Đánh giá đa dạng di truyền và hiện tượng thắt cổ chai ở quần thể Vù hương (Cinnamomum balansae Lecomte) tại tỉnh Phú Thọ bằng chỉ thị phân tử SSR

Đề tài này nghiên cứu một số chỉ thị phân tử SSR được sử dụng để đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể và loài, cũng như sử dụng để đánh giá hiện tượng hắt cổ chai quần thể (suy giảm kích thước quần thể) của loài Vù hương ở tỉnh Phú Thọ, góp phần cho các nhà quản lý đưa ra các giải pháp bảo tồn, phục hồi và phát triển bền vững loài này. Mời các bạn cùng tham khảo!

Công nghệ sinh học & Giống trồng ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ HIỆN TƯỢNG THẮT CỔ CHAI Ở QUẦN THỂ VÙ HƯƠNG (Cinnamomum balansae Lecomte) TẠI TỈNH PHÚ THỌ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR Vũ Đình Duy1,3*, Bùi Thị Tuyết Xuân2, Nguyễn Văn Sinh1,2, Phạm Mai Phương3, Tạ Thị Thu Hà4, Nguyễn Viễn5, Lê Văn Quang5 Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Sinh thái Nhiệt đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga Trường Đại học Lâm nghiệp Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam TÓM TẮT Vù hương (Cinnamomum balansae Lecomte) loài đặc hữu bị tuyệt chủng Việt Nam Đây lồi có tầm quan trọng mặt sinh thái kinh tế Để bảo tồn loài Vù hương Phú Thọ, đa dạng di truyền lồi đánh giá sở phân tích 10 thị phân tử microsatellite (SSR) với 52 cá thể trưởng thành từ quần thể huyện Đoan Hùng, Thanh Sơn, Hạ Hịa Tp Việt Trì Tổng số 27 allele ghi nhận cho tất locus nghiên cứu Hàm lượng thơng tin đa hình (PIC) cho cặp mồi đa hình trung bình 0,43 mức độ đa hình trung bình Các giá trị đặc điểm cặp mồi SSR xác định: số khác cặp mồi (Rp = 2,57), số khác biệt cặp cá thể (PD = 0,58) số đa dạng trung bình locus đa hình (MI = 1,08) Kết mức độ đa dạng di truyền loài Vù hương tỉnh Phú Thọ cao, số allele hiệu cho locus (Ne = 2,68), hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho = 0,37), gen dị hợp tử kỳ vọng (He = 0,47) hệ số sinh sản cận nỗn dương tính (Fis = 0,16) Khơng tìm thấy tượng thắt cổ chai quần thể Vù hương nghiên cứu Kết nghiên cứu tầm quan trọng cần phải bảo tồn nguồn gen lồi Vù hương Phú Thọ Từ khóa: bảo tồn, Cinnamomum balansae Lecomte, đa dạng di truyền, đặc hữu, microsatellite (SSR), Vù hương ĐẶT VẤN ĐỀ Vù hương (Cinnamomum balansae Lecomte) loài đặc hữu Việt Nam Đây loài rộng thường xanh, phân bố số tỉnh phía Bắc Việt Nam như: Vườn Quốc gia Ba Vì (Hà Nội), Vườn Quốc gia Bến En (Thanh Hóa), Vườn Quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình), Vườn Quốc gia Pù Mát (Nghệ An), Hà Giang, Yên Bái, Phú Thọ Tuyên Quang (Nguyễn Kim Đào, 2010; Vũ Anh Tài & Nguyễn Nghĩa Thìn, 2014; Trần Ngọc Hải cộng sự, 2016) Lồi khơng có tầm quan trọng mặt sinh thái hệ sinh thái rừng mà cịn có giá trị thương mại lớn, ứng dụng gỗ, nhựa, tinh dầu dược phẩm (Yan et al., 2015; Chen et al., 2016; Balijepalli et al., 2017; Lee et al., 2018) Do giá trị thương mại nhu cầu người dân địa phương, nhiều quần thể tự nhiên