Giám sát sự lưu hành type virus và khảo sát yếu tố nguy cơ phát sinh dịch cúm gia cầm trên địa bàn huyện bố trạch tỉnh quảng bình

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khn khổ đề tài khoa học cấp tỉnh Quảng Bình “Thực trạng yếu tố nguy dẫn đến dịch bệnh cúm gia cầm Quảng Bình” năm 2017 PGS.TS Nguyễn Xn Hịa làm chủ nhiệm Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa có cơng bố cơng trình nghiên cứu Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Thừa Thiên Huế, tháng 05 năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Vân Anh ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo, PGS.TS Nguyễn Xn Hịa tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian triển khai, thực đề tài hoàn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới quý thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y, sở đào tạo trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế quan tâm, tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập, làm đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Chi cục Chăn nuôi Thú y tỉnh Quảng Bình, Phân viện Thú y Miền Trung NCS Phạm Hồng Kỳ tạo điều kiện hỗ trợ tơi q trình thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp chia sẻ, động viên suốt thời gian qua Mặc dù, thời gian thực tập, chúng tơi có nhiều cố gắng khơng tránh khỏi sai sót, chúng tơi mong nhận góp ý động viên quý thầy cô giáo, bạn đồng nghiệp để nghiên cứu chúng tơi ngày hồn thiện Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu kính chúc q thầy giáo, bạn đồng nghiệp sức khỏe hạnh phúc./ Xin cảm ơn kính chào trân trọng! Thừa Thiên Huế, tháng 05 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Vân Anh iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài: Giám sát lưu hành type virus khảo sát yếu tố nguy phát sinh dịch cúm gia cầm địa bàn huyện Bố Trạch tỉnh Quảng Bình Tác giả luận văn: Nguyễn Thị Vân Anh Khóa: TY K22 Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Xn Hịa Từ khóa (Keyword): Sự lưu hành; khảo sát yếu tố nguy cơ; A/H5N6; RT-PCR Để khống chế dịch bệnh cúm gia cầm cách có hiệu quả, đồng thời, đáp ứng nhu cầu nguồn gen nghiên cứu đặc tính phân tử nguồn gen chủng cúm type A, subtype H5N6 phân lập từ loài mắc bệnh khác Việt Nam, thực đề tài: “Giám sát lưu hành type virus khảo sát yếu tố nguy phát sinh dịch cúm gia cầm địa bàn huyện Bố Trạch tỉnh Quảng Bình” Đối tượng nghiên cứu bao gồm gà, vịt nuôi số hộ chăn nuôi địa bàn huyện Bố Trạch – tỉnh Quảng Bình Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8/2017 đến tháng 1/2018 Dựa vào điều kiện tự nhiên hoạt động liên quan đến chăn nuôi gia cầm huyện Bố Trạch với ưu tiên lựa chọn xã ổ dịch cũ, vùng nguy cao Trong đề tài chia khu vực: Khu vực I (các xã miền núi); khu vực II (các xã đồng bằng, trung du), khu vực III (các xã ven biển) Bằng phương pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm SPSS 20 phân tích dịch tễ học, thơng qua số nguy tương đối (RR) để phân tích yếu tố nguy làm phát sinh dịch cúm gia cầm huyện Bố Trạch Sử dụng phương pháp Realtime RT-PCR để kiểm tra có mặt virus cúm gia cầm Sau mẫu dương tính với virus cúm A/H5N6 giải trình gen H5 phương pháp Sanger dideoxy sequencing Chúng thu kết sau các yếu tố nguy làm phát sinh lây lan dịch cúm gia cầm gồm: Nuôi thả rông gia cầm (RR = 1,869); không vệ sinh dụng cụ chuồng trại (RR = 1,083); Tiếp xúc với chim trời (RR = 1,636); khơng tiêm vaccine phịng bệnh cúm gia cầm (RR = 2,510); Trong 36 mẫu dịch hầu họng có 12/36 mẫu dương tính với cúm A tỷ lệ 33,33 %, có 3/36 mẫu dương tính với cúm A/ H5N6 tỷ lệ 8,33 % Tỷ lệ dương tính với gen M cao tháng (66,67%) không lưu hành tháng (0%), tỷ lệ dương tính với virus cúm A/H5N6 cao tháng 11,12,01 (16,67%), không lưu hành tháng tháng 8,9,10 (0%) Chúng tơi thu nhận tồn chuỗi gen H5 chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BT1113/2017(H5N6) có độ dài 1704 nucleotide đăng ký Ngân hàng gen số: LC376799 Chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BT1113/2017(H5N6) chứa chuỗi