Với mục đích quản lý, bảo tồn và phát triển giống Lợn đen đặc hữu, đề tài này tiến hành phân tích đa hình di truyền gen PIT1 từ 60 mẫu mô của 60 cá thể Lợn đen Định Hoá, tỉnh Thái Nguyên. Để hiểu rõ hơn mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của bài viết này.
Công nghệ sinh học & Giống trồng PHÂN TÍ CH ĐA HÌ NH DI TRUYỀN GEN PIT1 (POU1F1) CỦ A GIỐNG LỢN ĐEN ĐINH HÓA TỈ NH THÁI NGUYÊN ̣ Hà Bı́ch Hồ ng1, Bùi Văn Thắ ng1, Nguyễn Thi Vân Anh1, Nguyễn Thi Bı ̣ ̣ ́ch Ngà2, Trầ n Viế t Vinh2, Trầ n Thảo Vân2, La Văn Công3 Trường Đại học Lâm nghiệp Công ty TNHH Phát triển Nông nghiê ̣p Thảo Vân Đại học Nông lâm Thái Nguyên TÓM TẮT Giố ng Lơṇ đen Đinh ̣ Hóa của tı̉nh Thái Nguyên là mô ̣t giố ng lơ ̣n nhỏ, thiṭ thơm và ngon, cũng là giố ng lơ ̣n đă ̣c hữu của tı̉nh Thái Nguyên Tuy nhiên, vı̀ là giố ng lơ ̣n nhỏ và nuôi thả tự nên số lươṇ g Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa bi ̣suy giảm đáng kể , đă ̣c biê ̣t là những cá thể Lơṇ đen thuầ n chủng Với mu ̣c đı́ch quản lý, bảo tồ n và phát triể n giố ng Lơ ̣n đen đă ̣c hữu này, chúng đã tiế n hành phân tı́ch đa hı̀nh di truyề n gen PIT1 (POU1F1) từ 60 mẫu mô (tai) của 60 cá thể Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa, tı̉nh Thái Nguyên Kế t quả nghiên cứu cho thấ y đoa ̣n gen PIT1 đươ ̣c nhân bản thành công ở tấ t cả các cá thể Lơ ̣n đen với kı́ch thước 1745 bp và chúng đươ ̣c đăng ký lên ngân hàng gen quố c tế với mã số MW167783 Ngoài ra, phân tı́ch đa hı̀nh gen PIT1 quầ n thể Lơṇ đen Đinh ̣ Hóa ta ̣i huyê ̣n Đinh ̣ Hóa, tı̉nh Thái Nguyên bằ ng phương pháp PCR-RFLP chı̉ gen PIT1-RsaI có 03 kiể u gen chủ yế u Trong đó, kiể u gen AA chiế m tầ n số lớn nhấ t (58%), AB chiế m tầ n số 35% và BB rấ t hiế m quầ n thể và chı̉ chiế m 6,7% Tầ n số alen A là 0,76 và alen B là 0,24 Trong đó, kiể u gen AA cho thấ y tro ̣ng lươṇ g trung bı̀nh của cá thể cao so với kiể u gen AB và BB Kế t quả này bước đầ u đánh giá đươ ̣c mức đô ̣ đa hı̀nh di truyề n của gen PIT1 và mố i tương quan giữa kiể u gen của gen PIT1 với tı́nh tra ̣ng tro ̣ng lươ ̣ng thể Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa là giố ng Lơ ̣n có tiề m cho suấ t và khả mở rô ̣ng quầ n thể tố t lựa cho ̣n că ̣p giao phối có kiể u gen phù hơ ̣p Từ khóa: đa hın ̀ h di truyề n, PCR-RFLP, PIT1, Lơ ̣n đen Định Hóa ĐẶT VẤN ĐỀ Giống Lợn đen Định Hóa của tı̉nh Thái Ngun giớ ng lơ ̣n nhỏ, thiṭ thơm và ngon quan tâm nay, cũng là giố ng lơ ̣n đă ̣c hữu của huyê ̣n Đinh ̣ Hóa tın̉ h Thái Nguyên Tuy nhiên, số lượng Lợn đen chủng suy giảm nhanh chóng xuống mức đáng lo ngại, cần có biện pháp để cải thiện khả sinh trưởng, sinh sản phát triển giớ ng lợn nhằm mục đích bảo tồn phát triển quy mô chăn nuôi để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ thị trường Việc chọn giống khơng dựa vào kiểu hình mà cịn dựa vào kỹ thuật đại sử du ̣ng các thị phân tử tăng ̣ xác, rút ngắn thời gian nâng cao hiệu chọn lọc Trong đó, nghiên cứu mối liên quan đa hình gen quan trọng cơng tác chọn giống, là sở cho nghiên cứu mối tương quan gen nghiên cứu với các tıń h tra ̣ng tương ứng Lợn đen Đinh ̣ Hóa Trong số gen các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu thı̀ gen PIT1 là mô ̣t gen đươ ̣c quan 10 tâm (Franco et al., 2005; Nie et al., 2008; Pierzchala et al., 2003; Yu et al., 1994) Đây là gen mã hóa nhân tố phiên mã chuyên biệt tuyến yên (Pituitary specific transcription factor), mã hóa cho các protein đóng vai trò quan tro ̣ng quá trıǹ h phát triể n của thể điều hịa phiên mã hóc mơn sinh trưởng GH, prolactin, TSH-β