Luận văn Thạc sĩ Nghiên cứu nhân nuôi liên tục sinh khối tảo Chaetoceros sp. nhằm phục vụ nuôi trồng thủy sản tại Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Ngọc Diễm NGHIÊN CỨU NHÂN NUÔI LIÊN TỤC SINH KHỐI TẢO Chaetoceros sp NHẰM PHỤC VỤ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI CẦN GIỜ, TP HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Ngọc Diễm NGHIÊN CỨU NHÂN NUÔI LIÊN TỤC SINH KHỐI TẢO Chaetoceros sp NHẰM PHỤC VỤ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI CẦN GIỜ, TP HỒ CHÍ MINH Chuyên ngành : Sinh thái học Mã số : 8420120 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN ĐỨC HƯNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đề tài nghiên cứu thân thực hiện, số liệu, kết trình bày luận văn hồn tồn xác, trung thực chưa có cơng bố Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm kết nêu luận văn Tác giả Phạm Thị Ngọc Diễm LỜI CẢM ƠN Để có kết ngày hôm nay, trước tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa quý thầy cô Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh giúp đỡ tơi hồn thành chương trình học thực cơng tác nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến TS Nguyễn Đức Hưng - người tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài Đồng thời, xin chân thành cảm ơn đến em Nguyễn Văn Duy em sinh viên phịng thí nghiệm Sinh học - Khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên - Trường Đại học Sài Gòn hết lòng giúp đỡ chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm cho tơi thực đề tài Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới tất người thân gia đình, bạn bè lớp giúp đỡ, động viên mặt vật chất tinh thần để tơi hồn thành đề tài TP Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2019 HỌC VIÊN Phạm Thị Ngọc Diễm MỤC LỤC Trang bìa phụ Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục từ viết tắt Danh mục hình Danh mục bảng MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm tự nhiên xã hội huyện Cần Giờ 1.1.1 Vị trí địa lí 1.1.2 Đặc điểm địa hình thổ nhưỡng 1.1.3 Đặc điểm khí hậu 1.1.4 Đặc điểm thủy văn 1.1.5 Đơn vị hành đặc điểm dân số 1.1.6 Đặc điểm kinh tế, văn hoá - xã hội 1.2 Tổng quan tảo silic 1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo tế bào 1.2.2 Đặc điểm sinh trưởng 1.2.3 Các hình thức sinh sản 10 1.2.4 Vai trò tảo silic 12 1.3 Giới thiệu sơ lược tảo Chaetoceros tình hình nhân sinh khối tảo 13 1.3.1 Phân loại 13 1.3.2 Đặc điểm hình thái tảo 14 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển tảo 14 1.3.4 Tình hình nhân sinh khối tảo 15 Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 21 2.1.1 Thời gian nghiên cứu 21 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu tảo 21 2.2.1 Thu mẫu 21 2.2.2 Phân lập 22 2.2.3 Ni thích nghi 23 2.2.4 Định danh hình thái 23 2.2.5 Định danh phân tử tảo Chaetoceros sp mã vạch DNA 24 2.2.6 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi tảo 28 2.2.7 Thiết lập mối tương quan mật độ tế bào mật độ quang 29 2.2.8 Xác định thời gian hệ tốc độ tăng trưởng 30 2.2.9 Xác định độ mặn pH dịch nuôi 31 2.2.10 Bố trí thí nghiệm phịng thí nghiệm 32 2.2.11 Thiết kế ao ni tảo liên tục ngồi trời 33 2.2.12 Môi trường dinh dưỡng nuôi thực nghiệm 33 2.3 Phương pháp xử lí phân tích số liệu 33 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Phân lập định danh 34 3.1.1 Phân lập định danh loài Chaetoceros dựa vào hình thái 34 3.1.2 Kết phân tích mã vạch DNA 36 3.2 Sự sinh trưởng tảo Chaetoceros subtilis quy mơ phịng thí nghiệm 41 3.2.1 Mối tương quan mật độ tế bào OD 41 3.2.2 Sự sinh trưởng C subtilis loại môi trường nuôi cấy khác 42 