aminoacid RERRRKR/GLF có độc lực cao Mức độ tương đồng tương đối cao amioacid chủng so sánh từ 89-99% chuỗi gen H5 với chủng phân lập Việt Nam trước số nước châu Á iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii TÓM TẮT LUẬN VĂN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG .viii DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ ix ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 KHÁI NIỆM VÀ LỊCH SỬ BỆNH CÚM GIA CẦM 1.2.1 Tình hình bệnh cúm gia cầm giới 1.2.2 Tình hình bệnh cúm gia cầm Việt Nam 1.3 VIRUS HỌC BỆNH CÚM GIA CẦM 15 1.3.1 cấu trúc virus cúm gia cầm 15 1.3.2 Nét đặc trưng hệ gen 16 1.3.3 Đặc điểm kháng nguyên – miễn dịch 19 1.3.4 Độc lực virus 21 1.3.5 Đặc điểm nuôi cấy lưu giữ virus cúm gia cầm 22 1.3.6 Sức đề kháng virus 22 1.4 TRUYỀN NHIỄM HỌC 22 1.4.1 Động vật cảm nhiễm 22 1.4.2 Con đường truyền lây 23 1.4.3 Mùa phát bệnh 23 1.5 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH 24 1.5.1 Triệu chứng 24 1.5.2 Bệnh tích 24 v 1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN 26 1.6.1 Chẩn đoán dịch tễ học 26 1.6.2 Chẩn đoán lâm sàng 26 1.6.3 Chẩn đoán virus học 26 1.6.4 Chẩn đoán huyết học 26 1.7 HIỂU BIẾT VỀ KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR 27 1.7.1 Phản ứng Realtime RT-PCR 27 1.7.2 Cơ chế hoạt động Real time PCR sử dụng Taqman probe làm chất phát huỳnh quang 27 1.8 HIỂU BIẾT VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN 28 1.8.1 Phương pháp hóa học giải trình tự DNA 29 1.8.2 Phương pháp enzyme giải trình tự DNA 30 1.8.3 Giải trình tự máy tự động (automated sequencer) 31 1.9 ỨNG DỤNG HỆ THỐNG THÔNG TIN ĐỊA LÝ TRONG QUẢN LÝ DỊCH BỆNH CÚM GIA CẦM 33 1.10 TÌNH HÌNH CHĂN NI GIA CẦM TRÊN ĐỊA BÀN HUYỆN BỐ TRẠCH 34 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU CỤ THỂ 36 2.1.1 Phạm vi nghiên cứu: 36 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu: 36 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 36 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.3.1 Nguyên liệu 37 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 39 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học 40 2.3.4 Phương pháp thu thập, vận chuyển bảo quản bệnh phẩm 42 2.3.5 Số lượng mẫu 42 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 42 2.3.7 Phương pháp Realtime RT-PCR 42 2.3.8 Giải trình tự gen HA phương pháp Sanger dideoxy sequencing 45 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 47 vi 3.1 DIỄN BIẾN DỊCH CÚM GIA CẦM TẠI HUYỆN BỐ TRẠCH TỪ NĂM 2012 2017 47 3.1.1 Phân bố ổ dịch cúm gia cầm theo thời gian 47 3.1.2 Phân bố ổ dịch cúm gia cầm theo không gian 49 3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ NGUY CƠ LÀM PHÁT SINH VÀ LÂY LAN DỊCH CÚM GIA CẦM TRÊN ĐỊA BÀN HUYỆN BỐ TRẠCH 51 3.3 KẾT QUẢ TIÊM PHÒNG VẮC XIN THÁNG CUỐI NĂM 2017 TẠI CÁC ĐỊA PHƯƠNG LẤY MẪU GIÁM SÁT TYPEVIRUS CGC 52 3.4 KẾT QUẢ GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH TYPE VIRUS CGC TRÊN ĐỊA BÀN HUYỆN BỐ TRẠCH 54 3.4.1 Kết giám sát lưu hành type virus CGC khu vực giám sát 54 3.4.2 Kết giám sát typevirus cúm gia cầm khu vực giám sát theo thời gian 57 3.4.3 Tỷ lệ lưu hành typevirus cúm gia cầm đối tượng khảo sát 59 3.4.4 Diễn biến lưu hành gen M, H5, N1, N6 năm giám sát địa bàn huyện Bố Trạch 60 3.5 KẾT QUẢ GIẢI MÃ GEN H5 TRÊN ĐÀN GIA CẦM TẠI HUYỆN BỐ TRẠCH 62 3.5.1 Kết giải mã gen H5 gia cầm huyện Bố Trạch 62 3.5.2 Đặc tính amino acid hemaglutinin (HA) chủng phân lập huyện Bố Trạch 64 3.5.3 So sánh mức độ tương đồng thành phần nucleotide gen H5 chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BT1113/2017(H5N6) với chủng A/H5N6 Việt Nam, Trung Quốc Đông Nam Á 64 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 66 4.1 KẾT LUẬN 66 4.2 ĐỀ NGHỊ 66 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC 72 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng việt AVE : Viral elution bufer AVL : Viral lysis buffer AW1 : Wash buffer Bộ NN PTNT : Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn CGC : Cúm gia cầm CT : Chu kì