GHRH, nồng độ GH huyết tương, tính đa hình gen PIT1 tỷ lệ mỡ thân thịt Gen PIT1 lợn nằm nhiễm sắc thể 13, vị trí các locus tıń h tra ̣ng số lươ ̣ng (QTLs) có liên quan tới tốc độ sinh trưởng lượng mỡ thân thịt (carcass fatness) Gen PIT1 dài 19.723 bp (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/397325), kı́ch thước phân tử mARN là 1518bp Những nghiên cứu đa hı̀nh gen PIT1 đươ ̣c tiế n hành nhiề u đố i tươ ̣ng vâ ̣t nuôi khác lơ ̣n, gà, dê, cừu, bò… vı̀ gen này có ảnh hưởng lớn đế n tố c đô ̣ tăng tro ̣ng và chấ t lươ ̣ng thiṭ (Lê Thi ̣ Thu Hà et al., 2013; Nie et al., 2008; Renaville et al., 1997; Stancekova et al., 1999; Song et al., 2005) TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng Hın ̣ Hóa tı̉nh Thái Nguyên ̀ h Giố ng Lơ ̣n đen Đinh Chı̉ thi ̣ RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) là phương pháp nghiên cứu đa hình chiều dài dựa phân đoạn sản phẩm PCR cắt enzyme giới hạn thích hợp (Botstein et al., 1980) Phương pháp PCRRFLP phát số thay đổi trình tự nucleotide liên quan đến vị trí nhận biết enzyme giới hạn, phương pháp ưa thích sử dụng phổ biến nhiều phịng thí nghiệm giới tính đơn giản chi phí thấp, có khả tiến hành phân tích đồng thời với số lượng mẫu lớn, thời gian cho kết nhanh (Lê Thi Thu ̣ ́ y et al., 1999) Yu cộng (1994) thực hiê ̣n nhân đoạn ADN từ vùng intron đến vùng 3’UTR có kích thước 1745 bp ở Lơ ̣n, sau sản phẩ m PCR cắt enzym RsaI cho kiểu gen AA (1 vạch 710 bp), kiểu gen AB (3 vạch 710 bp, 388 bp 322 bp), kiểu gen BB (2 vạch 388 bp 322 bp) Kiểu gen AB alen A xuất phổ biến với tần suất 0,72 0,63 Nhóm lợn có kiểu gen AA có tăng trọng trung bình ngày, độ dày mỡ lớn nhóm có kiểu gen AB Cũng tác giả này năm 1995 đã nhân đoạn ADN từ vùng cuối exon – intron – đầu exon gen PIT1 lợn Sử dụng enzym MspI phân tích đa hình gen lợn phân tích phương pháp PCR – RFLP sử dụng enzyme MspI TaqI để kiểm tra với 120 mẫu ADN từ máu lợn 10 mẫu ADN từ lơng cho kết lợn mang gen DD có độ dày mỡ lưng cao so với hai kiểu gen CC, CD quần thể lợn phân tích Sử dụng enzym RsaI đa hình khơng có khác biệt tỷ lệ mỡ, nạc Sản phẩm PCR có kích thước 2100 bp sau cắt enzymm MspI có kiểu gen CC 20%, kiểu gen DD 34,2%, kiểu gen CD 45,8% Sản phầm PCR cắt enzym RsaI có kiểu gen EE 39,2%, kiểu gen EF 52,3%, kiểu gen FF 8,5% (Yu et al., 1995) Song cộng (2005) sử dụng enzym MspI phân tích đa hình intron gen POU1F1 (PIT1) lợn cho thấy lợn mang kiểu gen DD có khối lượng thể 180 ngày tốc độ tăng trọng trung bình hàng ngày cao Qua đó cho thấ y gen PIT1 là mô ̣t gen chı̉ thi co ̣ ́ hiê ̣u quả để xác đinh ̣ tố c đô ̣ tăng trưởng cũng đô ̣ dày mỡ và tỷ lê ̣ na ̣c ở vâ ̣t nuôi Trong nghiên cứu này, chúng thực hiê ̣n giải trıǹ h tự nucleotide vùng gen PIT1 (POU1F1) và sử du ̣ng chı̉ thi ̣ phân tử PCRRFLP để phân tı́ch mức đô ̣ đa hı̀nh gen PIT1 quầ n thể Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa ta ̣i huyê ̣n Đinh ̣ Hóa, tın̉ h Thái Nguyên làm sở khoa ho ̣c cho đề xuấ t các giải pháp cho ̣n giố ng, nhân giố ng và phát triể n bề n vững giố ng Lơ ̣n này ở Thái Nguyên nói riêng và ở Viê ̣t Nam nói chung PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vâ ̣t liêụ nghiên cứu TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 11 Công nghệ sinh học & Giống trồng Mẫu mô tai của các cá thể Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa đươ ̣c thu thâ ̣p làm vâ ̣t liê ̣u tách chiế t ADN tổ ng số (Bảng 1) Ta ̣i thực đia,̣ phương pháp lấy mẫu mô tai tiến hành sau: dùng kìm chuyên dụng lấy mẩu mô tai đưa vào ống eppendorf 2ml