịch đệm phosphate

Sau 20 phút thủy phân, phản ứng sẽ được dừng lại bởi TCA 5% Hỗn hợp dung dịch được lọc và đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm

Dựa vào phương trình đồ thị của dãy Tyrosine chuẩn, từ độ hấp thụ ánh sáng của sản phẩm thủy phân (Tyrosine), ta xác định được nồng độ Tyrosine tương ứng trong từng thí nghiệm ở những nồng độ enzyme khác nhau Khi đó ta tính được lượng sản phẩm sinh ra tương ứng với lượng tyrosine tạo thành trong dung dịch Đơn vị đo hoạt tính của papain trong thí nghiệm này được thể hiện bằng đơn vị Tu (Tyrosine unit)

Hoạt tính đặc hiệu của papain là số đơn vị hoạt tính enzyme có trong 1 mg protein (Tu/mg)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm, thời gian thực hiện

Địa điểm: phòng thí nghiệm của bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

Thời gian: từ 7/1/2007 đến 17/4/2007

3.1.2 Nguyên liệu

Nhựa đu đủ thu từ trái xanh khoảng 10 tuần tuổi

3.1.3 Hóa chất thí nghiệm

• Casein – sodium caseinate, từ sữa bò

• L – Cystein hydroclorid – monohydrate

• Trichloroacetic acid (TCA)

• Ethylene diamine tetraacetic disodium salt (EDTA)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp trích ly papain từ nhựa đu đủ

Tiến hành lấy nhựa theo trình tự:

• Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh còn trên cây, khoảng 10 tuần tuổi

• Dùng dao inox có đầu nhọn rạch vài đường dọc theo quả ở chổ đường kính to nhất, các khía cách nhau 1 - 2cm (không rạch sâu quá 2mm, nếu không

dịch nước và tinh bột từ quả sẽ trộn lẫn vào nhựa và làm giảm chất lượng dịch nhựa thu được)

• Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thuỷ tinh màu miệng rộng trong 4 - 6 phút, sau khi lấy nhựa đậy nắp kín, giữ trong bóng tối

• Bảo quản lạnh, mang về phòng thí nghiệm Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho nhựa tiếp xúc với không khí và để đảm bảo hoạt tính của papain có trong nhựa

• Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc có côn trùng lẫn vào

• Không nên trộn nhựa tươi với nhựa khô vì như vậy sẽ làm giảm chất lượng papain thu được

• Quả có thể rút nhựa trong suốt khoảng thời gian 4 - 7 ngày Lần đầu tiên có thể chỉ rạch một lần là đủ, ở những lần thu nhựa sau, rạch 2 - 3 đường giữa những đường rạch trước

• Khi tiến hành thao tác với nhựa tươi, tránh không cho nhựa tiếp xúc với da vì nó sẽ gây bỏng Đồng thời cũng không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng, vì nó làm biến màu và làm giảm hoạt tính của enzyme, lọ, dao, muỗng, phải được làm bằng nhựa hoặc thép không gỉ.

• Nhựa tươi thu được sẽ không bền, vì thế phải sấy khô tới khoảng 5% độ ẩm

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

3.2.2 Phương pháp tinh chế papain bằng cồn

Nhựa đu đủ sau khi thu được mang về phòng thí nghiệm để tiến hành quá trình tinh chế Quá trình tinh chế papain bán tinh khiết sử dụng dung môi hữu cơ (cồn 90o làm lạnh) được thực hiện theo sơ đồ sau:

Hình 5: Quy trình trích ly và tinh chế papain bán tinh khiết

3.2.3 Phương pháp chuẩn bị casein 1%

Cơ chất casein sử dụng trong tiến trình thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme được chuẩn bị theo các bước trong hình 6 dưới đây:

Hình 6: Quy trình chuẩn bị dung dịch casein 1%

Nhựa đu đủ

Rửa cồn 900 2-3 lần

Lọc hay ly tâm lạnh (3 – 50C)