ngưỡng (Cycle of threshold) DNA : Axit deoxiribonucleic DW : Distilled water – nước cất FAO : Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) HA : Hemagglutinin HI : Phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination – Inhibition) HPAI : Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza) LPAI : Cúm gia cầm thể độc lực thấp (Low Pathogenic Avian Influenza) NA : Neuraminidase OIE : Tổ chức dịch tễ giới – Ofice international dé épizooties OIE : Tổ chức Thú Y giới (World Organnisation for Animal Health) RNA : Axit ribonucleic RR : Relative Rick – Chỉ số nguy tương đối RT – PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction WHO : Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Cúm gia cầm H5N1 người giới Bảng 1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm từ năm 2015-2017 Bảng 1.3 Diễn biến tổng đàn gia cầm huyện Bố Trạch giai đoạn 2012 - 2017 35 Bảng 2.1 Các xã khu vực khảo sát 39 Bảng 2.2 Phân bố phiếu điều tra 40 Bảng 2.3 Trình bày số liệu nghiên cứu hồi quy 41 Bảng 2.4 Thành phần master mix 44 Bảng 2.5 Chu trình luân nhiệt phản ứng RT-PCR 45 Bảng 3.1 Diễn biến dịch cúm gia cầm theo thời gian huyện Bố Trạch giai đoạn 2012-2017 47 Bảng 3.2 Phạm vi dịch CGC năm 2012, 2014 49 Bảng 3.3 Bảng phân tích yếu tố nguy làm phát sinh lây lan bệnh cúm gia cầm 51 Bảng 3.4 Kết tiêm phòng vaccine cúm gia cầm tháng cuối năm 2017 53 Bảng 3.5 Kết xét nghiệm mẫu dịch hầu họng khu vực giám sát 55 Bảng 3.6 Kết giám sát gen M, H5, N1, N6 theo thời gian khu vực giám sát 57 Bảng 3.7 Kết xét nghiệm mẫu dịch hầu họng tháng giám sát đối tượng lấy mẫu huyện Bố Trạch 59 Bảng 3.8 Tỷ lệ dương tính gen M, H5, N1, N6 năm giám sát huyện Bố Trạch, Quảng Bình 61 Bảng 3.9: Đặc tính amino acid hemaglutinin (HA) chủng phân lập Bố Trạch năm 2017 64 Bảng 3.10 Danh sách chủng virus cúm A sử dụng để so sánh gen H5 65 ix DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Khu vực có trường hợp nhiễm cúm gia cầm Hình 1.2 Bản đồ trường hợp dương tính H7N9 Hình 1.3 Cúm gia cầm năm 2015 Việt Nam 14 Hình 1.4 Hình thái cấu trúc virus cúm gia cầm 15 Hình 1.5 Các hệ gen virus cúm 19 Hình 1.6 Mối quan hệ lây nhiễm thích ứng lồi vật chủ virus cúm A 23 Hình 1.7 Hình ảnh bệnh tích cúm gia cầm H5N1 25 Hình 1.8 Cơ chế phát huỳnh quang Taqman probe 28 Hình 1.9 Các mạch đơn có đầu đánh dấu với 32P đầu base Guanine bị lấy khỏi mạch khung bị biến đổi 29 Hình 1.10 Phương pháp Enzyme giải trình tự DNA 30 Hình 1.11: Sơ đồ khối máy tự động giải trình tư dùng gel polyacrylamide 32 Hình 3.1 Phân bố ổ dịch cúm gia cầm huyện Bố Trạch theo không gian 50 Hình 3.2: Giản đồ giải trình tự tựđộng đoạn Gen H5 chủng LC376799 (BT13) 63 Hình 3.3: Đánh giá điểm sequence gen HA chủng LC376799 (BT13) Blast 64 Biểu đồ 3.1 Tổng hợp tình hình dịch cúm gia cầm gà vịt năm 2012,2014 48 Biểu đồ 3.2 Kết tiêm phòng vaccine CGC tháng cuối năm 2017 53 Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ nhiễm cúm khu vực giám sát 56 Biểu đồ 3.4 Biến động lưu hành virus cúm gia cầm khu vực giám sát 58 Biểu đồ 3.5 Tỷ lệ lưu hành virus cúm gia cầm đàn gà, vịt 60 ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Chăn nuôi ngành thiếu nông nghiệp nước ta Trong nhiều năm qua, ngành chăn nuôi phát triển đa dạng với nhiều hình thức đối tượng khác góp phần tăng thu nhập cho bà nơng dân Một số khơng thể không nhắc tới chăn nuôi gia cầm, với lợi vốn đầu tư thấp, chu kì sản xuất ngắn, tạo sản phẩm thực phẩm giàu dinh dưỡng phù hợp với xu tiêu dùng… Ngành chăn nuôi gia cầm nước ta ngày phát triển, chăn nuôi nhỏ lẻ phân tán chuyển dịch sang chăn nuôi tập trung theo mơ hình trang trại, gia trại ứng dụng công nghệ, khoa học kỹ thuật, tăng hiệu kinh tế Tại thời điểm 10/2016 đàn gia cầm nước có 361,7 triệu tăng 19,8 triệu con, sản lượng thịt gia cầm giết bán đạt 961,6 nghìn tấn, tăng 5,9 % (Niên giám thống kê, 2016) Huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình địa phương có tổng đàn gia súc, gia cầm đứng thứ hai tỉnh, chăn ni gia cầm phát triển đa dạng phong phú chủng