loài bị đe doạ khai thác cạn kiệt phá rừng làm nguyên liệu thuốc lấy gỗ Do vậy, quần thể tự nhiên loài bị suy giảm nghiêm trọng, phân cắt mạnh, tỷ lệ tái sinh lồi * Corresponding author: duyvu@vnmn.vast.vn/ duydinhvu87@gmail.com khơng cao (Trần Ngọc Hải cộng sự, 2016) Theo tiêu chí Quỹ Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (IUCN 2018 ver 2.3) loài Vù hương xếp tình trạng bị tuyệt chủng (A1cd, B1+2c) Tại Việt Nam loài đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (2007) mức độ bị đe dọa (VU A1c) pháp luật bảo vệ (nằm nhóm IIA Nghị định 32/2006/NĐ-CP Nghị định 06/2019 NĐCP) Mặc dù số quần thể loài đối tượng bảo vệ khu bảo tồn thiên nhiên vườn quốc gia, chúng tình trạng bị đe dọa Bảo tồn quản lý lồi địi hỏi thơng tin sinh thái tính đa dạng di truyền (Gupta & Varshney, 2000) Chỉ thị phân tử vi vệ tinh microsatellite (Single Sequence Repeat - SSR) công cụ sử dụng rộng rãi cho việc đánh giá mơ hình đa dạng di truyền thực vật thị có tiềm năng, lợi cho việc điều tra loại quý SSR phân bớ rơ ̣ng ̣ gen, tıń h di truyề n đồ ng trô ̣i, tıń h lă ̣p la ̣i, bản chấ t đa allele và vi ̣ trı́ đă ̣c hiê ̣u ở nhiễm sắ c thể (Varshney et al., 2005; Rajwant et al., 2011; TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Công nghệ sinh học & Giống trồng Xu et al., 2017) Trên giới, thị phân tử SSR ứng dụng phổ biến cho nghiên cứu đa dạng di truyền số loài chi Quế (Yan et al., 2017, Kameyama et al., 2017; Abeysinghe et al., 2014; Gwari et al., 2016; Sandigawad & Patil, 2011; Joy & Maridass, 2008) Hiện nay, thiếu tư liệu sinh học sinh thái, đặc biệt mức độ đa dạng di truyền loài quần thể loài Vù hương Mức độ đa dạng di truyền cao đảm bảo trì tồn chúng tương lai điều kiện biến đổi khí hậu Hơn nữa, trì mức độ cao đa dạng di truyền quần thể loài đảm bảo tiềm tiến hóa lồi hệ Bởi vậy, báo số thị phân tử SSR sử dụng để đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể loài, sử dụng để đánh giá tượng thắt cổ chai quần thể (suy giảm kích thước quần thể) lồi Vù hương tỉnh Phú Thọ, góp phần cho nhà quản lý đưa giải pháp bảo tồn, phục hồi phát triển bền vững loài PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Năm mươi hai mẫu (hoặc vỏ) từ 52 cá thể Vù hương Nguyễn Viễn thu thập để phân tích đa dạng di truyền huyện Đoan Hùng, Thanh Sơn, Hạ Hịa Tp Việt Trì, tỉnh Phú Thọ (Bảng 1) Các mẫu đánh số, bảo quản túi nhựa dẻo có chứa silicagel thực địa chuyển đến phịng thí nghiệm giữ nhiệt độ phịng đến sử dụng Trình tự nucleotide 10 thị phân tử SSR nghiên cứu khai thác từ tài liệu tổng hợp công ty IDT, Hoa Kỳ (Intergarated DNA Technology, USA) (Bảng 2) Bảng Nguồn gốc, ký hiệu tọa độ 52 mẫu Vù hương sử dụng nghiên cứu Kinh độ (Bắc) Vĩ độ (Đông) Quần thể Số mẫu Nơi thu huyện Đoan Hùng Đoan Hùng 16 21° 31' 51,8" 105° 13' 54,76" tỉnh Phú Thọ Tp Việt Trì – Việt Trì 11 21° 21' 28,42" 105° 21' 40,33" tỉnh Phú Thọ huyện Thanh Sơn Thanh Sơn 20 21° 04' 48,45" 105° 14' 89,28" tỉnh Phú Thọ huyện Hạ Hòa – Hạ Hòa 