CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chương 2 KỸ THUẬT DI TRUYỀN

NỘI DUNG Mở đầu Khái niệm về ADN tái tổ hợp Các enzym chính sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp Các vector sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp Các hệ thống tế bào chủ Nhân dòng gen Kỹ thuật PCR Xác định trình tự gen CNSH hiện đại khác với CNSH truyền thống ở chỗ lấy kỹ thuật di truyền (genetic engineering) làm trung tâm Kỹ thuật di truyền hay công nghệ gen (gene technology) bao gồm các kỹ thuật thực hiện trên axit nucleic, nhằm điều chỉnh và biến đổi gen, hoặc tạo ra gen mới, từ đó tạo ra sản phẩm mới hoặc các cơ thể mới Để có thể tiến hành được kỹ thuật di truyền hay các thao tác gen, mọi thực nghiệm đều phải sử dụng ADN tái tổ hợp. Do đó, công nghệ ADN tái tổ hợp (recombinant DNA technology) là chìa khóa của kỹ thuật di truyền

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM KHOA NƠNG HỌC Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học Bài giảng Nhập mơn CƠNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUN 2008 Chương KỸ THUẬT DI TRUYỀN NỘI DUNG - Mở đầu - Khái niệm ADN tái tổ hợp - Các enzym sử dụng cơng nghệ ADN tái tổ hợp - Các vector sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp - Các hệ thống tế bào chủ - Nhân dòng gen - Kỹ thuật PCR - Xác định trình tự gen MỞ ĐẦU CNSH đại khác với CNSH truyền thống chỗ lấy kỹ thuật di truyền (genetic engineering) làm trung tâm Kỹ thuật di truyền hay công nghệ gen (gene technology) bao gồm kỹ thuật thực axit nucleic, nhằm điều chỉnh biến đổi gen, tạo gen mới, từ tạo sản phẩm thể Để tiến hành kỹ thuật di truyền hay thao tác gen, thực nghiệm phải sử dụng ADN tái tổ hợp Do đó, cơng nghệ ADN tái tổ hợp (recombinant DNA technology) chìa khóa kỹ thuật di truyền Năm 1972: CƠNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP đời Nhà sinh hóa Stanford, Paul Berg, nối hai đoạn DNA đầu cắt từ virus SV 40 vi khuẩn E coli lại với nhau, tạo phân tử DNA tái tổ hợp Berg nhận giải Nobel Hóa học vào năm 1980 với Walter Gilbert Fred Sanger Năm 1972, hội nghị khoa học Hawaii, Cohen nghe Boyer trình bày thí nghiệm với EcoE1 ông kết luận Boyer đầu dính DNA nối lại với “bị cắt” DNA ligase Sau đó, hai ông gặp thảo luận phương pháp kết hợp phân lập plasmid với cắt nối DNA Họ đưa ý tưởng việc chèn đoạn DNA mong muốn vào plasmid vi khuẩn để sau sản xuất lượng lớn protein đặc biệt – chất công nghiệp công nghệ sinh học Năm 1976, NHỮNG BƯỚC ĐỘT PHÁ CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nhờ kỹ thuật sinh học phân tử, tế bào sử dụng nhà máy nhằm sản xuất hormone protein với quy mơ cơng nghiệp Các sản phẩm “dược phẩm sinh học” có tiềm thương mại lớn Robert Swanson – nhà đầu tư táo bạo thung lũng Silicon, Herb Boyer thành lập hãng Genetech, Inc với mục tiêu tách dòng insulin người Genetech đưa lên sàn giao dịch vào ngày 14/10/1980, bán tới triệu cổ phiếu với mệnh giá 35 $/cổ phiếu- thu tới 35 triệu $ buổi chiều Tới cuối phiên giao dịch, cổ phiếu Genetech lập kỷ lục lên giá tới 89$, kỷ lục cho lần chào bán 1978 Insulin người nhà khoa học Genetech nhân tách dòng vào E coli Genetech sau chuyển giao cơng nghệ sản xuất insulin cho Eli Lilly Năm 1982, insulin người, hay Humulin, trở thành loại thuốc DNA tái tổ hợp Cơ quan Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép Khái niệm ADN tái tổ hợp ADN tái tổ hợp (recombinant DNA) phân tử ADN tạo từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác Phân tử ADN tái tổ hợp tạo nhờ kỹ thuật ghép nối đoạn ADN cá thể khác loài khác loài Kỹ thuật ADN tái tổ hợp gồm bước sau - Nuôi tế bào chủ để tạo vector chuyển gen nuôi tế bào cho để cung cấp ADN - Phân lập gen: Tách chiết ADN plasmid ADN tế bào cho - Cắt hai loại ADN (plasmid tế bào cho) với loại enzym giới hạn - Trộn hai loại ADN vừa cắt với để chúng bắt cặp - Bổ sung ligase để tạo ADN tái tổ hợp - Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ nhân dòng - Chọn lọc dòng tế bào chủ mang ADN tái tổ hợp Nguyên tắc phương pháp giải mã trình tự gen tự động sử dụng rộng rãi thực chất dựa nguyên tắc phương pháp dideoxy Tuy vậy, có số cải tiến áp dụng quy trình phân tích gen tự động, bao gồm thay cho việc sử dụng ddNTP đánh dấu phóng xạ nhóm phosphate, tiểu phần ddNTP nhuộm với thuốc nhuộm phát huỳnh quang khác Theo đó, q trình trùng hợp chuỗi polynucleotit tiến tự động điều khiển máy tính Các ddNTP nhận biết nhờ sử dụng detector phát phát xạ chất phát huỳnh quang bước sóng khác The dideoxy method has been modified so it can be done in one tube In this case all of the ddNTP’s are labeled with different, coloured fluorescent molecules This makes automation much simpler, reduces the cost of the reactions, and speeds up the process tremendously Large sequencing centres use this method and can read millions of bp every single day Sequencing Data Automated DNA Sequencers ABI: ABI 377, 310, 3100, 3100 Avant, 3700, 3730… Amersham: MegaBace 500, 100 Beckman-Coulter: CE2000, 8000 Shimatzu: DSQ1000, 2000… Tại Việt Nam: ABI 3100 Avant: Viện CNSH, Viện Vi sinh vật, ĐH Y HN, Viện Vệ sinh dịch tễ TW ABI 310: ĐHTN, Viện DTNN, ĐH Cần Thơ ABI 377: Viện KH Hình Pharmacia Biotech ALF: ĐH KHTN HN, ĐH KHTN HCM, ĐH BK HN Beckman – Coulter CE 2000: Viện Pasteur HCM, HVQY, BV 108 ABI sequencers ABI sequencers ABI 371 ABI 373 ABI 377 ABI sequencers ABI 310 ABI 3100 ABI 3700 ABI 3100Avant Các sở liệu NCBI (USA); EMBL/EBI (EU); DDBJ (Nhật Bản) NCBI- Trung tâm Quốc gia vỊ Tin häc C«ng nghƯ Sinh häc Hoa Kú 8.4 Lịch sử phân tích hệ gen Sinh vật Virus HIV Kích thước (Mb) Năm kết thúc 9700bp Số lượng gen E.coli 4,6 1997 4200 Nấm men 12,1 1996 6034 Tuyến trùng (Caenorhabditis elegans) 97 1998 19099 Thực vật Arabidopsis 100 2000 25000 Ruồi giấm (Drosophila melanogaster 180 2000 13061 Chuột thí nghiệm Mus musculus 2600 2002 30000 Người (Homo sapiens) 3200 2003 30000 - 35000 Dự án hệ gen người Bắt đầu từ năm 1990, dự kiến kết thúc vào năm 2005, kinh phí tỉ USD Do Viện Sức khỏe quốc gia Mỹ điều phối với tham gia nhà khoa học nhiều nước 1998, Craig Venter Perkin Elmer liên kết với thành lập Celera Genomics Mục tiêu: giải trình tự toàn Hệ gen Người vào ngày 31/12/2001, trước năm so với Dự án Hệ Gen Người, với 300 triệu $ Mục tiêu dự án: - Xác định tất gen người - Xác định trình tự nucleotide người - Lưu trữ thơng tin liệu - Cải tiến công cụ lưu trữ liệu - Chuyển giao công nghệ cho khu vực tư nhân - Vạch vấn đề đạo đức, luật pháp xã hội dự án Ngày 15 16/ 02/ 2001: Đồng thời xuất hai tạp chí Di truyền tiếng Nature (Collins cộng sự, Dự án giải mã Hệ gen Người) Science (Venter cs, Celera Genomics) Cả hai tạp chí cung cấp báo miễn phí Ngày 14/ 04 / 2003: Hoàn thành Dự án Genome Người Tổ hợp quốc tế Giải mã Genome Người tuyên bố hồn thành xuất sắc dự án giải trình tự Genome Người sớm năm so với kế hoạch “Dự án Genome Kết cho thấy: - Bộ gen người chứa khoảng 3,2 tỷ bp - Tổng số gen khoảng 30 – 35 ngàn gen (thấp nhiều so với dự đoán ban đầu 50 – 140 ngàn gen) - Gần 75% gen chưa biết chức - Ít 2% gen mã hóa cho protein THANK YOU FOR YOUR ATTENTION ! ... nuôi tế bào cho để cung cấp ADN - Phân lập gen: Tách chiết ADN plasmid ADN tế bào cho - Cắt hai loại ADN (plasmid tế bào cho) với loại enzym giới hạn - Trộn hai loại ADN vừa cắt với để chúng bắt... để tạo ADN tái tổ hợp - Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ nhân dòng - Chọn lọc dòng tế bào chủ mang ADN tái tổ hợp Các enzyme cơng nghệ ADN tái tổ hợp Có nhóm enzym sử dụng cơng nghệ ADN tái... từ 10 – 20 base 3 .2 Enzyme nối Qúa trình nối phân tử ADN với để tạo nên phân tử ADN tái tổ hợp cần xúc tác enzym nối (ligase) Ligase xúc tác hình thành liên kết phosphodieste hai chuỗi ADN DNA