Nghiên cứu phương pháp chuẩn đoán nấm bệnh aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin bằng môi trường thạch nước dừa

i TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA NÔNG LÂM NGƢ - - Phan Thị Phƣơng NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NẤM BỆNH Aspergillus flavus SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN BẰNG MÔI TRƢỜNG THẠCH NƢỚC CỐT DỪA (COCONUT AGAR MEDIUM) ii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ SƢ NGÀNH NÔNG HỌC VINH – 07.2011 iii Lời cam đoan! Quá trình thực tập tốt nghiệp khoảng thời gian để người sinh viên có điều kiện rèn luyện tính tự lực, độc lập suy nghĩ, bổ sung kiến thức mẻ từ thực tiễn, nâng cao trình độ lý luận chuyên môn Tiếp tục rèn luyện đạo đức tác phong, quan điểm phục vụ người cán khoa hoc kỹ thuật Để hoàn thành luân văn tơi xin cam đoan: Trong q trình nghiên cứu thân ln nhiệt tình với cơng việc Số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực Kết nghiên cứu thân có nhờ giúp đỡ tận tình, chu đáo thầy giáo hướng dẫn PGS TS Trần Ngọc Lân cô giáo hướng dẫn KS Hồ Thị Nhung thầy giáo phịng thí nghiệm Mọi giúp đỡ cho việc thực khóa luận cảm ơn thơng tin trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc Nghi lộc, tháng năm 2010 Tác giả luận văn Phan Thị Phƣơng iv Lời cảm ơn Trong suốt thời gian thực đề tài khóa luận tốt nghiệp tơi ln nhận giúp đỡ tận tình quý thầy cô giáo khoa Nông Lâm Ngư Trường Đại học Vinh, nhà khoa học, người dân nơi thu mẫu bạn bè thân hữu gần xa Hồn thành luận văn cho phép tơi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Ngọc Lân nhiệt tình hướng dẫn tơi suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn KS Hồ Thị Nhung nhiệt tình truyền đạt kỹ năng, kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho tơi Đặc biệt ln động viên khuyến khích mang đến cho tơi niền tin, lịng say mê nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán công chức khoa Nông Lâm Ngư, tổ bảo vệ thực vật phịng thí nghiệm, thư viện tạo điều kiện giúp đỡ cho tơi hồn thành khóa luận Để hồn thành khóa luận này, tơi cịn nhận động viên, hỗ trợ lớn vật chất tinh thần gia đình, bạn bè Tôi xin trân trọng biết ơn hướng dẫn, giúp đỡ, động viên Xin chân thành cảm ơn! Nghi lộc, tháng năm 2011 Tác giả luận văn Phan Thị Phƣơng v MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Bảng chữ viết tắt vi Danh mục hình vii Danh mục bảng viii MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết nghiên cứu chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin 1.2 Mục đích yêu cầu nghiên cứu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1.2.2 Yêu cầu CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tính nguy hại việc nhiễm nấm Aspergillus spp độc tố Aflatoxin lương thực, thực phẩm 1.2 Sơ lược loài Aspergillus spp sinh độc tố Aflatoxin 1.2.1 Điều kiện xâm nhiễm sinh độc tố lồi Aspergillus spp 1.2.2 Hình thái học nấm A flavus nấm A paraciticus 1.3 Độc tố Aflatoxin 10 1.3.1 Tính chất hố lý Aflatoxin 12 1.3.2 Aflatoxin tác động sức khỏe người 14 1.4 Các biện pháp chẩn đoán nấm A flavus sinh độc tố Aflatoxin 17 1.4.1 Phương pháp sử dung môi trường CAM (Coconut Agar Medium) 19 1.4.2 Phương pháp vật lý hóa học 20 1.4.3 Phương pháp hóa sinh học (Immunochemical methods) 21 1.4.4 Phương pháp PCR dùng chẩn đoán nấm sinh độc tố Aflatoxin 22 1.5 Tình hình sản xuất lạc, ngô tỉnh Nghệ An 23 vi CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.1.3 Vật liệu nghiên cứu 25 2.