loại, với tổng đàn gia cầm gần 800 nghìn Mặc dù, quy mơ chăn ni chưa lớn, hình thức chăn ni chủ yếu nhỏ lẻ phân tán (gia trại hộ chăn nuôi nhỏ lẻ), chăn nuôi gia cầm chiếm vị trí quan trọng, góp phần ổn định sống phát triển kinh tế cho người chăn nuôi khu vực nông thôn Theo số liệu Cục thống kê tỉnh Quảng Bình, tỷ trọng chăn nuôi cuối năm 2016 địa bàn huyện chiếm 21,8% cấu giá trị sản xuất ngành nông nghiệp (Cục Thống kê Quảng Bình, 2017) Tuy nhiên năm gần đây, ngành chăn ni nói chung ngành chăn ni gia cầm nói riêng gặp khơng khó khăn Nhiều dịch bệnh xảy buộc phải tiêu hủy toàn đàn gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi kinh tế nước nhà Nhiều dịch bệnh khơng xảy vật ni mà cịn lây sang người gây tử vong Một số bệnh Cúm gia cầm (CGC), bệnh truyền nhiễm cấp tính virus cúm type A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây cho lồi lơng vũ gà, vịt, ngan, ngỗng, đà điểu, loài chim, số động vật có vú người (Ito et al., 1998) Bệnh tổ chức dịch tễ giới OIE xếp vào danh mục bốn bệnh nguy hiểm tất quốc gia đặc biệt quan để khống chế, bao hồm bệnh Lở mồm long móng, bệnh Dịch tả heo cổ điển, bệnh Niu-cát-xơn (Capua et al., 2002) Bệnh có khả lây lan nhanh mạnh Thời gian ủ bệnh trung bình từ vài đến ngày Triệu chứng lâm sàng biểu nhiều dạng khác nhau, có dạng tỷ lệ chết cao, có dạng khơng biểu triệu chứng tỷ lệ chết lên đến 100% số gia cầm mắc bệnh (Horimoto, 2001) 65 hàng gen (GenBank), sau sử dụng chương trình (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Kết thể bảng 3.10 BLAST Bảng 3.10 Danh sách chủng virus cúm A sử dụng để so sánh gen H5 TT Ký hiệu chủng so sánh Số đăng Năm Tỷ lệ (% Loài ký Subtype phân Nguồn gốc đồng mắc ngân hàng lập nucleotide) gen A/Dk/Vietnam/QuangBinh/ Bố TrạchLC376799 Quảng Bình Vịt H5N6 2017 Gà H5N6 2013 Trung Quốc KT762446 99 Chim cút H5N6 2015 Trung Quốc GQ149235 91 Vịt H5N6 2014 Việt Nam LC028331 98 A/dk/Nha Vịt Trang/75c131/2014(H5N6) H5N6 2014 Nha Trang LC050627 92 Vịt H5N1 2011 Quảng Ngãi JQ898146 89 Vịt H5N1 2011 BT1113 - A/ck/Dongguan/2690/ 2013- H5N6 A/feline/Guangdong/1/ 2015(H5N6) A/dk/Vietnam/LBM758/ 2014(H5N6) A/dk/Quangngai/1037/ 2011(H5N1) A/dk/Vietnam/OIE7 Việt Nam AB700631 90 2533/2011 Qua kết bảng 3.10 cho thấy so sánh chủng phân lập huyện Bố Trạch với chủng virus cúm phân lập Việt Nam số nước Châu Á mức độ tương đồng từ 89-99% Trong đó, chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BT1113 liên quan di truyền chặt chẽ với virus A/ck/Dongguan/2690/2013-H5N6 A/duck/Vietnam/ LBM758/2014(H5N6) với 99% nhận dạng 98% cấp độ nucleotide tương ứng, cho thấy chúng nguồn gốc tiến hóa, kết phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Bích Nga (2006) 66 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu đề tài, rút số kết luận sau: - Trong giai đoạn 2012-2017 có năm khơng xảy dịch (năm 2013, 2015, 2016 2017), năm có số ổ dịch cao năm 2012, đối tượng mắc bệnh chủ yếu vịt - Các yếu tố nguy làm phát sinh lây lan dịch cúm gia cầm gồm: Nuôi thả rông gia cầm (RR = 1,869); không vệ sinh dụng cụ chuồng trại (RR = 1,083); Tiếp xúc với chim trời (RR = 1,636); khơng tiêm vaccine phịng bệnh cúm gia cầm (RR = 2,510); - Tỷ lệ dương tính với cúm A 33,33 %, với H5N6 8,33 % Khu vực có tỷ lệ dương tính với virus cúm A/ H5N6 cao khu vực II (16,67%) - Tỷ lệ dương tính với gen M cao tháng (66,67%) không lưu hành tháng (0%), tỷ lệ dương tính với virus cúm A/H5N6 cao tháng 11,12,01 (16,67%) không lưu hành tháng 8,9,10 (0%) - Toàn chuỗi gen HA chủng cúm A/H5N6 phân lập từ vịt huyện Bố Trạch (A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BT1113/2017(H5N6)) có độ dài 1704 bp giải trình tự, xác định gen H5 virus cúm A/H5N6, cấu trúc có đầy đủ amino acid (-RRKK-) vị trí cắt protease, có mức độ tương đồng tương đối cao aminoacid từ 89-99% chuỗi gen H5 so sánh với chủng phân lập Việt Nam số nước châu Á 4.2 ĐỀ NGHỊ - Định kỳ tổ chức lấy mẫu giám sát lưu hành virus cúm A/H5N6 để dự báo sớm tình hình dịch bệnh - Hướng dẫn người nuôi thực biện pháp phịng bệnh, hạn