chứa cồn tuyệt đối, bảo quản lạnh khoảng 24 Ta ̣i phòng thı́ nghie ̣m, dùng nước cất rửa sạch, để khô đưa vào ống eppendorf ml chứa cồn tuyệt đối đem bảo quản tủ lạnh âm sâu (-20oC) sử dụng phân tıć h ADN Bảng Danh sách mẫu Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa thu thâ ̣p ta ̣i xã của huyêṇ Đinh ̣ Hóa STT Kí hiệu mẫu Ngày thu mẫu Địa điểm thu mẫu Số lượng mẫu BN (BN1-BN10) 30/09/2019 Bộc Nhiêu - Định Hoá 10 PĐ (PĐ1-PĐ10) 30/09/2019 Phú Đình - Định Hố 10 PT (PT1-PT10) 30/09/2019 Phượng Tiến - Định Hóa 10 PC (PC1-PC10) 30/09/2019 Phúc Chu - Định Hoá 10 QK (QK1-QK10) 30/09/2019 Quy Kỳ - Định Hóa 10 TT (TT1-TT10) 30/09/2019 Tân Thịnh - Định Hoá 10 Tổng cộng 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tách chiế t ADN tổ ng số ADN tổ ng số đươ ̣c tách chiế t theo quy trı̀nh của bô ̣ kit G – spinTM Total DNA Extraction, Intron, Hàn Quố c Sản phẩ m ADN sau tách chiế t đươ ̣c kiể m tra chấ t lươ ̣ng bằ ng phương pháp điê ̣n di gel agarose 1,0% 2.2.2 Phương pháp khuế ch đại PCR và xác ̣nh trı̀nh tự nucleotide Phản ứng PCR thực máy PCR GX100 (Biologix) với thể tı́ch mỗi phản ứng là 20l, đó chứa các thành phầ n và nồ ng đô ̣ các chấ t tham gia phản ứng sau: 10l PCR Master mix 2X, 10M mồ i xuôi và 10M mồ i ngươ ̣c, 50ng ADN khuôn, bổ sung H2O deion tới 20l Chương trıǹ h nhiê ̣t đô ̣ của phản ứng PCR sau: biế n tıń h ở 95oC phút; 35 chu kì lă ̣p la ̣i của ba bước 95oC – 30 giây, 63oC – phút, 72oC – phút; kế t thúc tổ ng hơ ̣p ở 72oC phút; bảo quản sản phẩ m PCR ở 4oC Trıǹ h tự că ̣p mồ i sử du ̣ng để nhân bản đoa ̣n gen PIT1 từ vùng intron đế n vùng 3’ UTR của gen PIT1, đoa ̣n nhân bản có kích thước 1745bp: Mồ i xuôi: 5’ – AGTGTAGCCAGAGCATCT – 3’, Mồ i ngược: 5’ – ACCACATCTGCACACTCA – 3’ (Yu et al., 1994) 12 60 Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,2% có bổ sung thuố c nhuô ̣m axit nucleic (Redsafe) Sau điện di, bản gel agarose soi dưới đèn UV và chụp ảnh Những sản phẩm PCR sau khuếch đại thành công tinh sử du ̣ng bô ̣ kit Prification Kit của hãng Intron, Hàn Quố c Sau tinh sạch, sản phẩm PCR gửi cho phịng thí nghiệm 1st Base Malaysia để giải trình tự theo cả hai chiề u Trình tự nucleotide đoạn ADN xác định máy giải trình tự tự ̣ng theo nguyên lý Sanger, sử dụng Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing 2.2.3 Phương pháp phân tı́ch số liê ̣u Các trıǹ h tự nucleotide đươ ̣c phân tıć h và xử lý bằ ng phầ n mề m tin sinh BioEdit v.7.2.5 (Hall, 1999), Mega7 (Kumar et al., 2015), và các công cu ̣ NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kế t quả tách chiế t ADN tổ ng số Tách chiết ADN tổng số bước quan trọng, chất lượng ADN tổng số thu (hàm lượng, độ tinh sạch) có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu phản ứng PCR Trong nghiên cứu này, vâ ̣t liê ̣u dùng để tách chiế t ADN là 60 mẫu TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Công nghệ sinh học & Giống trồng tai đươ ̣c thu từ 60 cá thể Lợn đen của huyê ̣n Đinh ̣ Hóa tı̉nh Thái Nguyên Kết tách chiết ADN tổng số từ 06 mẫu tai đa ̣i diê ̣n cho 06 cá thể Lợn đen Đinh ̣ Hóa ta ̣i 06 xã của huyê ̣n Đinh ̣ Hóa, tı̉nh Thái Nguyên thể hình Hình Kết tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô tai của 06 các thể Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa Giế ng đế n giế ng 6: tương ứng với các mẫu BN01, PĐ01, PT01, PC01, QK01, TT01 Kết tách chiết ADN từ mẫu tai thể hình Trong đó, mẫu có chất lượng hàm lượng ADN khác Cụ thể giếng số 5, tương ứng với mẫu QK01, TT01 có chất lượng ADN tốt hơn, dải sáng rõ Với