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu 26 2.3.1.1 Phương pháp thu thập mẫu đất 26 2.3.2 Phương pháp phân lập mẫu 28 2.3.2.1 Phương pháp phân lập mẫu đất 28 2.3.2.2 Phân lập mẫu nông sản giám định bệnh hại hạt giống nông sản 29 2.3.3 Phương pháp nấu môi trường 30 2.3.3.1 Môi trường thạch nước cốt dừa (Coconut agar medium) 30 2.3.3.2 Môi trường thạch đường khoai tây (Potato- Dextrose- Agar) 31 2.3.3.3 Môi trường thạch (Water agar) 31 2.3.4 Phương pháp chẩn đoán chủng A flavus sinh độc tố Aflatoxin môi trường thạch nước cốt dừa (CAM) đèn tia cực tím (UV) bước sóng λ = 365 nm 31 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 32 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Thành phần mức độ nhiễm bệnh nấm hại ngô Nghi lộc vùng phụ cận 33 3.1.1 Nấm Aspergillus flavus Link 35 3.1.2 Nấm Aspergillus niger van Tiegh 35 3.1.3 Nấm Fusarium moniliforme (tên Fusarium verticillioides) 36 3.1.4 Nấm Fusarium oxysporum Schlechtend Fusarium solani Sacc 36 vii 3.1.5 Nấm Bipolaris maydis Bipolaris turcicum 36 3.1.6 Nấm Rhizopus sp 37 3.1.7 Nấm Penicillium sp 37 3.1.8 Nấm Sclerotium rolfsii 37 3.2 Thành phần nấm hại đất trồng lạc ngô số huyện Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh 37 3.3 Tỷ lệ nhiễm A.flavus nông sản thu từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận 41 3.4 Tỷ lệ nhiễm A.flavus nông sản thu từ kho bảo quản nông hộ vùng Nghi Lộc phụ cận 43 3.5 Tỷ lệ nhiễm A.flavus đất trồng lạc vùng Nghi Lộc phụ cận 44 3.6 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A.flavus thu thập từ đất trồng lạc (Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh) 46 3.7 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A.flavus thu thập từ nông sản thu từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận 51 3.8 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A.flavus thu thập từ nông sản thu từ kho bảo quản vùng Nghi Lộc phụ cận 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 Kết luận 56 Kiến nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 viii BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung A candidus Aspergillus candidus A flavus Aspergillus flavus A fumigatus Aspergillus fumigatus A glacus Aspergillus glacus A nomius Aspergillus nomius A ochraceus Aspergillus ochraceus A oryzae Aspergillus oryzae A paraciticus Aspergillus paraciticus AFB1 Aflatoxin B1 CAM Coconut agar medium ELISA Enzyme – linked immunoabsorbant assay HPLC High – performance liquid chromatography HPTLC High performance thin layer chromatography PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp PDA Potato- Dextrose- Agar TLC Thin – layer chromatography UV Đèn tia cực tím ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo vi thể nấm Aspergillus flavus Link 10 Hình 1.2 Cấu trúc hố học Aflatoxin (Jones, 1977) 13 Hình 1.3 Kết hợp phương pháp để đánh giá chủng sinh độc tố Aflatoxin loài Aspergillus spp 18 Hình 2.1 Sơ đồ nồng độ sử dụng phương pháp pha loãng đất 28 Hình 2.2 Mầu sắc A flavus mơi trường CAM 32 Hình 2.3 Hình ảnh quan sát độc tố Aflatoxin sinh chủng nấm A flavus ánh sáng đèn UV 32 Hình 3.1 Tỷ lệ nhiễm A flavus nông sản thu từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận 42 Hình 3.2 Tỷ lệ nhiễm A flavus nông sản thu từ kho bảo quản nông hộ vùng Nghi Lộc phụ cận 44 Hình 3.3 Tỷ lệ nhiễm A flavus đất trồng lạc vùng Nghi Lộc phụ cận 46 x DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sự có mặt A flavus Aflatoxin mẫu lạc (từ 1967-1983 Philippin) Bảng 1.2: Các loài thuộc chi Aspergillus mycotoxin tạo thành 15 Bảng 3.1 Thành phần mức độ phổ biến nấm bệnh hại hạt giống ngô 33 Bảng 3.2 Thành phần mức độ phổ biến nấm hại hạt lạc giống 34 Bảng 3.3: Bảng thành phần nấm hại đất trồng lạc (ngô) số huyện Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh 38 Bảng 3.4 : Tỷ lệ nhiễm A flavus nông sản thu từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận 42 Bảng 3.5 Tỷ lệ nhiễm A flavus nông sản thu từ kho bảo quản nông hộ vùng Nghi Lộc phụ cận 43 Bảng 3.6: Tỷ lệ nhiễm A flavus đất trồng lạc vùng Nghi Lộc phụ cận 45 Bảng 3.7.1 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ đất trồng lạc Thanh Hóa, Hà Tĩnh 47 Bảng 3.7.2 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ đất trồng lạc Nghệ An 48 Bảng 3.7.3 Tỷ lệ chủng A flavus sinh độc tố Aflatoxin Nghệ An, Thanh Hóa Hà Tĩnh 49 Bảng 3.8 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ nông sản thu từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận 51 Bảng 3.9 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ nông sản thu từ kho bảo quản vùng Nghi Lộc phụ cận 53 50 Tĩnh 16 chủng Thanh Hóa đó: Hà Tĩnh có chủng biến đổi mơi trường có màu vàng sẫm, chủng màu vàng nhạt; Thanh Hóa có chủng vàng sẫm chủng màu vàng nhạt Tất chủng biến đổi môi trường thành màu vàng sẫm hay màu vàng nhạt xuất huỳnh quang màu xanh đèn tia cực tím Kết giúp chấn đốn được, Hà Tĩnh có 10 chủng A flavus có khả sinh độc tố Aflatoxin Thanh Hóa có chủng sinh độc tố Aflatoxin Bảng 3.7.2 khu vực Nghệ An chúng tơi phân lập 58 chủng có 38 chủng có màu vàng sẫm, 10 chủng màu vàng nhạt, 10 chủng màu trắng 48 chủng A flavus làm biến đổi màu môi trường sang màu vàng vàng nhạt quan sát thấy huỳnh quang màu xanh Như vậy, Nghệ An có 48 chủng sinh độc tố Aflatoxin tổng số 58 chủng A flavus thí nghiệm Bảng 3.7.3 cho thấy tỷ lệ chủng A flavus có khả sinh độc tố Aflatoxin cao Với tổng số chủng thí nghiệm 88 chủng có đến 65 chủng sinh độc tố Aflatoxin, chiếm 73,9% Không thể so sánh tỉnh số chủng A flavus khơng nhau, thấy rằng, Nghệ An, Thanh Hóa, tỷ lệ chủng sinh độc tố Aflatoxin cao 71,4% chủng sinh độc tố Hà Tĩnh 80% Nghệ An Thanh Hóa thấp với 43,8% chủng A flavus có khả sinh độc tố Aflatoxin Như vậy, qua bảng 3.7.1; 3.7.2 3.7.3 rút kết luận sau: Hà Tĩnh có 10/14, Nghệ An có 48/58 Thanh Hóa có 7/16 chủng A flavus phân lập từ đất có khả sinh độc tố Aflatoxin Tỷ lệ chủng A flavus có khả sinh độc tố Aflatoxin phạm vi nghiên cứu cao chiếm 71,4 % Những chủng A flavus làm cho môi trường biến đổi sang màu vàng nhạt – màu sắc chưa thể khẳng định chủng nấm có sinh độc tố Aflatoxin hay không Chúng kiểm tra lại cách quan sát huỳnh quang đèn tia cực tím thấy xuất huỳnh quang màu xanh Điều chứng tỏ rằng, chủng có sắc tố vàng nhạt môi trường CAM nghiên cứu chủng sinh độc tố Aflatoxin 51 3.7 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trƣờng CAM chủng A.flavus thu thập đƣợc từ nông sản thu đƣợc từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận Sự nhiễm Aflatoxin lạc vấn đề nghiêm trọng có tính chất tồn cầu tất nước trồng lạc giới Sự nhiễm Aflatoxin không làm ảnh hưởng đến sản lượng lạc gây rào cản cho trình tiêu thu độc tố gây hại cho sức khỏe người Các loài nấm sinh Aflatoxin, A flavus A parasiticus, xâm nhập vào hạt lạc đồng ruộng trước thu hoạch, trình sấy sau thu hoạch, bảo quản, q trình giao lưu bn bán vận chuyển Các chủng A flavus thu thập từ nông sản chợ vùng Nghi Lộc chợ đầu mối thành phố Vinh nuôi cấy theo dõi môi trường CAM quan sát huỳnh quang đèn UV thu kết đánh giá khả sinh độc tố chúng sau: Bảng 3.8 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ nông sản thu từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận Chủng VAN 004 VAL 004 VAL005 VAL 056 VAL 060 VAL 061 VAL 064 VAL 065 VAL 066 CAM Trắng Vàng sẫm Vàng nhạt Vàng sẫm Trắng Vàng nhạt Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm UV Tím Xanh Xanh Xanh Tím Xanh Xanh Xanh Xanh Chủng VAL 073 VAL 081 VAL 083 VAL 084 VAL 086 VAL 087 VAL 088 VAL 093 VAL 096 CAM Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm Trắng Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm UV Tím Tím Xanh Xanh Xanh Tím Xanh Xanh Xanh VAL 068 VAL 070 VAL 072 Vàng sẫm Vàng nhạt Trắng Xanh Tím Tím VAL 097 VAL 100 Vàng sẫm Vàng sẫm Xanh Xanh 52 Kết thu từ bảng 3.8 cho thấy, có 23 chủng A flavus phân lập từ nông sản chợ vùng Nghi Lộc thành phố Vinh đánh giá khả sinh độc tố môi trường CAM huỳnh quang đèn UV, có 14 chủng A flavus có biểu màu vàng đậm môi trường CAM, chủng có sắc tố màu vàng nhạt chủng màu trắng (không làm môi trường đổi màu) Dưới ánh sáng đèn tia cực tím, chủng tiết sắc tố màu vàng nhạt mơi trường CAM có chủng có xuất huỳnh quang màu xanh Như vậy, có 16 chủng tổng số 23 chủng A flavus sinh độc tố Aflatoxin, chủng lại chủng không độc 3.8 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trƣờng CAM chủng A flavus thu thập đƣợc từ nông sản thu đƣợc từ kho bảo quản vùng Nghi Lộc phụ cận Nấm mốc sinh độc tố thường phát triển điều kiện tự nhiên quốc gia vùng nhiệt đới Điều kiện bảo khơng thích hợp (khi nhiệt độ môi trường 270C, độ ẩm môi trường lớn 62%, độ ẩm kho bảo quản lớn 14 % xâm nhập sâu bọ… nhân tố quan trọng để nấm mốc phát triển sinh độc tố Aflatoxin Sử dụng môi trường CAM để đánh giá tỷ lệ A flavus sinh độc tố Aflatoxin mẫu nấm thu thập từ kho bảo quản nhà dân, thu kết đánh sau: 53 Bảng 3.9 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ nông sản thu từ kho bảo quản vùng Nghi Lộc phụ cận Chủng CAM UV Chủng CAM VAL 001 Vàng nhạt Xanh nhạt VAN 050 Vàng sẫm Xanh VAN 001 Vàng sẫm Xanh đậm VAN 052 Vàng sẫm Xanh VAN 005 Vàng nhạt Xanh VAN 053 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 007 Vàng sẫm Xanh VAN 054 Vàng nhạt Xanh nhạt VAN 008 Vàng sẫm Xanh đậm VAN 057 Trắng Tím VAL 009 Trắng Tím VAN 074 Trắng Tím VAN 009 Vàng sẫm Xanh VAN 078 Vàng sẫm Xanh VAL 010 Trắng Tím VAN 080 Vàng nhạt Xanh nhạt VAN 013 Vàng sẫm Xanh VAN 092 Trắng Tím VAL 015 Vàng nhạt Xanh nhạt VAN 094 Vàng nhạt Xanh nhạt VAN 016 Trắng Tím VAN 095 Vàng sẫm Xanh VAL 017 Vàng sẫm Xanh VAN 097 Vàng nhạt Xanh nhạt VAN 021 Trắng Tím VAN 098 Trắng Tím VAL 022 Trắng Tím VAN 099 Trắng Tím VAL 023 Vàng sẫm Xanh VAN 100 Trắng Tím VAN 024 Vàng sẫm Xanh VAL 101 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 027 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 101 Vàng sẫm Xanh VAN 027 Trắng Tím VAL 102 Vàng sẫm Xanh VAL 028 