chế nguy chuyển đổi phương thức chăn nuôi thả đồng qua thả vườn, nuôi nhốt Thường xuyên định kỳ tiêu độc khử trùng mơi trường, dụng cụ chăn ni; tiêm phịng vaccine cúm gia cầm cho gia súc năm hai đợt; hạn chế gia cầm tiếp xúc với chim trời Nghiên cứu yếu tố nguy phát sinh dịch cúm gia cầm H5N6 với quy mô rộng số mẫu lớn để có đánh giá xác - Lựa chọn vaccine cúm gia cầm phù hợp địa bàn huyện Bố Trạch, nhằm đạt hiệu bảo hộ cao 67 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kỳ (2004), Bệnh Cúm gia cầm: Lưu hành bệnh, chẩn đoán kiểm sốt dịch bệnh, tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 11 (3), tr 69 [2] Bộ Nông nghiệp PTNT (2007), Cẩm nang phòng chống bệnh Cúm gia cầm thể độc lực cao (H5N1), Nhà XB nông nghiệp, Hà Nội [3] Bộ Nông nghiệp phát triển nơng thơn, tiêu chuẩn nghành 10TCN: Quy trình chẩn đốn bệnh cúm gia cầm [5] Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn, QCVN 01-83:2001/QCBNNPTNT Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia bệnh động vật- yêu cầu chung lấy mẫu bệnh phẩm, bảo quản vậm chuyển Bio-Rad Laboratories, Inc Real time PCR- Kỹ thuật ứng dụng [6] Cục Thống kê Quảng Bình (2007), Số liệu thống kê kinh tế xã hội Quảng Bình [4] 2012-2017 (tóm tắt), Quảng Bình [7] Cục Thú y, Báo cáo giao ban trực tuyến Cúm gia cầm 18.2.2014 Chi cục Chăn nuôi Thú y Quảng Bình (2016), Báo cáo kết thực giám sát chủ động bệnh Cúm gia cầm năm 2016, Quảng Bình [9] Chi cục Chăn ni Thú y Quảng Bình (2015), Báo cáo kết thực giám sát chủ động bệnh Cúm gia cầm năm 2015, Quảng Bình [10] Chi cục Thú y Quảng Bình (2013), Báo cáo công tác Thú y năm 2012, phương hướng nhiệm vụ năm 2013, Quảng Bình [11] Chi cục Thú y Quảng Bình (2015), Báo cáo cơng tác Thú y năm 2014, phương hướng nhiệm vụ năm 2015, Quảng Bình [12] Cục thú y (2007), Sổ tay chẩn đốn Cúm gia cầm [8] [13] Cục Thú y (2018), Báo cáo kết cơng tác phịng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm, thủy sản năm 2017 triển khai kế hoạch năm 2018, Hà Nội [14] Cục thú y (2004), “Tài liệu tập huấn phương pháp chẩn đoán Cúm gia cầm” [15] Cục thú y, phòng dịch tễ “Báo cáo tổng kết cơng tác phịng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm năm 2014 phương hướng năm 2015”, tr – [16] Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh, “Bệnh Cúm gia cầm biện pháp phòng chống’’, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội [17] Nguyễn Tiến Dũng (2004), Nguồn gốc virus Cúm gia cầm H5N1 Việt Nam năm 2003/2004, tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 11(3), tr – 14 68 [18] Nguyễn Tiến Dũng (2006), Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài cấp nhà nước: Nghiên cứu lưu hành virus cúm Việt Nam chế tạo chế phẩm chẩn đoán nhanh, Hà Nội, tr 1-79 [19] Trần Hùng (2014), Khảo sát lưu hành virus cúm A/H5N1 địa bàn Hà Tĩnh tháng đầu năm 2014, Luận văn Thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, Khoa Thú y – Đại Học Nông Lâm Huế [20] Phạm Sỹ Lăng (2004), Diễn biến Cúm gia cầm Châu Á hoạt động phòng chống bệnh, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, 11(3), tr 87 - 93 [21] Lê Văn Năm (2004), Bệnh Cúm gia cầm, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 11, 01, tr 81 – 86 [22] Nguyễn Bích Nga (2006), Phân lập, lưu giữ nghiên cứu đặc tính phân tử gen HA (H5) NA (N1) số chủng virus cúm A, subtype H5 gia cầm Việt Nam Luận án Thạc sĩ khoa học Nông nghiệp Viện khoa học sống Đại Học Thái Nguyên [23] Đào Ngọc Phong (2001), Vệ sinh môi trường dịch tễ, Trường Đại học Y Hà Nội Nhà xuất y học [24] Hãng Qiagen, Sổ tay Qiagen one step mini kit [25] Tô Long Thành (2004), Thông tin cập nhập tái xuất bệnh Cúm gia cầm nước Châu Á, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, 11(4), tr.87 – 93 [26] Nguyễn Ngọc Tiến (2013), Tình hình dịch cúm gia cầm giai đoạn 2008 - 2012 biện pháp phòng chống, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XX, tr 01, 82 90 [27] Tổ chức y tế giới (2004), “Hướng dẫn phòng chống lây nhiễm bệnh Cúm gà”, Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội [28] Tổng cục thống kê (2016), Niên giám thống kê năm 2016 (tóm tắt), Nhà XB thống kê, tr 423 Tiếng anh [29] Alexander D.J.,(1996) Orthomyxovirus Infections In Viral Infections of ertebrates, volume 3: Viral Infections of birds Mc Ferran J.B.