4.1. Tương tác giữa tác nhân KSSH, vi sinh vật nhiễm tạp và vật chủ 4.2. Tác nhân KSSH, công nghệ và phát triển 4.3. Tác nhân KSSH và các quy định về an toàn A. Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm Nuôi cấy đối ngẫu (dual) Khả năng sinh tổng hợp các chất kháng vi sinh vật bay hơi và không bay hơi Khả năng ký sinh lên các phần màng cứng của VSV gây bệnh Khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt Khả năng tương tác ở vùng rễ Khả năng chịu các chất hóa học (trừ sâu, kháng khuẩn) Khả năng sinh enzym thủy phân và kháng sinh Khả năng kích thích sự chống chịu của vật chủ
Các bước phát triển sản phẩm kiểm soát sinh học Khả tương thích Thu thập tác nhân KSSH Xác định đặc tính phân loại Đánh giá áp dụng thử nghiệm Đánh giá PTN Phát triển Nhân giống hàng loạt Mở rộng Áp dụng diện rộng Phối trộn định dạng sản phẩm Cải thiện chủng Tương tác với vùng rễ Lưu kho phân phối Đánh giá chấp nhận sản phẩm Sản phẩm cuối Nghiên cứu Xác định nhiễm tạp Đánh giá toàn diện sản phẩm KSSH 4.1 Tương tác tác nhân KSSH, vi sinh vật nhiễm tạp vật chủ 4.2 Tác nhân KSSH, công nghệ phát triển 4.3 Tác nhân KSSH quy định an toàn 4.1 Tương tác tác nhân KSSH, vi sinh vật nhiễm tạp vật chủ A Thử nghiệm phịng thí nghiệm Ni cấy đối ngẫu (dual) Khả sinh tổng hợp chất kháng vi sinh vật bay không bay Khả ký sinh lên phần màng cứng VSV gây bệnh Khả sống sót điều kiện khắc nghiệt Khả tương tác vùng rễ Khả chịu chất hóa học (trừ sâu, kháng khuẩn) Khả sinh enzym thủy phân kháng sinh Khả kích thích chống chịu vật chủ Nuôi cấy đối ngẫu Khả kháng lại Aspergillus flavus số loài Trichoderma (Desai et al, 2002 Comprehensive testing of Biocontrol agents) Nuôi cấy đối ngẫu Khả Pseudomonas fluorescens PNA1 kháng lại số vsv gây bệnh (Desai et al, 2002 Comprehensive testing of Biocontrol agents) Khả sinh tổng hợp chất kháng vi sinh vật Các chất bay hơi: Cấy riêng chủng VSV đối kháng vsv nhiễm tạp đĩa petri Úp hai đĩa vào bịt kín parafilm Ni kiểm tra khả đối kháng Khả sinh tổng hợp chất kháng vi sinh vật Các chất không bay Dùng màng cellophane có cấy vi sinh vật đối kháng ni bề mặt đĩa petri Bóc lớp màng có chứa VSV Cấy vsv nhiễm tạp Nuôi kiểm tra khả đối kháng Kiểm tra khả ký sinh lên hạch nấm Hạch nấm tiếp xúc với VSV đối kháng nuôi cấy tiếp tục Kiểm tra khả sống sót hạch nấm Tương tự bào tử Tương tác Rahnella aquatilis Botrytis cinerea Interaction between Rahnella aquatilis and Botrytis cinerea: cinerea: A) and C) Light microscope micrography and SEM micrography of test with 20 μl of Rahnella aquatilis suspensions in GP medium (106 cells/ml) and 20 μl of conidial suspension (106 spores/ml) after 48 h incubation at 28 °C B) and D) Light microscope micrography and SEM micrography of control with 20 μl of GP medium without antagonist and 20 μl of conidial suspension (106 spores/ml) after 48 h incubation at 28 °C Calvo et al., 2007 Biological control of postharvest spoilage caused by Penicillium expansum and Botrytis cinerea in apple by using the bacterium Rahnella aquatilis International Journal of Food Microbiology 113(3), 251-257 Tương tác Rahnella aquatilis Penicillium expansum Interaction between Rahnella aquatilis and Penicillium expansum: expansum: A) and C) light microscope micrography and SEM micrography of test with 20 μl of Rahnella aquatilis suspensions in GP medium (106 cells/ml) and 20 μl of conidial suspension (106 spores/ml) after 48 h incubation at 28 °C B) and D) Light microscope micrography and SEM micrography of control with 20 μl of GP medium without antagonist and 20 μl of conidial suspension (106 spores/ml) after 48 h incubation at 28 °C 4.2 Tác nhân KSSH, công nghệ phát triển Sản xuất tác nhân KSSH với khối lượng lớn Tạo chế phẩm Đánh giá hiệu sản phẩm Giới thiệu với người tiêu dùng Đánh giá đặc tính cơng nghệ Quay lại phịng thí nghiệm để nghiên cứu cải tiến Tạo chế phẩm Nhân giống với