Trắng Tím VAL 104 Vàng sẫm Xanh VAN 028 Trắng Tím VAL 106 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 029 Trắng Tím VAL 110 Trắng Tím VAN 029 Vàng sẫm Xanh VAL 112 Trắng Tím UV 54 VAN 029 Vàng sẫm Xanh VAL 113 Vàng sẫm Xanh VAL 030 Vàng sẫm Xanh VAN 115 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 032 Vàng sẫm Xanh VAL 116 Trắng Tím VAN 032 Vàng sẫm Xanh VAN 117 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 033 Vàng sẫm Xanh VAL 118 Vàng sẫm Xanh VAL 034 Vàng sẫm Xanh VAN 118 Vàng sẫm Xanh VAN 035 Vàng nhạt Xanh VAL 120 Trắng Tím VAN 036 Vàng nhạt Xanh VAN 120 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 037 Trắng Tím VAL 121 Trắng Tím VAL 038 Trắng Tím VAL 122 Vàng sẫm Xanh VAL 039 Vàng nhạt Xanh VAN 123 Vàng sẫm Xanh VAL 040 Vàng nhạt Xanh VAL 125 Vàng sẫm Xanh VAN 041 Vàng nhạt Xanh VAN 125 Vàng sẫm Xanh VAL 042 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 126 Vàng sẫm Xanh VAN 042 Vàng nhạt Xanh nhạt VAN 126 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 043 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 127 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 044 Trắng Tím VAL 129 Vàng sẫm Xanh VAN 044 Trắng Tím VAN 130 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 045 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 131 Vàng sẫm Xanh VAN 046 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 133 Vàng nhạt Xanh nhạt VAL 047 Vàng sẫm Xanh VAL 134 Trắng Tím VAN 047 Vàng sẫm Xanh VAL 138 Trắng Tím VAN 048 Vàng sẫm Xanh VAL 140 Trắng Tím VAL 049 Vàng sẫm Xanh VAL 146 Vàng nhạt Xanh nhạt VAN 049 Trắng Tím VAL 149 Vàng sẫm Xanh VAL 150 Vàng sẫm Xanh 55 Qua bảng 3.9 ta thấy 95 chủng A flavus phân lập từ mẫu nông sản bảo quản quy mô nông hộ, nuôi cấy mơi trường CAM, sau – ngày có: 39 chủng làm môi trường chuyển sang sắc tố vàng sẫm, 29 chủng vàng nhạt 27 chủng màu trắng Quan sát đĩa môi trường CAM ánh sáng tia cực tím thấy: Có 27 chủng cho màu tím, 45 chủng xuất huỳnh quang màu xanh 23 chủng có huỳnh quang màu xanh nhạt Huỳnh quang màu xanh nhạt, xanh, hay xanh đậm biểu có mặt độc tố Aflatoxin môi trường Nếu lượng Aflatoxin sinh mơi trường huỳnh quang có màu xanh nhạt, huỳnh quanh xanh xanh đậm chứng tỏ lượng Aflatoxin tiết vào môi trường nhiều Như vậy, có 68 chủng A flavus tổng số 95 chủng sinh độc tố Aflatoxin, 27 chủng cịn lại chủng A flavus khơng sinh độc tố có 29 chủng A flavus làm mơi trường biến đổi màu vàng nhạt chủng sinh độc tố Aflatoxin sau kiểm tra ánh sáng tia cực tím 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Thành phần nấm hại hạt giống ngô vụ xuân 2011 huyện Nghệ An (Nghi Lộc, Hưng Nguyên, Nam Đàn, Diễn Châu, n Thành Anh Sơn) có lồi Hầu hết loài nấm xuất phổ biến hạt ngơ, đặc biệt hai lồi A flavus A niger có mức độ nhiễm cao hạt, sau lồi F moniliforme Penicillium sp Trên hạt giống lạc xác định loài nấm, nấm gây hại phổ biến thường xuất hạt giống lạc loài A niger, A.flavus loài Penicillium spp F oxysporum loài nấm khác phổ biến Thành phần nấm bệnh đất trồng lạc, ngô huyện Nghệ An, Thanh Hóa Hà Tĩnh vụ xuân năm 2011 gồm 13 lồi thuộc khác Trong loài nấm phổ biến loài Aspergilluss flavus gây bệnh mốc vàng, loài Aspergillus niger gây bệnh mốc đen, Penicillium sp gây mốc xanh lạc, ngơ Các lồi nấm khác có tỷ lệ xuất thấp Tỷ lệ số mẫu nông sản nhiễm nấm A flavus chợ khảo sát Nghi Lộc Nghệ An cao từ 33,3 – 66,7% Các chợ khu vực Nghi Lộc có tỷ lệ số mẫu nhiễm A flavus cao chợ, từ 53,3 – 66,7 % Các chợ khu vực thành phố Vinh có tỷ lệ nhiễm mẫu nhiễm nấm A flavus thấp 33,5 – 50 % Trong kho bảo quản nhà dân mẫu nông sản thu vùng có tỷ lệ nhiễm A flavus cao: Nghi Phong - Nghi Lộc 72%, Nghi Trung 68% Nghi Ân 40,9% Nghi Long 41,2% Các xã Hưng Thông – Hưng Nguyên, Kim Liên – Nam Đàn Diễn An – Diễn Châu: 50 – 57,1 % Thấp Đỉnh Sơn – Anh Sơn với 17,1 % số mẫu thu bị nhiễm nấm A flavus Trên vùng đất trồng luân canh lạc – lúa có tỷ lệ nhiễm A flavus thấp từ – 20% Giai đoạn phát triển lạc ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ nhiễm A flavus Lạc giai đoạn phân cành Diễn Châu, Nam Đàn tỷ lệ nhiễm dao động từ 3,07 – 4,45%; Lạc giai đoạn đâm tia – hình thành củ Hưng Nguyên, Nghi Lộc, Quỳnh Lưu tỷ lệ nhiễm cao dao động từ 10 – 20,6% 57 Thử nghiệm môi trường CAM đèn UV cho thấy Hà Tĩnh có 10 tổng số 14 chủng, Nghệ An có 48 tổng số 58 chủng Thanh Hóa có tổng số 16 chủng A flavus phân lập từ đất có khả sinh độc tố Aflatoxin , chiếm 71,4 % tổng số chủng nghiên cứu Có 23 chủng A flavus phân lập từ nông sản chợ vùng Nghi Lộc thành phố Vinh đánh giá khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM huỳnh quang đèn UV có 16 chủng sinh độc tố Aflatoxin , chủng lại chủng khơng độc Có 68 chủng A flavus sinh độc tố Aflatoxin tổng số 95 chủng phân lập từ mẫu nông sản bảo quản quy mô nông hộ, 27 chủng cịn lại khơng sinh độc tố có 29 chủng A flavus làm mơi trường biến đổi màu vàng nhạt chủng sinh độc tố Aflatoxin sau kiểm tra ánh sáng tia cực tím 10 Sử dụng mơi trường thạch nước cốt dừa để chẩn đoán chủng A flavus sinh độc tố Aflatoxin có ưu điểm: (i) dễ chuẩn bị môi trường; (ii) xác định diện độc tố Aflatoxin nhanh chóng rõ ràng huỳnh quang đèn cực tím; (iii) có mặt Aflatoxin làm môi trường bị biến màu vàng cam_là sở để định tính nhanh chóng Aflatoxin mà khơng cần sử dụng đèn tia cực tím Màu vàng xuất môi trường CAM giúp xác định 94% chủng không sinh độc 71-74% chủng sinh độc tố Aflatoxin Huỳnh quang màu xanh tia cực tím giúp xác định xác 80% chủng khơng sinh độc tố Aflatoxin , 87% chủng sinh độc tố mức thấp 98% chủng sinh độc tố mức cao Kiến nghị Tiếp tục thu thập thêm mẫu đất, nơng sản để đánh giá mức độ ô nhiễm nấm A flavus khu vực Nghi Lộc phụ cận Sử dụng biện pháp đại để đánh giá xác khả sinh độc tố chủng nấm A flavus xác định hàm lượng Aflatoxin nông sản, thực phẩm để đưa khuyến cáo sử dụng 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bùi Xuân Đồng, Hà Huy Kế (2004), Nấm mốc phương pháp phòng chống, NXB khoa học kỹ thuật [2] Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp, ( 2003 ), Nấm mốc độc tố Aflatoxin thức ăn chăn nuôi, NXB nông nghiệp, Hà Nôi [3] Lê Anh Phụng, Nguyễn Thị Kim Loan, Trần Bắc Vi ( 2006 ), Phân lập Aspergillus flavus có khả sinh Aflatoxin cao từ bánh dầu phộng bị mốc, Tạp chí KHKT nơng lâm nghiệp, số 1/ 2006, tr 76 – 78 [4] Ngơ Bích Hảo (2007), Bài giảng môn bệnh hại hạt giống, NXB trường đại học nông nghiệp I [5] Nguyễn Minh Châu, Nguyễn Thị Hịa Bình, Nguyễn Minh Tâm (1995 ), Mức nhiễm aflatoxin ngô số tỉnh Việt Nam, Tạp chí nơng nghiệp, cơng nghiệp thực phẩm, 9: 396 – 397 [6] Nguyễn Thị Cẩm Vi (2010), hiểm họa từ nơng sản nhiễm nấm mốc, tạp chí khoa học ứng dụng, số 12/2010, tr: 14 – 12 [7] Nguyễn Thùy Châu, Nguyễn