giếng số 1, 2, 3, và tương ứng mẫu BN01, PĐ01, PT01, PC01 có xuất băng ADN mờ hơn, tối so với 02 mẫu lại, điều cho thấ y hàm lượng ADN của 04 mẫu BN01, PĐ01, PT01, PC01 thấ p so với mẫu QK01 và TT01 Tuy nhiên, dựa hình ta thấy mẫu ADN bị đứt gãy thể hiê ̣n ở dải smear sáng mờ bên dưới mỗ i va ̣ch ADN tổ ng số Trong quá trıǹ h làm thử nghiê ̣m phản ứng PCR, chúng nhâ ̣n thấ y các mẫu ADN tổ ng số tách chiế t đươ ̣c đề u không cho kế t quả nhân bản đoa ̣n gen mong muố n Mô ̣t số nghiên cứu đã chı̉ rằ ng viê ̣c tách chiế t ADN từ mẫu mô đô ̣ng vâ ̣t có thể vẫn còn lẫn mô ̣t số protein gây ức chế enzyme polymerase dẫn đế n phản ứng PCR bi ̣ thấ t ba ̣i Do đó, chúng đã tiế n hành tinh sa ̣ch la ̣i tấ t cả các mẫu ADN tách chiế t đươ ̣c bằ ng isopropanol la ̣nh (-20oC) thêm mô ̣t lầ n nữa Sau tinh sa ̣ch, các mẫu ADN này đươ ̣c kiể m tra bằ ng cách tiế n hành thử phản ứng PCR với că ̣p mồ i phổ quát là COI_F/R (că ̣p mồ i nhân bản đoa ̣n gen COI ty thể của tế bào đô ̣ng vâ ̣t) (Folmer et al., 1994) Kế t quả cho thấ y tấ t cả sáu mẫu ADN đề u cho sản phẩ m PCR đă ̣c hiê ̣u mong ̣i Từ kế t quả này, chúng nhâ ̣n thấ y viê ̣c tách chiế t ADN từ mẫu mô đô ̣ng vâ ̣t không phải lúc nào cũng đa ̣t đươc̣ đô ̣ tinh sa ̣ch mong ̣i mă ̣c dù sử du ̣ng bô ̣ kit tách chiế t có hiê ̣u quả cao Chúng khuyế n cáo nên tinh sa ̣ch ADN la ̣i mô ̣t lầ n nữa sau hoàn thành tách chiế t ADN theo chı̉ dẫn của bô ̣ kit tách chiế t để loa ̣i bỏ đươ ̣c các chấ t gây ức chế phản ứng PCR 3.2 Nhân bản các đoa ̣n gen PIT1 Yu cộng (1994) thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen PIT1 có trình tự bao gồm từ vùng intron đến vùng 3’UTR, kích thước đoa ̣n nhân bản dài 1745 bp, nhiệt độ gắn mồi 61oC Đối với cặp mồi PIT1_F/R sử dụng cho Lợn đen Định Hóa nhiệt độ 63oC nhân đặc hiệu đoạn gen mong muốn, thu băng nhất, việc lựa chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu với cặp mồi PIT1_F/R dao động từ 61 – 63oC Dựa vào kết thu từ thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi cặp PIT1_F/R, từ chọn nhiệt độ 63oC để tiến hành phản ứng PCR nhân đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 13 Công nghệ sinh học & Giống trồng với 06 mẫu tai (BN01, PĐ01, PT01, PC01, QK01, TT01) tách chiết từ 06 cá thể Lợn đen Định Hóa Kết PCR thể hình Kết thu 06/06 mẫu ADN nhân bản thành công đoa ̣n gen PIT1 với kıć h thước khoảng 1745 bp, tương ứng với kıć h thước đoa ̣n gen PIT1 đã tham khảo Từ Hình 3A thấy kết điện di 06 giếng cho băng ADN rõ nét, không xuất băng phụ và băng có kích thước tương đồng, các giếng sớ 1, 2, 5, và cho băng ADN sáng, rõ nét so với giế ng số và số Điề u này cho thấy nồng độ ADN mẫu BN01, PĐ01, QK01, và TT01 cao so với mẫu PT01 và PC01 Từ thấy că ̣p mồi sử dụng là đặc hiệu nhiệt độ bắt mồi tối ưu hóa (63oC) thu sản phẩ m PCR nhấ t có kıć h thước dự kiế n (1745 bp) Hình Kết nhân đoạn gen PIT1 cá thể Lợn đen Định Hóa (A): M: ADN marker 1kb, đ/c: mẫu đối chứng âm ADN thay H2O, giếng – tương ứng với mẫu ADN của các mẫu BN01, PĐ01, PT01, PC01, QK01, TT01;(B): giếng 1: tinh sản phẩm PCR từ mẫu T5, M: ADN marker 1kb Qua cho thấy: đã nhân bản thành công đoa ̣n gen PIT1 ở 06 mẫu ADN đa ̣i diê ̣n cho các cá thể Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa thu thâ ̣p ta ̣i 06 xã điạ bàn huyê ̣n Đinh ̣ Hóa, kı́ch thước đoa ̣n gen nhân bản khoảng 1745 bp Kế t quả này đươ ̣c áp du ̣ng thành công cho tấ t cả 60 mẫu ADN tổ ng số tách từ 60 cá thể Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa nghiên cứu để phu ̣c vu ̣ cho nô ̣i dung nghiên