Nghiên cứu chiết tách và định danh các phytoncid chủ yếu có trong củ nén ở quảng nam

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Cơng trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRẦN THỊ NGỌC THANH NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ PHYTONCID CHỦ YẾU TỪ CỦ NÉN Ở QUẢNG NAM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ THỊ LIÊN THANH Phản biện 1: PGS.TS LÊ TỰ HẢI Phản biện 2: TS NGUYỄN THỊ BÍCH TUYẾT Chuyên ngành : Hoá hữu Mã số : 60 44 27 Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ khoa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 30 tháng 11 năm 2012 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC * Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng Đà Nẵng - Năm 2012 - Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng 3 MỞ ĐẦU Lý chọn ñề tài Ai biết rằng: Ăn mặc nhu cầu thiếu chủ yếu từ củ nén Quảng Nam Mục đích nghiên cứu - Xây dựng qui trình chiết tách chất kháng sinh thực vật - Xác định cơng thức cấu tạo, danh pháp phytoncid chủ ñối với người Chính chế biến ăn ngon hỗ trợ cho sức yếu có dịch chiết củ nén khỏe người ln khuyến khích đề cao Đối với người Việt - Nam vấn đề sử dụng ăn hợp lí ln nhân dân ta Đối tượng phạm vi nghiên cứu Xác ñịnh khả kháng khuẩn dịch chiết từ củ nén trọng mức Có thể thấy hợp với số gia vị Đối tượng nghiên cứu: Cử nén Quảng Nam định có dùng ăn phát huy hết cơng dụng Nơi thực hiện: Phịng thí nghiệm Trường ĐHSP thành phố ĐÀ ví dụ: Vịt cần gừng, gà cần chanh, bò nướng cần nén, heo cần hành… NẴNG trung tâm khác Có thể nói gia vị phần khơng thể thiếu, trực giác chất Phương pháp nghiên cứu ñiều vị giúp gia tăng hương vị màu sắc tăng hấp dẫn cho 4.1 Phương pháp vật lí ăn điều phần giúp cho tiêu hóa hấp thụ thức ăn tốt sâu xa sử dụng gia vị tận hưởng hoạt chất kháng sinh thực vật – phytolcid có cơng dụng giúp thể kháng khuẩn Có thể thấy cơng dụng loại gia vị tồn kho tàng tri - Xác ñịnh ñộ ẩm củ nén 4.2 Phương pháp hóa học - Xác định số thành phần hóa học củ nén 4.3 Phương pháp hóa lý: thức nhân gian có loại khoa học chứng minh rõ ràng - Xác ñịnh khả hấp phụ UV/VIS nghệ, gừng, tỏi… Nhưng có loại gia vị ñược dùng vị - Định danh phytolcid phương pháp GC/MS thuốc dân gian chưa hiểu rõ công dụng thực củ nén, kiệu… 4.4 Phương pháp hóa sinh - Sử dụng phương pháp Ferry cyanure ñể xác ñịnh hàm lượng Nén hay hành tăm có nguồn gốc Bắc Á, Bắc Âu châu Bắc Mỹ, ñã ñược trồng sử dụng từ 5000 năm Ở Việt Nam nén ñược trồng từ lâu ñời nhiên ñược trồng ñại trà có glucid tổng 4.5 Phương pháp vi sinh - Xác ñịnh khả kháng khuẩn củ dịch chiết củ nén chất lượng tốt vùng ñất từ Quảng Nam Quảng Trị, nhiều Ý nghĩa khoa học thực tiễn: Nghệ An nén thường trồng làm rau ăn lấy củ làm thuốc 5.1 Ý nghĩa khoa học Xuất phát từ nguồn nguyên liệu dồi Quảng Nam để biết rõ cơng dụng phytoncid củ nén, mạnh dạn chọn ñề tài : Nghiên cứu chiết tách ñịnh danh phytoncid - Chiết tách phytoncid từ củ nén - Định danh phytoncid chủ yếu từ củ nén 5.2 Ý nghĩa thực tiễn - Vai trò phytolcid từ loại gia vị vào thực tế cách 1.3.2.6 Khuấy trộn khoa học 1.3.3 Một số dung môi thường sử dụng chiết tách Cấu trúc luận văn 1.3.4 Một số phương pháp tách chiết thường dùng : Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.3.4.1 Ngâm Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.3.4.2 Phương pháp chiết xuất ngấm kiệt Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1.3.4.3 Phương pháp chiết tách ngược dịng 1.3.4.4 Chiết xuất khí hóa lỏng siêu tới hạn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung nén (Hành tăm) 1.3.4.5 Chiết siêu âm 1.4 Tình hình nghiên cứu họ hành tỏi giới nước CHƯƠNG 1.1.1 Đặc ñiểm thực vật phân loại 1.1.2 Thành phần hóa học ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.2 Giới thiệu chung chất kháng sinh thực vật – phytoncid 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 1.2.1 Định nghĩa 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 1.2.2 Phân loại Nguyên liệu thực nghiệm củ nén Quảng Nam 1.2.3 Tính chất 2.1.2 Hóa chất thiết bị 1.2.4 Ứng dụng phytoncid 2.1.3 Nơi thực nghiên cứu 1.2.5 Một số hợp chất có họ hành tỏi 2.2 Phương pháp nghiên cứu 1.2.5.1 Hợp chất Allicin 2.2.1 Phương pháp vật lý: Xác ñịnh hàm lượng nước có 1.2.5.2 Hợp chất Diallyl disunfide nguyên liệu 1.3 Phương pháp tách chiết hợp chất phytoncid 2.2.2 Phương pháp hóa học: Xác định phytoncid 1.3.1 Khái niệm 2.2.3.Phương pháp hóa sinh: 1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng ñến trình chiết tách 2.2.3.1 Xác ñịnh hàm lượng glucid tổng 1.3.2.1 Dung mơi 2.2.3.2 Xác định hàm lượng nitơ tổng số 1.3.2.2 Nồng ñộ dịch chiết 2.2.3.3 Đo quang phổ hấp thụ phân tử UV/VIS 1.3.2.3 Đặc ñiểm nguyên liệu 2.2.4 Phương pháp hóa lý 1.3.2.4 Nhiệt ñộ 2.2.4.1 Xác ñịnh hàm lượng nguyên tố vi lượng 1.3.2.5 Thời gian 2.2.4.2 Đo quang phổ hấp thụ phân tử UV/VIS 2.2.4.3 Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC/MS ) lượng nước có nguyên liệu yếu tố gây ảnh 2.2.5 Phương pháp vi sinh vật hưởng ñến hiệu chiết tách Để nâng cao hiệu suất chiết tách hợp chất mong muốn từ nguyên liệu tươi, cần phải loại bỏ hoàn CHƯƠNG toàn nước khỏi nguyên liệu trước tiến hành chiết tách Vì KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN trình xử lý làm nhỏ nguyên liệu người ta thường bổ sung 3.1 Xác định số thành phần hóa học có củ nén Trong nghiên cứu này, chúng tơi xác ñịnh số thành phần lượng chất hút ẩm phù hợp (Na2SO4) ñể loại nước Khối lượng chất hút ẩm cần dùng tùy thuộc vào khối lượng ñộ ẩm nguyên liệu chiết tách Theo A.F.Nametnhicov [12], ñối với loại chất hút ẩm hóa học nguyên tố kim loại sau: + Hàm lượng nước Na2SO4, khối lượng chất hút ẩm cần dùng 40- 45g Na2SO4 / g + Hàm lượng gluxid tổng nguyên liệu tươi - Hàm lượng glucid tổng củ nén Quảng Nam xấp + Hàm lượng protein + Hàm lượng nguyên tố: canxi, natri, kali, magie xỉ với hàm lượng gluxid tổng thành phần hóa học củ nén Kết xác định trình bày bảng 3.1 theo tài liệu [6] So với hàm lượng glucid củ tỏi hàm lượng Bảng 3.1 Hàm lượng nước nguyên liệu tươi ñược nghiên cứu glucid củ nén thấp nhiều tỏi thành phân glucid chiếm 40% Thành phần Đơn vị tính Hàm lượng Nước % khối lượng 86,3 thành phần khơng có lợi cho q trình chiết tách Nhưng củ Glucid tổng %(CK) 6,53 nén hàm lượng protein khơng đáng kể Do khơng ảnh hưởng Protein %(CK) 1,59 nhiều đến q trình chiết tách Canxi % CK 0,04 Kết phân tích hàm lượng, nguyên tố vi lượng Kali % CK 0,25 củ nén cho thấy: hàm lượng nguyên tố Ca, K, Na, Mg, so với họ Magie % CK 0,03 hành tỏi gần [7],[9] Natri % CK 0,02 Nhận xét: - Hàm lượng nước nguyên liệu tươi nằm khoảng 86,3% hoàn toàn phù hợp với hàm lượng nước cơng bố tài liệu [37] Trong q trình chiết tách ngun liệu tươi, hàm - Protein thành phần dưỡng chất quan trọng lại Vậy với số thành phần củ nén xếp nén vào họ hành tỏi Từ lâu, dân gian người ta thường sử dụng nén làm gia vị, chữa bệnh thời tiết… hiệu song chưa có minh chứng cho thấy củ nén có cơng dụng củ nén có chứa hợp chất phytoncid – kháng sinh thực vật nên 10 nghiên cứu sau giúp chứng minh ñiều cần biết giá trị 5.728 0.15 Allicin 8.169 0.42 Dialyl disulfide 12.450 1.2 n- dược lý củ nén 3.2 Xác ñịnh số cấu tử hỗn hợp chiết Dựa theo tài liệu nghiên cứu [15],[16] xác ñinh số thành phần tỏi Mà nén thuộc họ hành tỏi nên tơi áp dụng quy trình ngâm chiết tỏi ñối với nén: tiến hành ngâm chiết củ nén giã nát dung môi cồn 960 với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 80/10(ml/g) thời gian ngâm 30 ngày nhiệt ñộ 200C, pH=7 hexadecanoic Sau chiết rút hỗn hợp dịch chiết ñược tiến hành ñịnh danh cấu acid tử phương pháp GC/MS Từ kết phân tích phổ GC-MS, số cấu tử 12.775 0.32 có dịch chiết củ nén trình bày bảng hexadecanoic acid ethyl ester Bảng 3.2 Một số hợp chất phytolcid có dịch chiết củ nén Định danh S Thời Phần Công thức cấu tạo T gian trăm acid,2- hydroxy T lưu (%) -1-(hydroxy 4.161 1.01 4.516 8.85 0.66 Hexadecanoic 1,2- metyl)ethyl benzenediol ester 17.230 18.637 1.54 9,12- 4- octadecadienoi mecaptophenol c acid (z,z)-,2hydroxy-1- 5.146 0.78 1,2benzenediol,4 – methyl (hydroxymethy l) ethyl ester OH O O C2H5 12 11 Từ kết phổ hình 3.1 bảng 3.2 ñã xác ñịnh ñược thành phần số phytoncid chủ yếu có dịch chiết củ nén: 1,2- [39], [40] cho thấy củ nén chứa hợp chất mang ñặc tính sinh học có họ hành tỏi là: Diallyl disulfide, allicin benzenediol, 4-mecaptophenol, 1,2-benzenediol-4–methyl; Allicin; Diallyl disulfide hợp chất hữu không phân cực, nên tiến Diallyl disulfide; n- hexadecanoic acid; hexadecanoic acid ethyl hành chiết tách diallyl disulfide dung môi hữu không phân ester; Hexadecanoic acid,2- hydroxy -1-(hydroxy metyl)ethyl ester; cực (n- hexan, ete dầu hỏa, axeton, cồn 960) 9,12-octadecadienoic acid (z,z)-,2-hydroxy-1-(hydroxymethyl) ethyl ester Giá trị mật ñộ quang diallyl disulfide ñược biểu diễn hình 3.3 So với thành phần hóa học củ tỏi tài liệu [9],[24] ñã disulfide; Ajoen; diallyl trisulfid… Và chứng minh ñược allicin, diallyl disulfide; ajoen hợp chất có khả kháng khuẩn cao có tính chất định khả kháng khuẩn dịch chiết tỏi Nên tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng ñến hiệu suất thu hồi allicin diallyl disulfide Mặt khác xét mặc tính chất allicin Giá trị mật ñộ quang thu ñược diallyl disulfide cơng bố thành phần hóa học tỏi có chứa allicin; diallyl Giá trị mật độ quang thu ñược 1.4000 1.2000 1.0000 0.8000 0.6000 0.4000 0.2000 0.0000 chất khơng màu, dễ bị oxy hóa làm cho hoạt tính kháng khuẩn giảm 1.2004 1.0573 0.9732 0.8698 ete dầu hỏa n-hexan axeton cồn 96 Dung mơi nhiều Cịn