Hịa Bình, Nguyễn Minh Tâm ( 1997 ), mức độ nhiễm nấm mốc ngô miền bắc Việt Nam thu hoạch năm 1995 – 1996, tạp chí nơng nghiệp, cơng nghiệp thực phẩm, 139 – 141, 3/1997 [8] Ralt G Dietzgen, Loại trừ nhiễm Aflatoxin lạc, Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp quốc tế Ôxtraylia canberra 1999, tr 31 – 32 [9] Trần Tuấn Tú, Đàm Quang Hiếu, Hoàng Thị Ngát, Lê Huy Hàm Phạm Xuân Hội,( 2008 ), nghiên cứu xác định nấm Aspergillus sinh độc tố aflatoxin lạc phản PCA đặc hiệu, Tạp chí khoa học cơng nghệ nông nghiệp Việt Nam số 5, tr: 60 – 68 [10] Challen, C, J.Lunec, W Warren( 1992 ), Analysis of the 53 tumor – suuppressor geen in hepatocellular carcinomas from Britain, Hepatology 16: 1362- 1366 59 [11] Charles Thom and Kenneth B Kaper, (1945), A manual of the Aspergillus, MBLWHOl Library [12] Cleveland, T E., and D Bhatnagar (1990),Evidence for de novo synthesis of an aflatoxin pathway methyltransferase near the cessation of active growth and the onset of aflatoxin biosynthesis in A paraciticus mycelia, Can J Microbio 32: 1.5 [13] F Degola, E Berni, C Dall’Asta, E Spotti, R Marchelli, I Ferrero and F M Restivo (2007), Original article: A multiplex RT-PCR approach to detect aflatoxigenic strains of aspergillus flavus, Journal of Applied Microbiology ISSN, No 103: p.409-17 [14] H K Abbas, R.M Zablotowicz, and M.A Locke, (2004), Spatial variability of Aspergillus flavus soil populations under different crops and corn grain colonization and aflatoxin, Can J Bot 82 (12): 1768 – 1775 [15] Hamed K Abbas, W T shier: B.W.Horn and M A weaver, (2004) Cultural Methods for Aflatoxin Detection: 295-315 [16] Keller, N P., H C Dischinger, Jr., D Bhatnagar, T E., Cleveland, and A H J Ullah, (1993), Purification of a 40 kilodalton methyltransferase active in the aflatoxin biosynthetic pathway, Appl Environ Microbiol 59: 479 – 484 [17] Kurtzman C P., et al (1987), Aspergillus flavus and Aspergillus tamari, Antonie Leeuwenhoek 53:147-157 [18] Lin, M T., and J C Dianese 1976 A coconut-agar medium for rapid detection of aflatoxin production by Aspergillus spp Phytopathology 66:1466-1469 [19] P Rodrigues, C Soares, Z Kozakiewicz, R R.M.Paterson, N Lima and A.Venancio (2007), Identification and characterization of Aspergillus flavus and aflatoxins, Communicating current research and educational topics and trends in Applied Microbiology 60 [20] Payne, G A., G J Nystorm, D Bhatnagar, T E Cleveland, and C P Woloshuk, (1993), Cloning of the afl-2 gene involved in aflatoxin biosynthesis from Aspergillus flavus, Appl Environ Microbiol, 59: 156 – 162 [21] Perng-Kuang Chang, Jeffery W Cary and Gary A Payne (1993), Cloning of the Aspergillus parasiticus apa-2 gene associated with the regulation of aflatoxin biosynthesis, Applied and Environmental Microbiology Vol 59, No.10:p.3273-3279 [22] Roni Shapira et al (1996), Detection of aflatoxigenic molds in grains by PCR, Applied and Environmental Microbiology Vol 62, No.9:p.3270-73 [23] S N Arseculeratne, L M de Silva, S Wijesundera, and C H S R bandunatha, (1969), Coconut as a Medium for the Experimental production of aflatoxin, Applied Microbiology, Vo.18, No.1: p.88-94 [24] Shapira R., N Paster, M Menasherov, O Eyal, A Mett, T Meiron, E Kuttin, and R Salomon (1997), Development of Polyclonal Antibodies for Detection of Aflatoxigenic Molds