khối lượng lớn Môi trường, điều kiện nhân giống tối ưu Chi phí thấp Phương pháp lên men (nuôi cấy môi trường lỏng môi trường rắn) Chế phẩm Dạng chế phẩm (bột, dạng lỏng, dạng hạt,…) Bản chất chất độn Chế độ bảo quản, thông tin hạn sử dụng Một số chất bổ sung nhằm kích thích hoạt tính tác nhân KSSH Chế phẩm tác nhân KSSH Dạng bột mịn (dust) thông thường chứa 510% sinh khối theo khối lượng Bột hòa tan (wettable powder) chứa 5080% Dạng hạt (granular) chứa 5-20% Dạng lỏng chứa 10-40% Điều kiện, môi trường nuôi cấy Chủng giống Điều kiện nuôi cấy Phương pháp tạo chế phẩm, chế độ bảo quản Kiểm soát bảo đảm chất lượng Là chế phẩm sinh học phức tạp Khơng có quy tắc chung cho tất loại chế phẩm Kiểm soát độ khiết chủng giống Kiểm soát tốt thiết bị nhà xưởng tránh nhiễm tạp Khó khăn ni cấy môi trường rắn, nuôi cấy bề mặt Kiểm soát tốt điều kiện bảo quản Đánh giá chất lượng cải tiến Đánh giá quy mô lớn Chấp nhận người sử dụng Nghiên cứu cải tiến 4.3 Tác nhân KSSH quy định an Đánh giá tác động đốitồn với mơi trường Đánh giá an toàn sức khỏe người Quy định an toàn cho tác nhân KSSH: nước Bắc Mỹ, chưa có quy định cụ thể Việt nam Cần phối hợp nhiều phía (nhà sản xuất, người tiêu dùng, phịng thí nghiệm, sở y tế, quan quản lý nhà nước,…) Một số lưu ý Đánh giá tương tác với tác nhân bảo quản khác (hóa học, vật lý) Mô tả đặc điểm định tên tác nhân KSSH Hình thái Đặc điểm sinh học phân tử Điều kiện tối thiểu để bộc lộ hoạt tính Định tên Đăng ký, đưa vào danh mục Một số bước tiếp cận ứng dụng sản phẩm KSSH bảo quản 5.1 Áp dụng sau thurau hoạch Thông thường VSV đối kháng phân lập từ bề mặt rau Số lượng tự nhiên VSV đối kháng thường khơng đủ để biểu hoạt tính mạnh Đưa vào lượng lớn VSV đối kháng sản phẩm sau thu hoạch Tăng sinh VSV đối kháng có sẵn sản phẩm Áp dụng sau thu hoạch Ưu điểm Đơn giản, dễ thực sau thu hoạch cách phun, ngâm, tưới Nếu cách, thời điểm (trước VSV gây bệnh xâm nhập) có hiệu cao Ít tốn việc phun thuốc diện tích lớn, dùng VSV nồng độ cao Candida oleophila, Cryptococcus albidus, Pichia membranefaciens Áp dụng sau thu hoạch Giới hạn Cần đưa vào sau thu hoạch trước VSV gây hại xâm nhập Một số vết thương vỏ họ cam chanh có chứa tinh dầu, khó khăn cho VSV đối kháng bám vào Áp dụng sau thu hoạch Giới hạn Hiệu VSV đối kháng tương đối hẹp Phụ thuộc loại rau Phụ thuộc vào hoạt tính đặc hiệu VSV gây bệnh Khả bám dính VSV đối kháng lên bề mặt khác sản phẩm sau thu hoạch khác 5.2 Áp dụng trước thu hoạch Phun định kỳ vào trước thu hoạch Giới hạn Có thể ảnh hưởng mơi trường VSV đối kháng bị tiếp xúc biểu hoạt tính điều kiện khắc nghiệt (nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, VSV khác, thuốc diệt sâu bọ,…) Biện pháp: Lựa chọn VSV có khả thích nghi tốt Cho VSV làm quen, thích nghi với số stress trước ứng dụng 5.3 Dùng chủng biến đổi Các loại hạt lạc, đậu đỗ: Ứng dụng nấm mốc Aspergillus flavus không sinh độc tố aphlatoxin để cạnh tranh với chủng hoang dã sinh độc tố Thường ứng dụng rau tươi 5.4 Xơng khói tiệt trùng sinh học (biofumigation) Dùng số VSV đối kháng có khả sinh chất kháng khuẩn dễ bay (rượu, este, xeton, dẫn xuất axit,…) VSV đối kháng bổ sung dạng hạt, để với hoa Muscodor albus ngăn chặn thối hỏng hoa sau thu hoạch, ngăn chặn số VSV gây bệnh loại bầu bí, cà chua (E coli O157:H7, Salmonella, Listeria monocytogenes) ... pháp tạo chế phẩm, chế độ bảo quản Kiểm soát bảo đảm chất lượng Là chế phẩm sinh học phức tạp Khơng có quy tắc chung cho tất loại chế phẩm Kiểm soát độ khiết chủng giống Kiểm soát tốt thiết... lớn VSV đối kháng sản phẩm sau thu hoạch Tăng sinh VSV đối kháng có sẵn sản phẩm Áp dụng sau thu hoạch Ưu điểm Đơn giản, dễ thực sau thu hoạch cách phun, ngâm, tưới Nếu cách, thời điểm... nhân KSSH Hình thái Đặc điểm sinh học phân tử Điều kiện tối thiểu để bộc lộ hoạt tính Định tên Đăng ký, đưa vào danh mục Một số bước tiếp cận ứng dụng sản phẩm KSSH bảo quản 5.1 Áp dụng