diallyl disulfide chất có màu, bền allicin Bằng phương pháp đo quang phổ xác định ñược hàm lượng diallyl disulfide λmax = 240nm [28],[33] Để chứng minh xem với ñiều kiện ngâm chiết tỏi có phải tối ưu củ nén hay khơng Hình 3.3 So sánh hiệu chiết diallyl disulfide từ củ nén Quảng Nam dung môi hữu khác điều kiện nên tơi tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng ñến hiệu suất thu hồi phytolcid mà cụ thể diallyl disulfide Nhận xét: Từ hình 3.3, cho thấy Khi chiết với loại dung môi 3.3 Chọn dung môi chiết tách phytoncid chủ yếu củ khác hàm lượng diallyl disulfide thu hồn tồn nén khác Khi sử dụng dung môi ete dầu hỏa, n- hexan, axeton, Thông thường yêu cầu dung môi phải hòa tan tốt cấu tử cần chiết, cấu tử cần chiết có cấu tạo phân cực phải chọn dung cồn 960 cho giá trị mật ñộ quang thu ñược là: 1,2004; 1,0573; 0,9732; 0,8698 môi phân cực nước, ethanol, methanol Ngược lại cấu tử Cụ thể chiết với axeton giá trị mật độ quang thu gấp cần chiết khơng phân cực phải lựa chọn dung mơi khơng phân cực 1.12 lần so với chiết với cồn 960C, chiết ete dầu hỏa cho giá trị benzen, n- hexan, ete dầu hỏa, cồn cao ñộ Dựa tư liệu mật ñộ quang cao gấp 1,38 lần so với dùng dung môi 13 14 cồn 960C Từ kết thu ñược, hiệu suất chiết tách diallyl disulfide tươi ñến hiệu chiết diallyl disulfide, tiến hành khảo sát tỉ dung mơi xếp theo thứ tự giảm dần, có nghĩa ete lệ dung mơi/ ngun liệu tươi sau: 50/10 ; 60/10 ; 70/10 ; 80/10; dầu hỏa > n- hexan > axeton > cồn 96 C Sự khác hiệu chiết dung môi giải thích sau: Hiệu chiết dung môi phụ thuộc vào khả khuếch tán dung môi vào sâu bên lớp nguyên liệu Cả loại dung mơi nghiên cứu có khả chiết ñược diallyl disulfide, loại dung mơi lại có ưu nhược điểm riêng Dung mơi ete dầu hỏa n-hexan ñều cho khả chiết cho giá trị mật ñộ quang cao ñề tài tiến hành chiết số phytolcid chủ yếu dịch chiết củ nén mà dịch chiết ngồi diallyl disulfide phytoncid có hoạt tính kháng khuẩn cao cịn có allicin chất có khả 90/10; 100/10 (ml/g) Giá trị mật độ quang diallyl disulfide biểu diễn hình 3.5 Giá trị mật ñộ quang thu ñược 0.88 0.86 0.84 0.82 0.8 0.78 0.76 0.74 0.72 0.7 0.8643 0.8457 0.8259 0.7925 0.7683 0.7562 50/10 60/10 70/10 80/10 90/10 100/10 Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (ml/g) kháng khuẩn mạnh không thường có hàm lượng cao [22] củ nén giã nát Mặc khác, mặt tính chất hóa học allicin lại chất tan tốt etanol 95% ete dầu [39] Dựa vào tính chất hai hợp chất có tính kháng khuẩn cao allicin diallyl disulfide nên dùng dung mơi cồn 960 ete dầu ñể ngâm chiết nén chủ yếu dùng làm gia vị chế biến thực phẩm nên sử dụng ethanol 960 phù hợp Hơn nữa, ete dầu hỏa có tính độc, chi phí lại cao nên cho dù hiệu suất chiết tách cao so với ethanol Nên tơi chọn dung mơi cồn 960 để tiến hành thí nghiệm 3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng ñến hiệu suất chiết tách số phytoncid chủ yếu từ củ nén 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung mơi/ngun liệu tươi (ml/g) đến hiệu suất chiết tách Để khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ dung mơi/ ngun liệu Hình 3.5 Ảnh hưởng tỷ dung môi cồn 960/ nguyên liệu củ nén giã nát ñến giá trị mật ñộ quang