Involving Culture Filtrate and Chimeric Proteins Expressed in Escherichia coli, Applied and Environmental Microbiology, Mar 1997, p 990-995 [25] Stroka J., Van Otterdijk R and Anklam E., (2000), Immunoaffinity column clean-up prior to thin-layer chromatography for the determination of aflatoxins in various food matrices, J Chromatogr A Dec 29; 904 (2): 251-6 [26] T Mihoko et al (2006), Molecular analysis of an inactive aflatoxin biosynthesis gene cluster in Aspergillus oryzae RIB strains+, Applied and Environmental Microbiology Vol 72, No.1: p.484-490 [27] Wang – Ching Ho and Wen – Hsiung Ko, (1997), A simple method for obtaining single – spore isolates of fungi, Bot, Bull, Acard, Sin (1997) 38: 41 – 44 [28] Wolfgang Henke, Kerstin Herdel, Klaus Jung, Dietmar Schnorr and Stefan A.Loening (1997), Betaine improves the PCR amplification of GC rich DNA sequences Nucleic acids research, Vol.25, No.19, p 3957-58 61 [29] Yabe, K., Y Ando, and T Hamasaki, (1991), Desaturase activity in the branching step between aflatoxinB1 and G1 and aflatoxin B2 and G2, Agric Biol Chem 55: 1907 – 1911 [30] Yu J., Cleveland T E., Nierman W C and Bennett J W (2005), Aspergillus flavus genomics: gateway to human and animal health, food safety, and crop resistance to diseases, Rev Iberoam Miccl 2005; 22: 194-202 [31] Yu, J., J W Cary, D Bhatnagar, T E Cleveland, N P Keller, and F S Chu, (1991), Cloning and characterization of a cDNA from Aspergillus paraciticus encoding an O-methyltransferase involved in aflatoxin biosynthesis, Appl Environ Microbiol., inpress [32] Yu J et al (2004), Minnireview:Clustered pathway genes in aflatoxin biosynthesis, Applied and Environmental Microbiology Vol 70, No.3: p 1253-62 [33] Zheng-You Yang, Won-Bo Shim, Ji-Hun Kim, Seon-Ja Park, Sung-Jo Kang, Baik-Sang Nam and Duck-Hwa Chung (2004), Detection of aflatoxin-producing molds in Korean fermented foods and grains by mutiplex PCR, Journal of food protection, Vol.67, No.11,p 2622-26 [34] Zsuzsanna Mayer, Paul Farber and Rolf Geisen (2003), Monitoring the production of aflatoxin B1 in Wheat by measuring the concentration of Nor-1 mRNA, Applied and Environmental Microbiology Vol 69, No.2:p.1154-58 [35] http://www.biodiversity library.org [36] http://www.aspergillus flavus.org [37] http://www.moitruong.com.vn [38] http://www.nutifood.com.vn/Default.aspx [39] http://www.vnn.vn [40] http://ybacsi.com/y-hoc-pho-thong 62 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG Q TRÌNH LÀM ĐỂ TÀI Thu mẫu nơng sản Thu mẫu đất Đặt hạt nông sản PDA 63 Đặt hạt nông sản giấy thấm Làm slide định loại thành phần lồi nấm đất nơng sản Mẫu nấm Aspergillus flavus cấy 64 Màu sắc Aspergillus flavus đèn UV Mầu sắc A flavus môi trường CAM ... hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu phƣơng pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin môi trƣờng thạch nƣớc cốt dừa (Coconut agar medium)" 1.2 Mục đích yêu cầu nghiên cứu. .. dụng, phương pháp cịn có ưu điểm phát nhanh, nhạy, xác nấm Aspergillus spp sinh độc tố Phương pháp chẩn đoán sử dụng kỹ thuật PCR dựa kết nghiên cứu hệ gen nấm Aspergillus ssp sinh độc tố Aflatoxin. .. sang môi trường thạch nước cốt dừa Màu vàng cam môi trường thạch nước cốt dừa sở để kết hợp với màu huỳnh quang để đánh giá khả 20 sinh độc tố Aflatoxin Aspergillus spp Sự biến đổi màu sắc môi trường