3.3 Thử nghiệm mô hình nhân ni liên tục C subtilis ngồi trời 50 3.3.1 Xử lí nguồn nước cấp để phục vụ thực nghiệm 50 3.3.2 Kết xây dựng ao ni thử nghiệm ngồi trời 52 3.3.3 Nhân sinh khối điều kiện tự nhiên 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt BM Biomass productivity Năng suất sinh khối bp Base pair Cặp Base BLAST Dd N OD Optical density Mật độ quang PSII Photosystem II Quang hệ II SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SEM Scanning Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử quét 10 td Doubling time Thời gian hệ 11 tb 12 μ Basic Local Alignment Search Tool Division per day Thời gian phân chia ngày Ngày Tế bào Growth rate Tốc độ tăng trưởng DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bản đồ huyện Cần Giờ Hình 1.2 Cấu trúc vỏ tảo silic Hình 1.3 Các pha tăng trưởng vi tảo Hình 1.4 Sơ đồ biểu diễn thay đổi huỳnh quang 10 Hình 1.5 Vịng đời tảo silic với sinh sản vơ tính hữu tính 11 Hình 1.6 Mơ hình sản xuất tảo 17 Hình 2.1 Dụng cụ thu mẫu 21 Hình 2.2 Kĩ thuật phân lập vi tảo 22 Hình 2.3 Thiết bị thu sinh khối tảo 24 Hình 2.4 Sơ đồ thiết kế mồi để khuếch đại trình tự gen rbcL-3P 26 Hình 2.5 Sơ đồ thiết kế mồi để khuếch đại trình tự gen LSU D2-D3 27 Hình 2.6 Thiết bị buồng đếm hồng cầu xác định mật độ tảo 29 Hình 2.7 Thiết bị đo hiệu suất lượng tử tối đa quang hệ II 30 Hình 2.8 Thiết bị đo độ mặn nước 32 Hình 2.9 Thiết bị đo pH 32 Hình 2.10 Phân bón NPK 33 Hình 3.1 Tảo Chaetoceros sp qua kính hiển vi quang học 34 Hình 3.2 Ảnh SEM tảo Chaetoceros sp 35 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm DNA tổng số Chaetoceros sp 36 Hình 3.4 Kết kiểm tra độ tinh DNA Nanodrop 37 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR vùng gen rbcL 3P LSU D2-D3 38 Hình 3.6 Kết BLAST trình tự gen rbcL-3P GenBank 38 Hình 3.7 Kết BLAST trình tự gen LSU D2-D3 GenBank 39 Hình 3.9 Mối tương quan mật độ tế bào mật độ quang 42 Hình 3.10 Đường cong tăng trưởng Chaetoceros sp môi trường khác 43 Hình 3.11 Màu sắc dịch ni cấy thời điểm mật độ tế bào đạt cực đại nghiệm thức 49 Hình 3.12 Bồn chứa 10m3 50 Hình 3.13 Hệ thống xử lí nước cấp để nuôi nhân sinh khối tảo 51 Hình 3.14 Hệ thống ao ni liên tục 52 Hình 3.15 Thực nghiệm nhân giống quy mô từ 0,5 – 2,5 -10 lít 53 Hình 3.16 Dịch tảo quy mơ 10 lít bị nhiễm tảo tạp khác 53 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các thành phần có phản ứng khuếch đại trình tự rbcL-3P 26 Bảng 2.2 Các thành phần có phản ứng khuếch đại trình tự LSU D2-D3 27 Bảng 2.3 Chu kì nhiệt khuếch đại trình tự 28 Bảng 3.1 Kết mơ tả hình dạng Chaetoceros sp 35 Bảng 3.2 Kết BLAST vùng gen LSU D2-D3 mẫu tương đồng sở liệu GenBank 40 Bảng 3.3 Mật độ tế bào Chaetoceros subtilis ảnh hưởng mật độ khởi đầu khác ni phịng thí nghiệm 45 Bảng 3.4 Tốc độ tăng trưởng suất sinh khối Chaetoceros subtilis mơi trường khác ni phịng thí nghiệm 48 Bảng 3.5 Điều kiện mơi trường q trình thử nghiệm so với điều kiện phịng thí nghiệm 54 PL8 Ngày 5_matdo Duncan moitruo N Subset for alpha = 0,05 ng f e d c b 7.0733 7.6133 11.2433 11.9700 11.9700 3 12.3333 12.3333 Sig a 7.6133 8.7500 8.7500 9.6133 12.7767 14.946 377 073 165 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 .099 216 1.000 PL9 Ngày 6_matdo Duncan moitruong N Subset for alpha = 0,05 e d c b a 7.3900 7.6800 7.8600 8.1100 8.1100 8.4733 8.4733 8.4733 3 9.2767 9.2767 Sig 5.6667 9.6400 15.9933 1.000 092 059 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 .059 1.000 PL10 Ngày 7_matdo Duncan moitruong N Subset for alpha = 0,05 e d c b a 3 6.2067 6.5467 6.8533 7.4400 7.4400 3 7.5400 7.5400 7.9033 8.2733 Sig 5.0100 6.8533 12.1933 