& McNulty M.S., eds Horzinek M.C., Series editor Elserviers, Amsterdam, the Netherlands, pp 287-316 [30] Alexander DJ., (2007), An overview of the epidemiology of avian influenza Vaccine 25 (30), pp 5637 – 5639 69 [31] Bosch F.X., Orlich M., klenk H D., Rott R., (1979), “The structure of the hemagglutinin, a deteminant for the pathogenicity of influenza viruses” Virology (95), pp.197-207 [32] Buckle White., Muphy B.F.,(1998), “Nucleotide sequence anylasis of the nucleoprotein gen of an avian and a human influenza virus strain indentifies two classes of nucleoproteins”, Virology (155), pp.345-355 [33] Capua I., Teregino C., Cattoli G., Mutinelli F., Rodriguuez J.F.,(2002), Development of a DIVA (Diferentianing Infected from Vccinated Animals) strategy using a vaccien containing a heterologus neuramidase for the cotrol of avian influenza Avian Pathol 32: pp.47-55 [34] Capua I., Cattoli G.,(2007), “Diagnosing avian influenza infections in vaccinated populations using DIVA systems, AI vaccine conference: Vaccination: a tool for the control of avian influenza”, 20 - 22 March 2007, Verona, Italy [35] Castrucci M R., Kawaoka Y.,(1993), “Biologic importance of neuramidase stlak length influenza A virus”, J.Viriol (67), pp.759-764 [36] De Wit E., Fouchier RA., (2008) "Emerging influenza" J Clin Virol, 41 (1), 16 [37] Horimoto T., Kawaoka Y.,(1995), “Direct revese transcriptase PCR to determine virulence potential of influenza A viruses in birds”, J Clin Microbiol, 33 (3), pp.748-751 [38] Horimoto T., Kawaoka Y., (2001), “Pandemic threat posed by avian influenza viruses” Clind Microbiol Rev, 14(1), pp.129-149 [39] Ito T., Couceiro J.N., Kelm S., Webter R.G., Kawaoka Y., (1998), “Molecular basic for the genration in pigs of influenza A viruses with pandermic potential”, J Viriol 72, pp.7367-7373 [40] Kawaoka Y., (1991), “Difference in receptor spectificity among influenza A viruses from different species of animals”, J Vet Med Sci 53, pp.357-358 [41] Lu X., Tumpey T.M., Katz J.M., (1999), “ A mouse model for the evalution of pathogensis and immunity to influenza A (H5N1) viruses isolate from human”, J.Viriol, 73, pp.5903-5911 [42] Luong G., Palese P., (1992), “Gentic anylaysis of influenza virus”, Curr Opinion Gen Develop 2, pp.77-81 [43] Muphy B.R., Webter R.G.,(1996),“Orthomyxoviruses”, Lippincott-Raven Pblishers, Philadenphia, Pa 70 [44] Murphy B R., Webter R.G., (1996), Orthomyxoviruses In Fields B.N, Knipe D.M, Howley P.M (eds), Fields Virology, 3rd ed Lippincott - Raven pblishers, Philadenphia, pp 1397 - 1445 [45] International des Epizoties (OIE) (2017), Highly Pathogenic Avian Influenza: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 5th ed OIE, Paris (Chapter 2.1.14) [46] Seo S., webter R.G., (2001), “Cross-relative cell-mediated immunity and protection of chickens from lethal H5N1 influenza virus infection in the HongKong poultry markets”, J Viriol, 75, pp.2516-2525 [47] Suares D L., Perdue M.L., Swayne D.E., (1998), “Comparisons of hightly virulent H5N1 influenza A viruses isolated from humans and chickens from Hong Kong”, J Viriol 72, pp.6678-6688 [48] Very M., Orlich M., Adle S., Klenk H.D., Rott R., Garten W., (1992), “Hemagglutinin activation of pathogenic avian influenza viruses of serotype H7 requires the protease recognition motif R-X-K/R-R”, Virology 188, pp.408-413 [49] Webster RG., (1998), Influenza: an emerging disease, Emerg Infect Dis,4, pp.436-441 [50] WHO/GIPSN: The World Health Organizatino Global Influenza Program Surveillance Network (2007), Evolution of H5N1 Avian Influenza Viruses in Asia Trang web [1] OIE – World Organization for Animal Health, Influenza A Cleavage Sites version 31 January 2018 online available February 10st 2018: [2] http://www.offlu.net/fileadmin/home/en/resource-centre/pdf/Influenza_A_Cleavage_Sites.pdf [3] Avian influenza – Highly Pathogenic (HPAI), Fowl Plague online available November st 2017: http://www.thepoultrysite.com/diseas ai-fowl-plague [4] Cục y tế dự phòng (2015) Khuyến cáo phòng bệnh cúm A/H7N9 Bộ Y tế, truy cập ngày 15/11/2015 website: http://vncdc.gov.vn/vi/khuyen-cao-phongchong-dich-benh/276/khuyen-cao-phong-benh-cum-a-h7n9 [5] Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO, online available November st 2017: [6] http://www.who.int/csr/disease/avian 0/en/index.htm [7] Nguyễn Lan Anh (2005), Hội nghị quốc tế lần thứ hai Cúm gia cầm Châu Á’ Truy cập 10/1/2018 website: 71 [8] http://www.hochiminhcity.gov.vn/left 2/24-02-2005.1 [9] Nguyễn Tuấn Anh (2006), dịch Cúm gia cầm hai năm qua – nguyên nhân, tính chất dịch tồn truy cập ngày 10 tháng năm 2018 website: http://www.cucchannuoi.gov.vn.vn/Web ID=1&NewsID=86 72 PHỤ LỤC Một số hình ảnh phản ứng RT-PCR Hình 1: Máy RT-PCR smart cycle Hình 2: Bộ kít tách chiết Hình 3: Mẫu vận chuyển thùng đá Hình 4: Mẫu xét nghiệm 73 Hình 5: Xử lý mẫu Hình 7: Lấy mẫu hầu họng Hình 6: Thao tác tách chiết ARN tổng số Hình 8: Thao tác mix mẫu 74 Hình 9: Hình ảnh giá trị CT Hình 10: Kết PCR: primer 1:900bp Hình 11: Kết PCR: primer 2:917bp 75 Trình tự aminoacid chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BT1113/2017(H5N6) "MEKIVLLLAVVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTH AQDILEKTHNGRLCDLNGVKPLILKDCSVAGWLLGNPMCDEFIRVPEWSYIVERTNPA NDLCYPGNLNDYEELKHLLSRINHFEKTLIIPKSSWPNHETSSGVSAACPYQGVPSFF RNVVWLTKKNDAYPTIKMSYNNTNGEDLLILWGIHHSNNEAEQTNLYKNPTTYVSVGT STLNQRLVPKIATRSQVNGQQGRMDFFWTILKPNDAIHFESNGNFIAPEYAYKIVKKG DSTIMKSEMEYGHCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLR NSPLRERRRKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADRESTQKAIDG VTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENE RTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYS EEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIIVAGLSLWMCSNGSLQCRIC I" Trình tự nucleotide chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BT1113/2017(H5N6) ORIGIN atggagaaaa tagtgcttct tcttgcagtg gttagccttg ttaaaagtga tcagatttgc 61 attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca cgataatgga aaaaaacgtc 121 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaggct ctgcgatctg 181 aatggagtga aacctctgat tttaaaggat tgtagtgtag ctggatggct tcttggaaac 241 ccaatgtgcg acgaattcat cagagtgccg gaatggtctt acatagtgga gaggactaac 301 ccagccaatg acctctgtta cccagggaac ctcaatgact atgaagaact gaaacaccta 361 ttgagcagaa taaatcattt tgagaagact ctgatcatcc ccaagagttc ttggcccaat 421 catgaaacat catcaggggt gagcgcagca tgcccatacc agggagtgcc ctcctttttc 481 agaaatgtgg tatggcttac caagaagaac gatgcatacc caacaataaa gatgagctac 541 aataatacca atggggaaga tcttttgata ctgtggggga ttcatcattc caacaatgaa 601 gcagagcaga caaatctcta taaaaaccca accacctatg tttccgttgg gacatcaaca 661 ttaaaccaga gattggtgcc aaaaatagct actagatccc aagtaaacgg gcaacaagga 721 agaatggatt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatccactt tgagagtaat 781 ggaaatttta ttgctccaga atatgcatac aaaatagtca agaaagggga ctcaacaatt 841 atgaaaagtg aaatggaata tggccactgc aacaccaaat gtcaaactcc aataggggcg 901 ataaactcta gtatgccatt ccacaatata caccctctca ccatcgggga gtgccccaaa 961 tacgtgaaat caaacaaatt agtccttgcg actggactca gaaatagtcc tttaagagaa 1021 agaagaagaa aaagaggact atttggagct atagcagggt tcatagaggg aggatggcaa 1081 ggaatggtag atggttggta tgggtaccac catagcaatg aacaggggag tgggtacgct 1141 gcagacagag aatccaccca aaaggcaata gatggagtta ccaataaggt caactcgata 1201 atcgacaaaa tgaacactca atttgaggcc gttgggaggg agtttaataa cttagaacgg 1261 agaatagaga atttaaataa gaaaatggaa gacggattcc tagatgtctg gacttacaat 1321 gctgaacttt tagttctcat ggaaaatgag agaactttag attttcacga ttcaaatgta 1381 aagaaccttt atgacaaagt ccgactacag cttagggata atgcaaagga gctaggtaat 1441 ggttgtttcg agttctatca taaatgtgat aatgaatgta tggaaagtgt aagaaatggg 1501 acgtatgact atccccagta ttcagaagaa gcaagattaa aaagggaaga aataagcgga 