21° 52' 37,12" 105° 93' 94,5" tỉnh Phú Thọ Bảng Trình tự nucleotide 10 cặp mồi SSR Locus C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 Trình tự nucleotide cặp mồi (5’-3’) F: ACACACACACACAGAGAGAGAG R: GGAAACTCCTTTACAATCTCAG F: ACACACACACACAGAGAGAGAG R: CCTTCTACCACCCTATCCAAAT F: ACACACACACACAGAGAGAGAG R: TTCTGCCCAGTATTGTGAGTTT F: ACACACACACACAGAGAGAGAG R: ATCCGACAGGCAGTTTGAAT F: ACACACACACACAGAGAGAGAG R: ATGTACCTGAGTTTGTTGATGC F: ACACACACACACAGAGAGAGAG R: TTTATTGGGTCTTTGAGTATTT F: ACACACACACACTCTCTCTCTC R: AAGACTAAAAACCAGGACAAAG F: ACACACACACACTCTCTCTCTC R: TAGGATAAGTGCCAAGGTAGTG F: ACACACACACACTCTCTCTCTC R: ATTCTTGACTTCACGAAACC F: TCTCTCTCTCTCACACACACAC R: TGCTGCCACCACAATCATCTTT Nucleotide lặp lại Nhiệt độ bắt cặp (oC) (AC)6(AG)24 55 (AC)6(AG)22 55 (AC)6(AG)16 54 (AC)6(AG)17 55 (AC)6(AG)15 55 (AC)6(AG)26 55 (AC)6(TC)17 55 (AC)6(TC)16 55 (AC)6(TC)24 54 (TC)6(AC)12 55 Nguồn tài liệu Kameyama, 2012 Kameyama, 2012 Kameyama, 2012 Kameyama, 2012 Kameyama, 2012 Kameyama, 2012 Kameyama, 2012 Kameyama, 2012 Kameyama, 2012 Kameyama, 2012 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Công nghệ sinh học & Giống trồng 2.2 Phương pháp nghiên cứu Tách chiết ADN tổng số: Mẫu tách chiết theo phương pháp CTAB Doyle J & Doyle L (1990) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Việt Nam Kiểm tra độ hàm lượng ADN đo quang phổ hấp thụ kết hợp với điện di gel agarose 1% ADN tổng số pha loãng dùng cho phản ứng PCR nồng độ 10 ng/µl Nhân ADN: Thể tích phản ứng PCR - SSR 25µl, chứa thành phần nồng độ chất tham gia phản ứng như: µl ADN tổng số, 12,5 µl Master Mix 2X, µl cho mồi xi mồi ngược 10 µM 9,5 µl H2O deion Quá trình nhân tiến hành máy Gene amp PCR system 9700 theo chu trình nhiệt sau: (1) Biến tính ban đầu: 940C phút; (2) Biến tính: 940C phút; (3) Bắt cặp: 550C phút; (4) Kéo dài: 720C phút; (5) Lặp lại (2) đến (4) 40 chu kì; (6) Phản ứng kết thúc hồn toàn: 720C 10 phút; (7) Giữ sản phẩm 40C Điện di sản phẩm PCR - SSR gel polyacrylamide 8% 40 mL dung dịch đệm 1xTAE điện di Sequi-Gen (BIORAD, Mỹ), nhuộm GelRedTM Nucleotic Acid Gel Stain chụp ảnh máy soi gel BioDocAnalyze (BIOMETRA, Đức) Kích thước allele xác định phần mềm GelAnalyzer GenoSens1850 (Clinx Sci Instruments Co Ltd, Trung Quốc) với thang marker 20 bp DNA (Invitrogen, Đức) 2.3 Phân tích số liệu Hiệu cặp mồi SSR phân tích thơng qua số PIC (Polymorphism Information Content - hàm lượng thơng tin đa hình), Rp (resolving power - số khác cặp mồi) PD (Discrimination power số khác biệt cặp cá thể) MI (Marker index - số đa dạng trung bình locus đa hình) mô tả Prevost & Wilkinson (1999) Các thông số đa dạng di truyền quần thể bao gồm: NE (số allele hữu hiệu); HO (observed heterozygosity - Hệ số gen dị hợp tử quan sát), HE (Hệ số gen dị hợp tử kỳ vọng - expected heterozygosity, FIS (Hệ số sinh sản cận noãn - inbreeding coefficient) theo phần mềm GenAlex 6.5 (Peakall & Smouse, 2006) Arlequin (Excoffer et al., 2005) Xác định tượng thắt cổ chai (bottleneck) cho quần thể Vù hương sở mơ hình: IAM (Infinite Allele Model - Mơ hình allele khơng xác định), SMM (Mơ hình đột biến bước - Stepwise Mutation Model) TPM (Mơ hình đột biến giai đoạn - Two-phase Mutation Model) sử dụng phần mềm Bottleneck ver 1.2 (Piry et al., 1999) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tính đa hình cặp mồi SSR Với 10 cặp mồi microsatellite dùng để phân tích 52 cá thể Vù hương trưởng thành quần thể Phú Thọ xác định 27 allele khác nhau, với kích thước dao động từ 100 bp đến 290 bp Các giá trị PIC, PD, Rp MI xác định (Bảng 3) Giá trị PIC cao (0,73) tìm thấy cặp mồi C2 thấp (0,15) cặp mồi C5; trung bình 0,43 Giá trị PD dao động từ 0,22 (C9) đến 0,84 (C2), trung bình 0,58 Tương tự, giá trị Rp dao động từ 1,86 (C10) đến 3,15 (C6), trung bình 2,57 Giá trị MI dao động từ 0,10 (C9) đến 3,24 (C2), trung bình 1,08 Theo Botstein et al (1980), số PIC > 0,5 cặp mồi sử dụng cho kết đa hình cao, ngược lại số PIC nằm khoảng 0,25 < PIC < 0,5 cho kết đa hình trung bình với số PIC < 0,25 kết đa hình thấp Kết nghiên cứu loài Vù hương phân bố tỉnh Phú thọ có hàm lượng thơng tin đa hình (PIC) mức độ trung bình Giá trị PIC lồi Vù hương Phú Thọ cao so với giá trị lồi Thơng Xn Nha Khu Bảo tồn Thiên nhiên Xuân Nha (PIC = 0,324) (Nguyen Minh Tam et al., 2015); lồi Dầu mít (PIC = 0,207) (Nguyễn Minh Đức cộng sự, 2017) loài Dầu nước (PIC = 0,218) (Vũ Đình Duy & Bùi Thị Tuyết Xuân, 2014) Tuy nhiên giá trị loài Vù hương lại thấp loài Dầu song nàng (PIC = 0,459) (Nguyễn Thị Hải Hà cộng sự, 2016) Hơn nữa, Powell et al (1996) mô tả số MI cao phản ánh hiệu việc ứng dụng kĩ thuật TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng đánh giá lượng lớn allele dựa vào allele đa hình khuếch đại Việc sử dụng chúng để đánh giá khả hay tính hữu hiệu cặp mồi chưa nghiên cứu dựa vào số MI để so sánh hiệu kỹ thuật với (Milbourne et al., 1997) Trong nghiên cứu này, cặp mồi SSR phân tích quần thể Vù hương Phú Thọ tìm số đa dạng trung bình locus đa hình (MI = 1,08) thấp loài Dầu song nàng (MI = 1,19) (Nguyễn Thị Hải Hà cộng sự, 2016) lồi Dầu mít (MI = 0,389) (Nguyễn Minh Đức cs, 2017) Mặt khác, theo Prevost & Wilkinson (1999) số Rp tương quan kiểu gen với thị phân tử ADN, số Rp cao chứng tỏ thị phân tử hữu hiệu việc phân nhóm kiểu gen Từ kết cho thấy số Rp trung bình loài Vù hương Phú Thọ 2,57 Chứng tỏ thị phân tử SSR hữu hiệu để phân chia kiểu gen mẫu Vù hương Các giá trị phản ánh cặp mồi SSR nghiên cứu cung cấp thông tin cần thiêt, có giá trị hữu ích để đánh giá mức độ đa dạng di truyền loài Vù hương tỉnh Phú Thọ Bảng Các giá trị PIC, PD, Rp MI cho locus đa hình Locus PIC PD Rp MI C1 0,64 0,82 2,84 2,32 C2 0,73 0,84 2,84 3,24 C3 0,63 0,78 2,26 1,26 C4 0,44 0,64 2,61 0,66 C5 0,11 0,25 2,23 0,15 C6 0,47 0,55 3,15 0,62 C7 0,21 0,42 2,68 0,48 C8 0,44 0,65 2,60 0,79 C9 0,13 0,22 2,60 0,10 C10 0,51 0,63 1,86 1,18 0,43 0,58 2,57 1,08 Trung bình Chú thích: PIC - Hàm lượng thơng tin đa hình; Rp - Chỉ số khác cặp mồi; PD - Chỉ số khác biệt cặp cá thể MI: Chỉ số đa dạng trung bình locus đa hình 3.2 Đa dạng di truyền quần thể Kết bảng mức độ đa dạng di truyền loài Vù hương Phú Thọ như: số allele hữu hiệu NA = 2,68; hệ số gen di hợp tử quan sát HO = 0,37 hệ số gen di hợp tử kỳ vọng HE = 0,47 White et al (2007) rừng nói chung, quần thể coi có tính đa dạng di truyền số lượng allen trung bình đạt từ 1,75 trở nên Do vậy, số lượng allele trung bình quần thể Vù hương nghiên cứu 2,68 đảm bảo tính đa dạng di truyền cần thiết Tỷ lệ gen dị hợp tử số đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể, phản ánh tiềm di truyền khả thích ứng nguồn gen (Lê Sơn cộng sự, 2012) Mức độ đa dạng di truyền quần thể loài Vù hương nghiên cứu thể mức thấp so sánh với số loài chi Quế giới sử dụng thị phân tử SSR, chẳng hạn Kameyama (2012) đa dạng di truyền loài Long não (C camphora) từ 104 trưởng thành quần thể Nhật Bản (Ho = 0,53 - 0,6) (He = 0,55 - 0,68) Tương tự, Kameyama et al (2017) mức độ đa dạng di truyền 504 mẫu Long não có nguồn gốc Nhật Bản Ho = 0,614 ± 0,02 He = 0,714 ± 0,024 300 mẫu từ Trung Quốc Đài Loan Ho = 0,728 ± 0,027 He = 0,878 ± 0,015 Gần đây, Li et al (2018) đa dạng di truyền 45 Long não Trung Quốc sử dụng 21 thị phân tử SSR Ho = 0,3449 He = 0,4254 Các tác giả mức độ hữu ích sử dụng thị phân tử SSR để nghiên cứu lịch sử tiến hóa, biến đổi quần thể, hệ thống giao phối cấu trúc di truyền lồi Long não Ở Việt Nam chưa có đánh giá đầy đủ đa dạng di truyền TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Công nghệ sinh học & Giống trồng loài Vù hương loài khác chi Quế thị phân tử SSR, mà có vài cơng bố sử dụng thị phân tử (RADP) để đánh giá đa dạng di truyền quan hệ di truyền loài Long não (Hà Văn Huân, 2015) quế (C cassia) (Hà Thị Phúc cộng sự, 2015) Các tác giả quần thể Long não có mức độ đa dạng di truyền cao Từ phân tích chúng tơi có nhận xét lồi Vù hương phân bố tỉnh Phú Thọ có đa dạng di truyền mức cao điều có ý nghĩa quan trọng việc nhân giống lồi Hệ số sinh sản cận noãn (FIS) gia tăng tỉ lệ cá thể mang gen đồng hợp tử quần thể không chủng (Phạm Mai Phương cộng sự, 2019) Giao phối gần (các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi) tạo gia tăng tỉ lệ gen đồng hợp tử lặn, dẫn đến biểu số allele lặn có hại bẩm sinh, làm giảm sức chống chịu quần thể Kết nghiên cứu bảng cho thấy hệ số cận noãn thấp tìm thấy quần thể Vù hương Phú Thọ, trung bình 0,16, dao động từ 0,12 quần thể Hạ Hòa đến 0,19 quần thể Thanh Sơn Kết cho thấy tượng giao phối cận noãn diễn quần thể Vù hương Phú Thọ Bảng Đa dạng di truyền loài Vù hương Phú Thọ Quần thể N NE HO HE FIS Đoan Hùng 16 3,00 0,40 0,50 0,18 Việt Trì 11 2,60 0,34 0,49 0,16 Thanh Sơn 20 3,10 0,42 0,52 0,19 Hạ Hòa 2,00 0,31 0,37 0,12* 2,68 0,37 0,47 0,16 Trung bình Chú thích: N - số mẫu thu thập; NE - số alen hữu hiệu; HO - Hệ số gen dị hợp tử quan sát; HE - Hệ số gen dị hợp tử kỳ vọng FIS - Hệ số sinh sản cận noãn với xác suất *p