Hòa tan với nước cất

Papain bán tinh khiết Sấy chân không

(30 – 400C) Tủa lại bằng cồn 900

Dung dich đệm phosphate pH = 7,5

Bảo quản lạnh (40C) Đun cách thủy (85 – 900C, 1h)

Casein

3.3 Bố trí thí nghiệm

3.3.1 Thí nghiệm trích ly papain và tinh chế papain

Mục đích thí nghiệm: Thu được chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết có độ ẩm thấp

Tiến hành thí nghiệm

Quá trình trích ly và tinh chế papain bán tinh khiết được tiến hành như miêu tả trên phần phương pháp trích ly Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện lạnh 3-50C cho các bước ly tâm (4000 vòng/phút), chiết rửa bằng cồn Hoạt tính của papain bị ảnh hưởng rất lớn ở giai đoạn này và ảnh hưởng đến thí nghiệm xác định hoạt tính xúc tác sau

Tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện song song cho một mẫu phân tích và một mẫu đối chứng (papain được vô hoạt), ứng với một mức pH hay nhiệt độ, sẽ có sự kết hợp với tất cả các mức độ nhiệt độ hay pH còn lại

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí với hai nhân tố là nhiệt độ và pH môi trường Nhân tố A: nhiệt độ môi trường, được khảo sát ở 7 mức độ, từ 300C - 600C A1: 300C A4: 450C A7: 600C A2: 350C A5: 500C

A3: 400C A6: 550C

Nhân tố B: pH môi trường, khảo sát ở 6 mức độ, khoảng 5,5 – 8,0 B1: pH = 5,5 B4: pH = 7,0

B2: pH = 6,0 B5: pH = 7,5 B3: pH = 6,5 B6: pH = 8,0

Ứng với mỗi nghiệm thức, thí nghiệm được lặp lại ba lần Vậy tổng số mẫu ta phải chuẩn bị: 7 x 6 x 3 = 126 mẫu

Ứng với mỗi mẫu thí nghiệm có một mẫu đối chứng (enzyme bị vô hoạt) Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau:

A1 A1 B1 A1 B2 A1 B3 A1 B4 A1 B5 A1 B6A2 A2 B1 A2 B2 A2 B3 A2 B4 A2 B5 A2 B6A3 A3 B1 A3 B2 A3 B3 A3 B4 A3 B5 A3 B6A4 A4 B1 A4 B2 A4 B3 A4 B4 A4 B5 A4 B6A5 A5 B1 A5 B2 A5 B3 A5 B4 A5 B5 A5 B6A6 A6 B1 A6 B2 A6 B3 A6 B4 A6 B5 A6 B6A7 A7 B1 A7 B2 A7 B3 A7 B4 A7 B5 A7 B6

Kết quả thí nghiệm

Xác định được sự tương tác của nhiệt độ xủ lý và pH môi trường đến hoạt tính xúc tác của enzyme papain trong nhựa đu đủ tươi, từ đó xác định được nhiệt độ và pH thích hợp để papain thể hiện hoạt tính cao nhất

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Trích ly và tinh chế papain

Quá trình thu nhận nhựa đu đủ tươi được tiến hành vào lúc sáng sớm và phải kết thúc vào giữa buổi sáng vì khi đó độ ẩm không khí khá cao, khi độ ẩm không khí thấp dòng nhựa dễ bị sánh lại, chảy chậm rất khó thu nhận Nhựa thu được bằng cách rạch những đường dài dọc theo thân trái, khoảng cách giữa các đường 1-2 cm, sau đó hứng phần nhựa vào trong các lọ thủy tinh màu nhằm ngăn sáng rồi đậy nắp kínvà bảo quản lạnh trong suốt quá trình mang về phòng thí nghiệm bằng nước đá Thời gian thu nhựa và mang về phòng thí nghiệm nên hạn chế không dài quá để tránh ảnh hưởng đến chất lượng enzyme