1561 gtgaaattgg aatcaatagg aacttaccaa atactgtcaa tttattcaac agtggcgagt 1621 tccctagcac tggcaatcat tgtggctggt ctatctttat ggatgtgctc caatgggtcg 1681 ttacaatgca gaatttgcat ttaa // 76 PHIẾU THU THẬP THÔNG TIN DỊCH CÚM GIA CẦM THÔNG TIN CHUNG SDT: Họ tên chủ hộ chăn nuôi Huyện Địa Xã Thôn SDT: Họ tên người điều tra Đơn vị công tác X: Tọa độ GPS Y: Số lượng loại gia cầm có gia đình Loại gà Số lượng Loại vịt/ngan Gà Vịt /ngan Gà nuôi thịt Vịt/ngan nuôi thịt Gà sinh sản Vịt/ngan sinh sản Số lượng Phương thức chăn nuôi Chăn nuôi nhỏ lẻ, thả vườn  Ngan, vịt thả đồng  Chăn nuôi bán công nghiệp  Ngan, vịt nuôi nhốt  Chăn nuôi công nghiệp  Chăn nuôi chung với lợn, chó Có  Khơng  Thức ăn chăn ni Có  Khơng   Thức ăn cơng nghiệp Thức ăn tự chế  Thức ăn bán công nghiệp  Gia cầm tự kiếm ăn  Bổ sung kháng sinh vào thức ăn, nước uống KOLERIDIN  COLIQUIN  TYLANVET ENROVE  DOXICIP  AMPICOL  GENTADOX  Nguồn nước uống Nước máy  Nước giếng  Nước mưa  Sông suối  Nước ao, hồ Nguồn giống Tự sản xuất  Mua nơi khác có nguồn gốc  Mua nơi khác không nguồn gốc  Địa điểm chăn nuôi A Gần khu dân cư 10m- 50m  500m  1km  >1km  B Gần đường quốc lộ 10m- 50m  500m  1km  >1km  C Gần chợ buôn bán gia cầm sống 10m- 50m  500m  1km  >1km  D Gần địa điểm giết mổ 10m- 50m  500m  1km  >1km  77 E Gần ao, hồ, kênh, mương 10m- 50m  500m  1km  >1km  F Gần trang trại hàng xóm 10m- 50m  500m  1km  >1km  78 Vệ sinh chuồng trại Hàng ngày  2-3 lần/tuần  Hàng tuần  Hàng tháng  Hàng tuần  Hàng tháng  10 Vệ sinh dụng cụ, máng ăn uống cho gia cầm Hàng ngày  2-3 lần/tuần  11 Khử trùng, tiêu độc lần/tuần  Hàng tuần  Hàng tháng  Ba 3tháng/lần  Sáu tháng/lần  12 Xử lý chất thải chăn nuôi Ủ Bio gas  Sử dụng chế phẩm SH  Xử lý chất hóa học  Xả thẳng mơi trường  Có  Không  14 Người, xe cộ vào trang trại có khử trùng khơng? Có  Khơng  15 Nuôi nhốt chung nhiều lứa tuổi gà chuồng ni Có  Khơng  16 Giết mổ gia cầm khu vực chăn ni Có  Khơng  13 Gia cầm chăn nuôi thường xuyên tiếp xúc với chim trời Nói rõ lồi chim trời:…………………… Có  Khơng  18 Khu vực chứa thức ăn cho gia cầm mối, chuột, bọ dễ dàng xâm nhập Có  Khơng  17 Trước nhập đàn có để trống chuồng ni 14 ngày 19 Sử dụng đệm lót ẩm ướt Có  Khơng  20 Các loại vắc xin tiêm Có  Khơng  Nhược Vơ độc hoạt Tên bệnh Nhược Vô độc hoạt Tên bệnh Tên bệnh Cúm gia cầm Tụ huyết trùng Gumboro Newcastle Hội chứng giảm đẻ Đậu gà Marek Phù đầu gà Nhược độc Vô hoạt 21.Thời điểm tiêm phòng Cúm gia cầm Trước có dịch  Trong có dịch  Sau có dịch  22.Tỷ lệ tiêm phịng Cúm gia cầm A 100%  B 75%  23 Năm có dịch 2010  24 Tháng có dịch 1 2 3 C 50%  2011 4  2012  D Không tiêm  2013 5 6 7 8 9  2014  10 11 12 25 Thời tiết có dịch Nóng  Lạnh  Ẩm  Nóng ẩm  Mưa  Khơ  2015  79 26 Trước có dịch có người lạ vào thăm chuồng trại khơng? Có  Không  Không biết  27 Xử lý gia cầm có dịch Khai báo với quyền  Bán  Chữa trị  Mổ thịt  Vứt bỏ  28 Tiêm phịng số gia cầm chưa có triệu chứng? Có  Khơng  29 Lấy mẫu giám sát Có  Khơng  Chơn, đốt  30 Tổng số gia cầm có dịch Năm Tổng số gia cầm có dịch (gà, vịt, ngan, ngỗng) Tổng số gia cầm ốm, chết Tổng số gia cầm bị tiêu hủy (gà, vịt, ngan, ngỗng) (gà, vịt, ngan, ngỗng) 2013 2014 2015 2016 2017 Hướng chuồng: Đ  N T  B ĐN  ĐB  TN  TB  31 Loại chủ đạo khu vực chăn nuôi: (Nêu loại nhiều theo thứ tự giảm dần theo) Cây lấy gỗ Cây ăn Cây lương thực Cây hoa màu Cây thực phẩm Ý kiến khác:……………………………… Người vấn Hộ nông dân Xác nhận địa phương ... Xuất phát từ thực tế trên, thực đề tài: ? ?Giám sát lưu hành type virus khảo sát yếu tố nguy phát sinh dịch cúm gia cầm địa bàn huyện Bố Trạch tỉnh Quảng Bình? ?? Mục tiêu đề tài Xác định lưu hành virus. .. cúm type A, subtype H5N6 phân lập từ loài mắc bệnh khác Việt Nam, thực đề tài: ? ?Giám sát lưu hành type virus khảo sát yếu tố nguy phát sinh dịch cúm gia cầm địa bàn huyện Bố Trạch tỉnh Quảng Bình? ??... Giám sát lưu hành type virus khảo sát yếu tố nguy phát sinh dịch cúm gia cầm địa bàn huyện Bố Trạch tỉnh Quảng Bình Tác giả luận văn: Nguy? ??n Thị Vân Anh Khóa: TY K22 Người hướng dẫn: PGS.TS Nguy? ??n