thu ñược Nhận xét: Kết ñồ thị hình 3.5 cho thấy: tăng tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu tươi, nhìn chung hàm lượng diallyl disulfide thu tăng dần ñạt cực ñại tỉ lệ 80/10 (ml/g) Khi thay ñổi tỉ lệ từ 70/10 ñến 80/10 giá tri mật ñộ quang diallyl disulfide thu ñược tăng, vượt qua ngưỡng cực ñại giá tri mật độ quang diallyl disulfide bắt đầu giảm dần Như tùy thuộc vào tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu tươi khác mà hiệu suất chiết diallyl disulfide khác Khi sử dụng tỉ lệ dung mơi/ngun liệu tươi cao đồng nghĩa với lượng dung mơi sử dụng lớn, giúp hịa tan triệt để lượng diallyl disulfide có nguyên liệu làm cho hiệu chiết cao Ngược lại sử dụng tỉ lệ nhỏ khơng đủ 15 16 dung mơi hịa tan hết ñược diallyl disulfide nguyên liệu nên diallyl disulfide hiệu chiết thấp Tuy nhiên ñã ñạt ñến mức ñộ chiết cao Kết hình 3.7 cho thấy: Ứng với nhiệt độ chiết khác tiếp tục tăng thể tích dung mơi khơng mang lại hiệu cho giá trị mật độ quang thu có khác biệt rõ rệt lúc số tạp chất bị chiết theo gây lãng phí dung mơi Điều ñó cho thấy nhiệt ñộ yếu tố có ảnh hưởng Kết thí nghiệm khảo sát nêu cho hiệu chiết diallyl disulfide cao tỉ lệ 80/10 (ml/g) đến q trình chiết tách Khi tăng nhiệt độ giá trị mật độ quang diallyl disulfide thu 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hiệu suất thu hồi ñược tăng dần ñạt cực ñại 250C Tuy nhiên nhiệt ñộ diallyl disulfide tiếp tục ñược tăng lên 300C giá trị mật độ quang giảm Nhìn Tùy thuộc vào tính chất cấu tử cần chiết dung mơi mà lựa chọn nhiệt ñộ cho phù hợp chung giá trị mật ñộ quang thu ñược tương ñối cao nhiệt độ dao động từ 20- 250C Tiến hành thí nghiệm: Cho vào bình cầu, bình 10 gam củ nén ñã ñược xử lý 80ml cồn 96 Tiến hành ngâm chiết 0 0 Nhiệt độ cao có tác dụng tăng tốc ñộ khuếch tán giảm ñộ nhớt dung dịch, giúp phân tử cần chiết dễ dàng khuếch tán 30 ngày mức nhiệt ñộ : C, 10 C, 15 C, 20 C, lịng phân tử dung mơi đó, làm tăng tốc ñộ khuếch 250C, 300C Dung dịch chiết ñược gia nhiệt thiết bị tự ñộng ñể tán dẫn ñến hiệu thu hồi dịch chiết mang cấu tử cần chiết tốt ñạt nhiệt ñộ yêu cầu thời gian ngâm chiết 30 ngày Mặt khác, nhiệt ñộ giúp làm biến tính màng tế bào phá hủy màng Dịch chiết thu ñược ñược xác ñịnh giá trị mật ñộ quang (A) thiết bị ño quang UV/VIS tế bào nhờ bọt khí tạo thành làm cho q trình chiết tách dễ dàng Tuy nhiên điều khơng có nghĩa tăng nhiệt độ Giá trị mật ñộ quang diallyl disulfide ñược biểu diễn hình 3.7 hiệu chiết tách tăng theo, nhiệt độ q cao làm biến đổi tính chất diallyl disulfide Nhìn chung hàm lượng diallyl disulfide thu ñược tương ñối cao nhiệt ñộ dao ñộng A(nm) khoảng 200 – 250C Mặc khác hợp chất khác có khả kháng 0.88 0.87 0.86 0.85 0.84 0.83 0.82 0.8675 0.8693 0.8662 0.8563 tác dụng 250C nhiệt ñộ cao 0.8352 0.8274 10 15 khuẩn cao allicin lại chất không bền dễ dàng bị oxy hóa, Theo kết nghiên cứu tạp chí World Health 20 25 30 Nhiệt ñộ (oC) Organization [18], thành phần hóa học củ tỏi chiết với dung mơi ethanol nhiệt độ 00C- 50C thành phần chủ yếu alliin, 20- 250C alliin khơng cịn mà chuyển allicin diallyl Hình 3.7 Ảnh hưởng nhiệt ñộ chiêt ñến giá trị mật ñộ quang disulfide, nhiệt ñộ cao >250C –