Nguồn nhựa mang về phòng thí nghiệm được tủa bằng cồn 900 đã làm lạnh (nhằm hạn chế sự biến tính enzyme), giữ yên dung dịch để quá trình tủa xảy ra tốt hơn trong điều kiện lạnh khoảng 3-50C trong 1giờ Sau đó tiến hành ly tâm nhiều lần bằng cồn lạnh ở 40C, tốc độ ly tâm khoảng 4000 vòng/phút Ở lần ly tâm cuối, trước khi cho enzyme tủa với cồn thì tiến hành hòa tan với nước cất nhằm làm tan các thành phần không phải enzyme, sau đó mới tạo kết tủa lại bằng cồn

Phần kết tủa thu được sau khi ly tâm được sấy chân không ở nhiệt độ thấp khoảng 30-400C đến khi khô có thể nghiền thành dạng bột mịn (độ ẩm khoảng 5% là an toàn) Dạng bột mịn chính là chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết

Chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết này được bảo quản trong điều kiện lạnh đông khoảng -200C để sử dụng kiểm tra hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân casein

Hình 7: Chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết

4.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết

Chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết được xác định hoạt tính ở các pH và nhiệt độ khác nhau theo phương pháp Kunitz trên cơ chất casein Ở đây, giá trị đo được trên máy quang phổ (độ hấp thụ OD) chính là nồng độ Tyrosine sinh ra (µmol) do quá trình thủy phân cơ chất casein bởi 1mg chế phẩm enzyme Từ giá trị độ hấp thụ này, ta xác định hoạt tính của chế phẩm enzyme papain trong nhựa đu đủ theo đơn vị Tu/mg chế phẩm enzyme bán tinh khiết khô

Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme trên cơ chất casein được khảo sát theo hai nhân tố nhiệt độ (A) và pH (B) với 7 mức nhiệt độ từ 300C đến 600C, 6 mức pH từ 5,5 đến 8,0

A1: 300C A4: 450C A7: 600C A2: 350C A5: 500C

A3: 400C A6: 550C B1: pH = 5,5 B4: pH = 7,0 B2: pH = 6,0 B5: pH = 7,5

B3: pH = 6,5 B6: pH = 8,0

Ứng với mỗi mẫu thí nghiệm có một mẫu đối chứng (enzyme bị vô hoạt)

4.2.1 Sự thay đổi hoạt tính xúc tác của enzyme papain bán tinh khiết theo nhiệt độ

Có thể thấy rằng, nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính enzyme do có tác động trực tiếp đến cấu trúc không gian và hình thể tâm hoạt động của enzyme Theo động học phản ứng enzyme, khi nhiệt độ tăng sẽ thúc đẩy vận tốc phản ứng Vận tốc phản ứng đạt cực đại tương ứng với nhiệt độ tối thích cho enzyme hoạt động, nếu vượt quá ngưỡng nhiệt độ này tốc độ phản ứng bắt đầu giảm lại Điều này được thể hiện tổng quát ở bảng 4, hoạt tính enzyme thay đổi theo các nhiệt độ khác nhau khi tương tác với các pH khảo sát

Bảng 4: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme theo nhiệt độ

(Kết quả thể hiện là hoạt tính xúc tác của enzyme theo đơn vị Tu/mg chế phẩm trên cơ chất casein

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95%)

Nhìn chung hoạt tính xúc tác của enzyme ở 550C là cao nhất và có khác biệt ý nghĩa 5% so với các nhiệt độ còn lại Nhiệt độ cao ngoài khả năng tăng tốc độ phản ứng còn có thể làm biến tính một phần cơ chất, từ đó enzyme dễ dàng xúc tác hơn (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Khi xem xét cụ thể, tương ứng với một pH nhất định, sự thay đổi hoạt tính enzyme theo nhiệt độ được thể hiện ở bảng 5 và đồ thị hình 8 dưới đây

Bảng 5: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme theo nhiệt độ ứng với từng pH

(Kết quả thể hiện là hoạt tính xúc tác của enzyme theo đơn vị Tu/mg chế phẩm trên cơ chất casein Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95% )

Nhiệt độ (oC) Hoạt tính (Tu/mg)

30 35 40 45 50 55 60

998,4a1576b1692b1934c2263d2564e2333d