cứu đa hı̀nh di truyề n bằ ng kỹ thuâ ̣t PCR-RFLP, đồ ng thời giải trı̀nh tự nucleotide của đoa ̣n gen PIT1 ở Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa Sản phẩ m PCR của mẫu số (QK01) đươ ̣c lựa cho ̣n để tinh sa ̣ch và giải trıǹ h tự nucleotide, kế t quả tinh sa ̣ch sản 14 phẩ m PCR của mẫu QK01 đươ ̣c thể hiê ̣n hı̀nh 3B 3.3 Trın ̀ h tự nucleotide của đoa ̣n gen PIT1 của Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa và xây dưṇ g quan ̣ di truyề n với mô ̣t số giố ng Lơ ̣n ngân hàng gen quố c tế Sản phẩm PCR mẫu QK01 tinh gửi giải trình tự nucleotide Mục đích việc giải trình tự nucleotide đoạn gen PIT1 để xác định mối quan hệ di truyền giống Lợn đen Định Hóa với giống Lợn khác công bố ngân hàng gen quốc tế xác đinh ̣ enzyme giới hạn thích hợp cho nghiên cứu TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Công nghệ sinh học & Giống trồng đa hình đoạn gen phương pháp PCR – RFLP, đồ ng thời đăng ký trı̀nh tự đoa ̣n gen PIT1 lên ngân hàng gen quố c tế phu ̣c vu ̣ đăng ký nhañ hiê ̣u sản phẩ m đă ̣c quyề n sau này So sánh kích thước tham khảo cặp mồi Yu ̣ng sự (1994) với phân tích trình tự gen thực tế cơng cụ BioEdit thu đoạn gen PIT1 với kích thước 1745 bp Từ đó, chúng tơi tiến hành so sánh trình tự PIT1 với trình tự cơng bố ngân hàng gen quốc STT tế NCBI xây dựng quan hệ di truyền Trình tự đoạn gen PIT1 BLAST ngân hàng gen quốc tế NCBI để xác định trình tự tương đồng Kết cho thấy có 100 trình tự tương đồng với đoạn gen PIT1 mẫu QK01 (ký hiê ̣u là T5 hıǹ h 4) Từ lựa chọn 03 trình tự có độ tương đồng cao với trình tự PIT1 để so sánh xây dựng quan hệ di truyền thể bảng Bảng Kết so sánh trình tự đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa với trình tự tương đồng ngân hàng gen quốc tế NCBI Mã số ngân hàng Tỷ lệ Tên trın ̀ h tư ̣ gen quố c tế tương đồng Sus scrofa breed Min POU1F1 gene, exons 5, DQ485155.1 100,00% Sus scrofa POU1F1 gene AH015830.2 99,14% Sus scrofa POU – domain protein (PIT1) gene U00793.1 98,46% Trình tự đoạn gen PIT1 của giống Lợn đen Định Hóa có tỷ lệ tương đồng 100% với trình tự đoạn gen PIT1 (Sus scrofa DQ485155.1) của mô ̣t giố ng Lơ ̣n có xuấ t xứ Trung Quốc, tương đồ ng 99,14% với mô ̣t giố ng Lơ ̣n khác ta ̣i Trung Quố c (mã số Genbank AH015830.2) , và tương đồ ng 98,46% với mô ̣t giố ng Lơ ̣n Mỹ (mã số Genbank U00793.1) (Bảng 2) Kết khẳng định chúng đã nhân thành công đoạn gen PIT1 giống Lợn đen Định Hóa và trıǹ h tự đoa ̣n gen PIT1 của Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa tương đồ ng rấ t cao với các giố ng lơ ̣n có xuấ t xứ ta ̣i Trung Quố c và My.̃ Sự sai khác trình tự nucleotide đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa so với 02 trình tự ngân hàng gen quốc tế ảnh hưởng môi trường, vùng điạ lı́ với điều kiện sinh thái khác nhau, q trình tiến hóa sẽ xuất sự sai khác hay vài vị trí nucleotide dẫn đến sai khác nhỏ tỷ lệ tương đồng Trıǹ h tự đoa ̣n gen PIT1 của giố ng Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa đã đươ ̣c đăng ký bản quyề n lên ngân hàng gen quố c tế (NCBI) với mã số MW167783 Dựa kết so sánh trình tự đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa với 03 trình tự ngân hàng gen quốc tế NCBI, chúng tiến hành xây dựng quan hệ di truyền 04 trình tự dựa kiểu phân nhóm NJ NCBI Các mẫu có hệ số tương đồng di truyền cao xếp thành nhóm, nhóm có liên hệ với (Hıǹ h 4) Hình Kết quan hệ di truyền Lợn đen Định Hóa 03 lồi ngân hàng gen quốc tế NCBI TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 15 Công nghệ sinh học & Giống trồng