Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính xúc tác của enzyme papain trong đu đủ

Cơ chế hoạt hóa và kìm hãm

Do trung tâm hoạt động của papain bao gồm các nhóm cystein 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hoá cho papain là các chất có tính khử như: cystein, glutation acid, hydrocyanic, hydrogenuasulfite, sodiumthiosulfat,. Khi có mặt các chất này thì nhóm -SH ở trung tâm hoạt động của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được enzyme có hoạt tính cao nhất, thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cystein và EDTA, trong đó cystein đóng vai trò chất hoạt hoá và EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.

Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hoá như: O2, ozon, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide, thủy ngân chlobezoate, cystine và các hoạt chất disulfua khác. Các chất này ức chế hoạt tính của enzyme bằng cách phản ứng với nhóm -SH ở trung tâm hoạt động của papain và do vậy mà phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó. Nhiều chất ức chế papain chứa phenylalanine ở vị trí nhóm thế thứ 2 kể từ đầu mạch C là chất ức chế cạnh tranh của papain do chiếm một phần trung tâm hoạt động.

Ngay cả khi được hoạt hoá, lượng sulfhydryl tự do vẫn nhỏ hơn 1 mol SH/1mol papain và thường không quá 0,5 mol/mol. Nguyên nhân là do nhóm sulfhydryl đã bị khóa chặt bất thuận nghịch một phần và bản chất hoá học của hiện tượng này hiện nay vẫn chưa được giải thích một cách cụ thể.

Các yếu tố ảnh hưởng

Người ta nhận thấy rằng, sự thay đổi pH có ảnh hưởng lớn đến trạng thái ion hóa của cả enzyme và cơ chất nên sẽ tác động đến quá trình hình thành phức hợp enzyme - cơ chất [ES], từ đó làm thay đổi vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác. Papain chỉ thể hiện được hoạt tính xúc tác khi có nhóm –SH tự do, mà ở trạng thái thông thường, các phân tử papain lại liên kết với nhau bằng cầu nối S-S nên sẽ không thể hiện được nhóm –SH tự do, vì thế chất hoạt hóa sẽ có vai trò phá vỡ cầu nối S-S đó để tạo thành nhóm –SH tự do. Hoạt tính xúc tác của papain được thể hiện khi có sự tham gia của các hợp chất mang tính khử như: cystein, glutation acid, hydrocyanic, hydrogenuasulfite, sodiumthiosulfat,.

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hoá học, cấu tạo hoá học và tính chất vật lý của chúng. Do đó, chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme làm cho chổ kết hợp cần thiết của enzyme với cơ chất bị chiếm mất, cơ chất mất một phần khả năng tương tác làm cho tốc độ phản ứng không tăng được. Chất kìm hãm bất thuận nghịch đối với papain là các chất có khả năng phản ứng nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain, phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó, làm cho nó không thể gắn vào cơ chất được.

Thông thường, trong các thí nghiệm xác định hoạt tính của papain, chất được sử dụng để ngừng phản ứng thủy phân xảy ra tiếp tục là TCA (Trichloroacetic acid - CCl3COOH) vì nó có khả năng ức chế rất nhanh phản ứng. Khi đó phức hợp này sẽ làm thay đổi theo hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme nhưng sau khi kết hợp với chất kìm hãm, chúng vẫn có khả năng tạo thành phức hợp khác với cơ chất.

Giới thiệu về phản ứng thủy phân của papain

Chất kìm hãm cạnh tranh thường là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Các chất này thường là các chất oxi hóa mạnh như: O2, O3, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide, thủy ngân chlobezoate, cystine và các hoạt chất disulfua khác. Chất kìm hãm không cạnh tranh sẽ kết hợp với enzyme ở một vị trí không phải là trung tâm hoạt động của enzyme.

Kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme, tạo thành một phức hợp. Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Nếu nồng độ cơ chất vượt quá ngưỡng cực đại của tốc độ phản ứng thì tốc độ phản ứng không có khả năng tăng theo.

Ở giai đoạn này các enzyme đã bão hòa cơ chất do đó nó không thể có tốc độ phản ứng cao hơn được. Các nghiên cứu cho rằng, nồng độ của nước không đổi trong suốt quá trình phản ứng do đó vận tốc phản ứng chỉ phụ thuộc vào nồng độ của cơ chất nên được xem là phản ứng đơn phân và bậc nhất.

Giới thiệu về cơ chất casein

Hiện tượng này được xem xét trên cơ sơ phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất. Sự phụ thuộc giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất được biểu diễn ở hình 5. Loại casein này có tính lưỡng cực, một đầu ưa béo, một đầu ưa nước do sự phân bố điện tích không đều.

Đây là loại casein có tính ưa nước cao nhất trong các loại casein do phân tử có chứa nhiều nhóm phosphoryl và gốc cation nhất. Có thể nói, casein K là loại casein có tính chất khác biệt so với các loại casein khác như khi thêm CaCl2 vào mixen thì chỉ còn casein K là ở trạng thái hòa tan, không kết tủa mà lại chứa glucid nên có tính háo nước. Đặc biệt, casein K có khả năng ổn định các casein khác bằng cách ngăn cản sự kết tủa của các loại casein này bởi ion Ca2+, nhờ tạo ra trong sữa một phức hệ mixen dưới dạng keo bền vững.

Leucine Lysine Valine Aspartic acid Serine Tyrosine Isoleucine Phenylalanine Threonine Arginine Alanine Methionine Glycine Tryptophan.

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

• Phương pháp nghiên cứu

• Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thuỷ tinh màu miệng rộng trong 4 - 6 phút, sau khi lấy nhựa đậy nắp kín, giữ trong bóng tối. Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho nhựa tiếp xúc với không khí và để đảm bảo hoạt tính của papain có trong nhựa. • Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc có côn trùng lẫn vào.

• Không nên trộn nhựa tươi với nhựa khô vì như vậy sẽ làm giảm chất lượng papain thu được. Lần đầu tiên có thể chỉ rạch một lần là đủ, ở những lần thu nhựa sau, rạch 2 - 3 đường giữa những đường rạch trước. • Khi tiến hành thao tác với nhựa tươi, tránh không cho nhựa tiếp xúc với da vì nó sẽ gây bỏng.

Đồng thời cũng không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng,. • Nhựa tươi thu được sẽ không bền, vì thế phải sấy khô tới khoảng 5% độ ẩm. Nhựa đu đủ sau khi thu được mang về phòng thí nghiệm để tiến hành quá trình tinh chế.

Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị hóa chất

Tiến hành thí nghiệm song song hai mẫu trong đó có một mẫu đối chứng. Các bước thực hiện theo sơ đồ hình 12, mẫu đối chứng tiến hành tương tự nhưng cho dung dịch TCA vào trước (nhằm vô hoạt enzyme), casein vào sau.