Đề tài nghiên cứu “Chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae trên mẫu phổi heo được giết mổ tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong” được tiến hành tại Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, thời gian từ 01042007 đến 30102007. Kết quả thu được: Mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ do M. hyopneumoniae được đánh giá dựa trên bệnh tích đại thể theo công thức của Christensen (1999) và Rice (2000), phân lập MH, và kỹ thuật PCR. Tỷ lệ phổi có bệnh tích đặc trưng do M. hyopneumoniae trên heo thịt giết mổ là 63,55%. Tỷ lệ hư hại trung bình của phổi phải là 41,37%, phổi trái là 38,39%. Điểm trung bình bệnh tích nghi ngờ do MH trên phổi phải là 2,2 điểm, phổi trái là 2,09 điểm. Tỷ lệ hư hại của phổi nghi nhiễm MH ở mức điểm 2 (25 – 50%) cao nhất là 48,06 %, ở mức điểm 4 (>75%) thấp nhất với 6,98%. Tỷ lệ phân lập MH trên thạch Friis cho kết quả dương tính là 18,18%. Kỹ thuật PCR trên phổi cho kết quả dương tính là 13,64%
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KH ĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CHẨN ĐOÁN MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN MẪU PHỔI HEO ĐƯỢC GIẾT MỔ TẠI XÍ NGHIỆP CHẾ BIẾN THỰC PHẨM NAM PHONG Họ tên sinh viên: NGUYỄN THỊ KHÁNH MINH Ngành: Thú y Niên Khóa: 2002-2007 Tháng 11/2007 CHẨN ĐỐN MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN MẪU PHỔI HEO ĐƯỢC GIẾT MỔ TẠI XÍ NGHIỆP CHẾ BIẾN THỰC PHẨM NAM PHONG Tác giả NGUYỄN THỊ KHÁNH MINH Khóa luận đệ trình đề để đáp ứng yêu cầu cấp bác sỹ ngành Thú y Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Phước Ninh BSTY Lâm Thị Tú Anh BSTY Đỗ Tiến Duy Tháng 11 năm 2007 i LỜI CẢM TẠ Con xin cảm ơn ba, mẹ hy sinh nhiều, cổ vũ, động viên để ngày hôm Biết ơn cô Nguyễn Thị Phước Ninh, cô Lâm Thị Tú Anh, thầy Đỗ Tiến Duy, cô Nguyễn Thị Thanh Trúc tận tình hướng dẫn giúp đỡ em hồn thành khóa luận tốt nghiệp thật tốt Xin cảm ơn Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm tồn thể q thầy khoa Chăn Ni – Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM tận tình dạy, truyền đạt kiến thức quý báu giúp đỡ em suốt trình học trường Xin cảm ơn anh chị Bệnh Viện Thú Y, Ban Quản Lý Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, ban ngành lãnh đạo Ban Quản Lý Thú Y Tại Xí Nghiệp Chế Biến Thực Phẩm Nam Phong TP HCM tạo thuận lợi cho em hồn thành khóa luận Cảm ơn bạn giúp đỡ, động viên, chia sẻ vui buồn suốt thời gian thực tập tốt nghiệp Sinh viên thực Nguyễn Thị Khánh Minh ii TÓM TẮT KHĨA LUẬN Đề tài nghiên cứu “Chẩn đốn Mycoplasma hyopneumoniae mẫu phổi heo giết mổ xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong” tiến hành Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM, thời gian từ 01/04/2007 đến 30/10/2007 Kết thu được: Mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ M hyopneumoniae đánh giá dựa bệnh tích đại thể theo cơng thức Christensen (1999) Rice (2000), phân lập MH, kỹ thuật