Kế t quả phân tı́ch cho thấ y biể u đồ hı̀nh từ 04 trı̀nh tự đươ ̣c chia thành nhóm chı́nh, trình tự đoạn gen PIT1 của Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa cùng nhóm với 02 trıǹ h tự có mã số là DQ485155.1 và AH015830.2 và cả hai trıǹ h tự này đề u là các giố ng Lơ ̣n xuấ t xứ từ Trung Quố c; còn trıǹ h tự có mã số U00793.1 (giố ng Lơ ̣n xuấ t xứ từ My)̃ tách riêng thành mô ̣t nhóm Qua đó, chúng tơi nhâ ̣n thấy trıǹ h tự đoa ̣n gen PIT1 của Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa có sự tương đồ ng rấ t cao với trıǹ h tự đoa ̣n gen PIT1 của hai giố ng lợn ta ̣i Trung Quốc và tương đồ ng cao với giố ng lơ ̣n ta ̣i My.̃ Điề u này cho thấ y có thể giố ng Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa và Lơ ̣n đen Trung Quố c có thể có cùng nguồ n gố c và trıǹ h tự đoa ̣n gen PIT1 ở lơ ̣n là tương đố i bảo thủ, xảy ıt́ sự biế n đổ i về trıǹ h tự nucleotide 3.4 Đa hın ̀ h Gen PIT1 và mố i tương quan với tı́nh tra ̣ng tương ứng Áp du ̣ng quy trı̀nh của Yu và cô ̣ng sự (1994) là sử du ̣ng enzyme RsaI để nghiên cứu kiể u gen của gen PIT1 ở giố ng Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa Sản phẩ m PCR nhân bản đoa ̣n gen PIT1 của 60 mẫu ADN tách từ 60 cá thể Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa đươ ̣c cắ t bằ ng enzyme RsaI, các kiể u gen đươ ̣c quy đinh ̣ dựa các băng ADN thu đươ ̣c sau cắ t enzyme RsaI bao gồ m: kiể u gen AA (tương ứng với băng ADN có kı́ch thước 710 bp), kiể u gen AB (tương ứng với băng ADN có kıć h thước lầ n lươ ̣t là 710 bp, 388 bp, 322 bp), kiể u gen BB (tương ứng với băng ADN có kıć h thước 388 bp và 322 bp), cả ba kiể u gen đề u có băng ADN với kıć h thước 774 bp, 153 bp và 108 bp Kế t quả thố ng kê kiể u gen PIT1RsaI của quầ n thể Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa đươc̣ thể hiê ̣n ở bảng Kiể u gen AA có tầ n số là 0,58; kiể u gen AB có tầ n số là 0,35; kiể u gen BB rấ t hiế m quầ n thể và chı̉ chiế m 0,067 Tầ n số của alen A là 0,76 và alen B là 0,24 Kế t quả kiể m tra giữa tầ n số thực tế và tầ n số kỳ vo ̣ng của kiể u gen PIT1-RsaI bằ ng phép kiể m đinh chi bı̀nh phương (χ2) cho thấ y tầ n số kiể u gen và tầ n số alen PIT1-RsaI ở tra ̣ng thái cân bằ ng theo đinh ̣ luâ ̣t Hardy-Weinberg Bảng Tầ n số kiể u gen và tầ n số alen của gen PIT1 đươ ̣c xác đinh ̣ bằ ng kỹ thuâ ̣t PCR-RFLP với enzyme RsaI Kiể u gen Alen Điạ điể m lấ y mẫu AA AB BB A B Bô ̣c nhiêu 16 Phú Đı̀nh 16 Phươ ̣ng Tiế n 2 14 Phúc Chu 13 Quy Kỳ 17 Tân Thinh 5 15 ̣ Tổ ng 35 21 91 29 Tầ n suấ t 0,58 0,35 0,067 0,76 0,24 Gen PIT1 có ảnh hưởng đế n khả sinh trưởng của lơ ̣n gen này có liên quan đế n mức đô ̣ tuầ n hoàn hoocmon sinh trưởng máu, thông qua mố i tương quan dương giữa PIT1alpha mARN và nồ ng đô ̣ hoocmon sinh trưởng huyế t tương (Stancekova et al., 1999) Với kế t quả phân tı́ch mố i tương quan của kiể u gen PIT1 với tro ̣ng lươ ̣ng cá thể Lơ ̣n đen quầ n thể Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa ở bảng cho thấ y: kiể u gen AA có tro ̣ng lươṇ g cao so với kiể u 16 gen AB, còn kiể u gen BB xuấ t hiê ̣n với tầ n suấ t rấ t thấ p và cũng có tro ̣ng lươ ̣ng thấ p so với kiể u gen AA Qua đó có thể kế t luâ ̣n rằ ng nhóm kiể u gen AA có tác đô ̣ng tıć h cực đế n tro ̣ng lươ ̣ng thể của Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa và đó alen A ảnh hưởng dương tı́nh lên tı́nh tra ̣ng tro ̣ng lươ ̣ng của lơ ̣n Kết phù hợp với kết luận Brunsch cộng (2002), cho allele A có đóng góp dương tất số đặc điểm thịt-thân thịt, khối lượng mỡ đặc điểm TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Công nghệ sinh học & Giống trồng hình thái khảo sát, đàn heo Pietrain x đực European Wild có kiểu gene AB cho số tính trạng nêu cao so với kiểu gen BB Quầ n thể Lơṇ đen Đinh ̣ Hóa cũng có đủ các kiể u gen đã đươc̣ công bố bởi Yu và cô ̣ng sự (1995) về gen PIT1 cắ t bởi enzyme RsaI Bảng Tro ̣ng lươ ̣ng của Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa có các kiể u gen PIT1-RsaI khác Kiể u gen PIT1-RsaI Các chı̉ tiêu AA AB BB Số lươ ̣ng mẫu 35 21 Tro ̣ng lươ ̣ng trung bı̀nh (kg) 51,17 45,43 38,50 KẾT LUẬN - Đã phân lâ ̣p, giải trı̀nh tự và đăng ký thành công trı̀nh tự nucleotide đoa ̣n gen PIT1 của giố ng Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa tı̉nh Thái Nguyên lên ngân hàng gen quố c tế với mã số MW167783 - Phân tı́ch đa da ̣ng di truyề n của gen PIT1 ở giố ng Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa cho thấ y: Đố i với gen PIT1-RsaI có 03 kiể u gen: AA có tầ n số là 0,58, AB có tầ n số là 0,35, BB rấ t hiế m quầ n thể và chı̉ chiế m 0,067 Tầ n số của alen A là 0,76 và alen B là 0,24 Trong đó, kiể u gen AA cho thấ y tro ̣ng lươ ̣ng trung bıǹ h của cá thể cao so với kiể u gen AB và BB TÀ I LIỆU THAM KHẢO Lê Thị Thu Hà, Nguyễn Thị Lệ Hằng, Lê Thị Thanh Tâm, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Thị Thu (2013) Ảnh hưởng đa hình gen PIT1 đến tính trạng suất gà tàu vàng Khoa học kỹ thuật chăn nuôi, số 6: 8-15 Lê Thị Thuý, Nguyễn Văn Hậu, Eiji Kobayshi, Mitsuzu Minezawwa (1999) Phân tích sai khác di truyền giống lợn nuôi Việt nam kỹ thuật di truyền phân tử PCR - RFLP Thông tin khoa học kỹ thuật chăn nuôi, Thông tin Viện chăn nuôi, 1999 Botstein D., White R L., Skolnick M., Davis R W (1980) Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms Amer J Hum Genet 32: 314 - 331 Brunsch C., Sternstein I., Reinecke P., Bieniek J (2002) Analysis of associations of PIT1 genotypes with growth, meat quality and carcass composition traits in pigs Journal of Applied Genetics 43 (1): 85-91 Franco MM., Antunes RC., Silva HD., Goulart LR., (2005) Association of PIT1, GH and GHRH polymorphisms with performance and carcass traits in Landrace pigs Journal of Applied Genetics 46 (2): 195200 Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., Vrijenhoek R (1994) DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates Molecular Marine Biology and Biotechnology (5): 294-299 Hall TA (1999) BioEdit: A User-Friendly Biological Sequence Alignment Editor and Analysis Program for Windows 95/98/NT Nucleic Acids Symposium Series 41: 95-98 Kumar S., Stecher G., Tamura K (2015) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729 Nie QH., Fang MX., Xie L., Zhou M., Liang ZM., Luo ZP., Wang GH., Bi WS., Liang CJ., Zhang W., Zhang XQ (2008) The PIT1 gene polymorphisms were associated with chiken growth traits BMC Genetic 9: 20-24 10 Pierzchala M., Blicharski T and Kuryl J (2003) Growth rate and carcass quality in pigs as related to genotype at loci POU1F1/RsaI (PIT1/RsaI) and GHRH/AluI Animal Science Papers and Reports 21 (3): 159-166 11 Renaville R., Gengler N., Parmentier I (1997) PIT – gene HinfI RFLP and growth traits in double – muscled Belgian Blue cattle Journal of Animal Science 75 12 Song CY., Gao B., Teng Y., Wang XY (2005) MspI polymorphisms in the 3rd intron of the swine POU1F1 gene and their associations with growth performance Journal of Applied Genetics 46: 285 – 289 13 Song CY., Gao B., Teng SH., Wang XY., Xie F., Chen GH., Wang ZY., Jing RB., Mao JD (2007) Polymorphisms