1.000 116 096 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 .052 1.000 PL11 Ngày 8_matdo Duncan moitruong N Subset for alpha = 0,05 3.3333 3.6900 3.6900 3.7767 3.7767 3 4.6733 4.8933 4.8933 5.0833 5.0833 Sig 4.0233 5.2933 6.0533 095 203 121 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 .130 1.000 PL12 Phụ lục Phân tích phương sai yếu tố suất sinh khối Chaetocero sp q trình ni cấy phịng thí nghiệm BM Duncan moitruong N Subset for alpha = 0,05 f e d c b 868333 922667 3 1.943333 1.967500 1.986667 Sig a 446633 1.466667 1.640000 3.11166 1.000 443 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 .562 1.000 PL13 Phụ lục Phân tích phương sai yếu tố tốc độ tăng trưởng Chaetoceros sp Trong q trình ni cấy phịng thí nghiệm tocdotangtruong Duncan moitruong N Subset for alpha = 0,05 536067 819833 819833 826100 826100 833133 833133 901400 901400 977567 1.037300 1.037967 3 1.050133 Sig .096 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 .295 PL14 Phụ lục Kết giải trình tự vùng gen LSU D2-D3 sau loại bỏ trình tự mồi ATGCAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTTAAAGAGTACCTGAAATTGCTGAGAGGGAAGCG AAGGAAACCAGTGTTGTTCTAGTACATTTTTCTCGTGCAGCTTGCTGCAGGGGCGCTGTG TATTGGAGTAGGCCAGCATGGGTTTGCATCGACACAAATGGCTGTAGAGGAGGTAGATC AATTTCTGATTGAAGACTCTGTGGTTTTGTGTTGGTGTGGACTGAGGCAAGCATGTGTGA TGCTGGCGAAATGGTTTTCTTTACCCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTTCAACATA TGTGCGAGTACAGGAGTGGCAAACTCCCGTGCGCAATGAAAGTAACAGTGGTAGGACC TTTGGGCACTATCCGCCGGCCACAATCCTTCGGGAGAAAGGTCTGAGTGTGAGCATACA TGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAATAGGGTGAAGCCAGGGGAAACTC TGGTGGAGGCTCGTATGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAATTTGGGTATAGGG GCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTCCCTCCGAAATTTCCCTCAGGATAG GCTGCAATCGAATGTCATTTTTATCA Phụ lục Kết giải trình tự vùng gen rcbL-3P sau loại bỏ trình tự mồi GCGTTTTTTATGTATTGGAAGGAATTAACCGGGCTTCTGCTGCTACCGGGGA AGTTAAAGGTTCTTACTTAAACGTAACTGCTGCTACTTTGGAGGAAGTTTCC AAACGTGCGGATTCGGCTAAACCAGTGGGTCCAGTATTTCTCATGGTCGGAT TTGGTAATGGGGTTCCCCACGAGATCCAAAGAATGGTTCTTTGGGTTCTGTG AAAACGATAATGGTTTTCCATTTCCCCCGGCCAGGTAATTCACATATATGTT CGCCAAAAAAACCCCGGAATAAACTTCCGGGTTTTTTTTAAAGGAAGGGGT AGTTTGTGGGGTGGATCCCTTCCCCGCGGGTCCAGTGTGTTGGTAAATTGAG AAGGGGTCCCTTTAAGGTTTAAAGGTTTTTAGGAGGTTTTACGTTTAATAAA TTTAGCGGTAAACTTCCCCTCCGGTTTTTTTTTGGAAATGGATTGGGTTGTTT TAGGTAAGGGTATCCCAGAAGTTTTTGGGGGTTTTCCCGGGGGTAAAAACCC CCAATTAATTTTCTAATTTAGGGGACGAAGGAATATTTCCAATTCGGGGGGG GTCCAATTGGCCCCCCCGAGGGTTTCCAAGCGGGGGTTCCACCTACCCGGGT TGTTTTAGAACCAAAGGTTTTGGTTGTTAAGAAAGGGGCGGACTACTTTCAC CCCCCAAGAGGGCCCGGAAATTTTCCGGGAGGTGGTTAAACCAGGGGGTCC GTTCCAACCACCTTTGGATTTAGGGAGGGATTTTATTTTTAACTACCACTTTT CCAAAACCACCGGATTTGCCGCCAACGCCACCACCAAACGTATAATAAAAT TACTTTTAAAAAATTAAAGGAGTATTTGAATAGTG PL15 Phụ lục Hình ảnh màu sắc dịch nuôi cấy môi trường ngày ni phịng thí nghiệm Ngày PL16 Ngày PL17 Ngày PL18 Ngày PL19 Ngày PL20 Ngày PL21 Ngày PL22 Ngày ... SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Ngọc Diễm NGHIÊN CỨU NHÂN NUÔI LIÊN TỤC SINH KHỐI TẢO Chaetoceros sp NHẰM PHỤC VỤ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI CẦN GIỜ, TP HỒ CHÍ MINH Chuyên ngành : Sinh thái... tơi thực đề tài ? ?Nghiên cứu nhân nuôi liên tục sinh khối tảo Chaetoceros sp nhằm phục vụ nuôi trồng thủy sản Cần Giờ, Tp HCM” 2 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập định danh loài tảo Chaetoceros sp từ... nitrogen–ammonium lên sinh trưởng [22] Tuy nhiên việc nhân nuôi sinh khối để phục vụ nuôi trồng thủy sản cho địa phương Cần Giờ chưa quan tâm nhiều Nghiên cứu sinh trưởng thử nghiệm nhân sinh khối liên tục lồi