PCR Tỷ lệ phổi có bệnh tích đặc trưng M hyopneumoniae heo thịt giết mổ 63,55% Tỷ lệ hư hại trung bình phổi phải 41,37%, phổi trái 38,39% Điểm trung bình bệnh tích nghi ngờ MH phổi phải 2,2 điểm, phổi trái 2,09 điểm Tỷ lệ hư hại phổi nghi nhiễm MH mức điểm (25 – 50%) cao 48,06 %, mức điểm (>75%) thấp với 6,98% Tỷ lệ phân lập MH thạch Friis cho kết dương tính 18,18% Kỹ thuật PCR phổi cho kết dương tính 13,64% iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ii TÓM TẮT KHÓA LUẬN iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ VÀ CÁC HÌNH viii Chương MỞ ĐẦU .2 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Chương 2.CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm 2.1.1 Lịch sử phân bố địa lý 2.1.2 Phân loại 2.2 Đặc điểm Mycoplasma hyopneumoniae 2.2.1 Môi trường nuôi cấy 2.2.2 Sức đề kháng 2.2.3 Truyền nhiễm học 2.2.4 Triệu chứng lâm sàng 2.2.5 Bệnh tích 2.2.6 Chẩn đoán 2.2.7 Phòng điều trị bệnh .10 2.3 Cơ sở lý luận cho chẩn đoán M hyopneumoniae dương tính 12 2.3.1 Đánh giá bệnh tích hư hại nghi ngờ Mycoplasma hyopneumoniae 12 2.3.2 Môi trường nuôi cấy 12 2.3.3 Phát M hyopneumoniae kỹ thuật PCR .13 2.4 Sơ lược số nghiên cứu chẩn đoán M hyopneumoniae 16 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .18 3.1 Thời gian địa điểm .18 iv 3.1.1 Thời gian 18 3.1.2 Địa điểm 18 3.2 Vật liệu dụng cụ thí nghiệm 18 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 18 3.2.2 Dụng cụ thu thập mẫu 18 3.2.3 Dụng cụ xử lý phân lập phịng thí nghiệm .18 3.3 Đối tượng nghiên cứu .19 3.4 Nội dung .19 3.5 Phương pháp tiến hành 19 3.5.1 Đánh giá mức độ hư hại có bệnh tích đại thể nghi ngờ MH 19 3.5.2 Phân lập MH 20 3.5.3 Kỹ thuật PCR để xác định MH 21 3.6 Các cơng thức tính 23 3.7 Tính tốn kết 24 Chương KẾT QUẢ VÀTHẢO LUẬN 25 4.1 Kết đánh giá mức độ hư hại phổi nghi ngờ Mycoplasma hyopneumoniae 25 4.1.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ M hyopneumoniae 25 4.1.2 Kết đánh giá bệnh tích đại thể phổi nghi nhiễm MH 26 4.2 Kết phân lập MH môi trường thạch Friis từ mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ .31 4.3 Kết xác định MH kỹ thuật PCR mẫu phổi 33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 Kết luận .36 5.2 Đề nghị .36 TÀI LIỆU THAM KHẢO .37 v DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT BHI :Brain Heart Infusion broth Bp :Base pair CF :Complement fixation DNA :Deoxyribonucleic acid dNTP :Deoxyribonucleic triphosphate ELISA :Enzyme Linked Immunosorbent Assay MH :Mycoplasma hyopneumoniae MPS :Mycoplasmal pneumoniae of swine OD :Opitical Density PBS :Phosphate bufferred saline PCR :Polymerase Chain Reaction PPLO :Pleuro-Pneumoniae-Like-Organism RNA :Ribonucleic acid SDS :Sodium Dodecyl Sulfat SPF :Speccific Pathogen Free T :Thymine Taq :Thermus aquiticus TBE :Tris borate EDTA TE :Tris EDTA UI :Unit international UV :Utral violet µl :Microlit vi DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ CÁC BẢNG Sơ đồ 3.1 Sơ đồ bước thực thí nghiệm 19 Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập Mycoplasma hyopneumoniae 21 Bảng 3.1 Bố trí lấy mẫu 19 Bảng 4.1: Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ MH 25 Bảng 4.2 Tỷ lệ hư hại phổi nghi ngờ MH .26 Bảng 4.3 Tỷ lệ hư hại phổi nghi nhiễm M hyopneumoniae mức độ 28 Bảng 4.4 Điểm trung bình bệnh tích nghi ngờ M hyopneumoniae phổi 29 Bảng 4.6 Kết xác định MH mẫu phổi kỹ thuật PCR .33 vii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ VÀ CÁC HÌNH Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ MH 25 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ hư hại trung bình phổi 27 Hình 2.1 Nguyên tắc phản ứng PCR 15 Hình 4.1 Phổi có bệnh tích nhục hóa thùy tim (định hướng MH) 30 Hình 4.2 Phổi có bệnh tích nhục hóa (định hướng MH) .30 Hình 4.3 Khuẩn lạc MH sau ngày nuôi cấy 32 Hình 4.4 Kết chạy PCR mẫu thạch 33 Hình 4.5 Kết chạy PCR mẫu phổi 35 viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm hay bệnh suyễn heo Mycoplasma hyopneumoniae (MH) gây thường thể mãn tính với đặc điểm gây viêm phế quản phổi tiến triển chậm heo Tỷ lệ heo mắc bệnh cao từ 50 – 100% Tuy nhiên, tỷ lệ chết thường thấp khoảng 16% không ghép với bệnh truyền nhiễm khác Các triệu chứng bệnh thường không rõ ràng xảy thầm lặng (Trần Thanh Phong, 1996) Thiệt hại MH gây lớn Heo mắc bệnh làm tăng số tiêu tốn thức ăn khoảng 10% ( Muirhead, 1989; trích dẫn Quách Tuyết Anh, 2003), kéo dài thời gian nuôi thịt, tăng tử số đàn, tốn kháng sinh điều trị, thuốc sát trùng, gây ảnh hưởng đến suất phẩm chất quầy thịt heo bệnh, gây thiệt hại không nhỏ cho người chăn ni Hiện nay, có nhiều phương pháp chẩn đốn MH dựa vào đánh giá bệnh tích đại thể, vi thể, kỹ thuật PCR, kỹ thuật ELISA, phản ứng kết hợp bổ thể (CF)…nhưng phương pháp có ưu nhược điểm riêng độ nhạy, độ đặc hiệu, độ xác… Trên thực tế việc phân lập MH gặp nhiều khó khăn MH chậm tăng trưởng làm nhiều thời gian, địi hỏi mơi trường giàu dưỡng chất dễ bị vấy nhiễm tác nhân khác (Quinn, 1994) Tuy nhiên, việc phân lập MH xem tiêu chuẩn vàng Mặt khác, ứng dụng kỹ thuật PCR cho việc xác định MH nhanh hiệu Theo Calsamiglia (1998), kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) phương pháp chẩn đốn hồn hảo thích hợp để phát MH, phương pháp cho kết nhanh chóng, đặc hiệu, khơng phụ thuộc sống hay chết mầm bệnh (trích dẫn Đỗ Tiến Duy, 2004) Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết đánh giá mức độ hư hại phổi nghi ngờ Mycoplasma hyopneumoniae 4.1.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ M hyopneumoniae Tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong, quan sát bệnh tích 203 mẫu phổi heo giết mổ Kết đánh giá bệnh tích phổi trình bày qua bảng 4.1 Bảng 4.1: Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ MH Bệnh tích Số phổi Tỷ lệ (%) Bệnh tích nghi ngờ MH 129 63,55 Bênh tích khác 74 203 36,45 Tổng 100 Tỷ lệ 63,55 36,45 BTNNMH BTK Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ MH Ghi chú: BTK: bệnh tích khác BTNNMH: bệnh tích nghi ngờ Mycoplasma hyopneumoniae 25 Qua bảng 4.1 cho thấy tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ MH cao nhiều so với bệnh tích khác Kết phù hợp với nhận định Ross (1999), tỷ lệ bệnh tích MH đàn heo hạ thịt khoảng 30-80% Kết cho thấy tỷ lệ xuất bệnh tích cao Có thể nguồn heo thịt xuất phát chủ yếu từ tỉnh Đồng Nai, Bình Dương nơi có mật độ chăn ni cao, người chăn nuôi chưa quan tâm đến việc chữa trị tiêm phịng vaccin Hiện tình hình bệnh hơ hấp heo phổ biến thời gian khảo sát thời điểm giao mùa nên làm diễn tiến bệnh trở nên trầm trọng Kết đánh giá tỷ lệ bệnh tích nghi ngờ MH tương đồng với kết khảo sát Lâm Chí Hiếu (2004) có tỷ lệ bệnh tích nghi ngờ MH 62,27%, kết khảo sát bệnh tích nghi ngờ MH Đỗ Tiến Duy (2004) 67,94%, với kết khảo sát Nguyễn Thoại Thức (2005) 55% Nhưng thấp so với kết khảo sát Võ Thị Hồng Sang (2006) có bệnh tích nghi ngờ MH 76%, Nguyễn Thị Thanh Trúc (2006) 75,77%, Vân Minh Tâm (2005) 71,34% 4.1.2 Kết đánh giá bệnh tích đại thể phổi nghi nhiễm MH Đánh giá phần trăm hư hại thùy phổi, phổi trái, phổi phải phổi theo công thức đề nghị Christensen (1999) Kết trình bày qua bảng 4.2 Bảng 4.2 Tỷ lệ hư hại phổi nghi ngờ MH Số mẫu phổi (n = 129) Phổi trái Phổi Phổi phải Tỷ lệ (%) Thùy đỉnh 35,15 Thùy 44,28 Thùy hồnh cách mơ Thùy đỉnh 37,73 42,69 Thùy 43,84 Thùy hồnh cách mơ 39,17 Thùy phụ 48,50 38,39 40,18 41,37 P < 0,05 26 60 50 44,28 40 42,69 43,84 37,73 35,15 48,50 39,17 30 20 10 Phổi trái Thùy đỉnh Phổi phải Thùy Thùy HCM Thùy phụ Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ hư hại thùy phổi Ghi chú: HCM: Hồnh cách mơ 41,37 42 41 40,18 40 39 38 37 36,39 36 35 34 33 Phổi trái Phổi phải Phổi trái Phổi phải Cả phổi Cả phổi Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ hư hại trung bình phổi 27 Qua bảng 4.2 thấy tỷ lệ hư hại trung bình phổi phải (41,37%) lớn phần trăm hư hại trung bình phổi trái (38,39%) phần trăm hư hại trung bình phổi (40,18%) Sự khác biệt tỷ lệ hư hại phổi phải phổi trái có ý nghĩa mặt thống kê (P < 0,05) Kết cho thấy mức độ hư hại phổi đánh giá mức trung bình Có thể bệnh tích đại thể chịu ảnh hưởng yếu tố kháng sinh điều trị vaccin làm cho diện tích bề mặt phổi bị giới hạn theo Rice (2000), ảnh hưởng vaccin MH kháng sinh đóng vai trị quan trọng việc làm giảm mức độ bệnh tích phổi (Nguyễn Tất Tồn, 2004; trích dẫn Vân Minh Tâm, 2005) Qua biểu đồ 4.2 4.3 cho thấy kết chúng tơi cao so với Võ Thị Hồng Sang (2006) có tỷ lệ hư hại phổi phải 44,16%, phổi trái 29,43% phổi 38,27%; Vân Minh Tâm (2005) có phần trăm hư hại phổi phải 38,31%, phổi trái 20,09%, phổi 31,27%; Lâm Chí Hiếu (2004) có tỷ lệ hư hại phổi phải 28,27%, phổi trái 25,87% phổi 27,31% Nếu chia theo mức độ hư hại (%) tần số xuất phổi tính điểm theo Rice (2000) biểu qua bảng 4.3 Bảng 4.3 Tỷ lệ hư hại phổi nghi nhiễm M hyopneumoniae mức độ Số lượng mẫu hư hại Điểm Mức độ hư hại (%) 75% 6,98 (n = 129) 28 Tỷ lệ (%) P