in intron of the porcine POU1F1 gene Journal of Applied Genetics 48 (4): 371-374 14 Stancekova K., Vasicek D., Peskovicova D., Bulla J., Kubek A (1999) Effect of genetic variability of the porcine pituitary-specific transcription factor (PIT-1) on carcas traits in pigs Animal Genetics 30 (4): 313-315 15 Yu TP., Schmitz CB., Rothschild MF., Tuggle CK (1994) Expression pattern, genomic cloning and RFLP analyses of the swine PIT – gene Animal Genetics 25 (4): 229-233 16 Yu TP., Tuggle CK., Schmitz CB., Rothschild MF (1995) Association of PIT1 Polymorphisms with Growth and Carcass Traits in pigs Journal of Animal Science 73 (5): 1282-1288 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 17 Công nghệ sinh học & Giống trồng GENETIC POLYMORPHIMSM ANALYSIS OF PIT1 (POU1F1) GENE IN DINH HOA BLACK PIGS IN THAI NGUYEN PROVINCE Ha Bich Hong1, Bui Van Thang1, Nguyen Thi Van Anh1, Nguyen Thi Bich Nga2 Tran Viet Vinh2, Tran Thao Van2, La Van Cong3 Vietnam National University of Forestry Thao Van Agriculture Development Limited Liability Company Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry SUMMARY Dinh Hoa black Pig variety of Thai Nguyen province is a breed of a small pig, with fragrant and delicious meat This is also an endemic pig breed in Thai Nguyen province However, because the Pigs are small and freely raised, the number of Dinh Hoa Black Pigs is significantly reduced, especially the thoroughbred black Pigs For the purpose of managing, preserving and developing this endemic black Pig breed, we conducted research on genetic polymorphism analysis of PIT1 (POU1F1) gene from 60 tissue samples (ear tissue) of 60 individuals of Dinh Hoa black Pig, Thai Nguyen province The results showed that the PIT1 gene fragment was successfully amplified in all studied black Pigs, the size of the fragment was 1745 bp, the PIT1 nucleotide sequence of Dinh Hoa black Pig was published on international gene bank with accession number MW167783 Besides, analysis of PIT1 gene polymorphism in Dinh Hoa black Pig population in Dinh Hoa district, Thai Nguyen province by PCR-RFLP method showed that for PIT1-RsaI gene, there are 03 genotypes: AA with the highest frequency (58%), AB accounts for 35%, and BB is very rare in the population and accounts for only 6.7% The frequency of allele A is 0.76 and allele B is 0.24 Among them, genotype AA showed a higher average weight of the individual than the genotypes AB and BB This result initially assessed the correlation between the genotype of PIT1 gene with body weight traits Dinh Hoa black Pig is a breed with high potential for productivity and the ability to expand the population when choosing mating pairs with the right genotype Key words: Dinh Hoa Black Pigs, genetic polymorphism, PCR-RFLP, PIT1 Ngày nhận Ngày phản biện Ngày định đăng 18 : 21/12/2020 : 19/01/2021 : 01/02/2021 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 ... vùng gen PIT1 (POU1F1) và sử du ̣ng chı̉ thi ̣ phân tử PCRRFLP để phân tı́ch mức đô ̣ đa hı̀nh gen PIT1 quầ n thể Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa ta ̣i huyê ̣n Đinh ̣ Hóa, tın̉ h Thái Nguyên. .. Lợn đen của huyê ̣n Đinh ̣ Hóa tı̉nh Thái Nguyên Kết tách chiết ADN tổng số từ 06 mẫu tai đa ̣i di? ? ̣n cho 06 cá thể Lợn đen Đinh ̣ Hóa ta ̣i 06 xã của huyê ̣n Đinh ̣ Hóa, tı̉nh Thái Nguyên. .. đoa ̣n gen PIT1 của giố ng Lơ ̣n đen Đinh ̣ Hóa đa? ? đươ ̣c đăng ký bản quyề n lên ngân hàng gen quố c tế (NCBI) với mã sớ MW167783 Dựa kết so sánh trình tự đoạn gen PIT1 Lợn đen Định