Vi khuẩn nội sinh (VKNS) khu trú ở các khoảng gian bào trong các mô thực vật khác nhau mà không gây tổn thương. Nghiên cứu này nhằm tuyển chọn các chủng VKNS từ cỏ Mần Trầu (Eleusine indica) có khả năng đối kháng với vi nấm A. alternata gây bệnh thối ngọn cành (TNC) trên thanh long.
VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 37, No (2021) 60-69 Original Article Antagonic Activity of Endophytic Bacteria Isolated from Man Trau Grass on Stem Rot Disease Of Pitaya (Hylocereus Undatus) Do Quang Trung1,*, Nguyen Thi Thu Hang2, Dinh Mai Van2, Pham Bich Ngoc3, Tran Thi Hang2, Luu The Anh1, Phi Quyet Tien3 VNU University of Science,19 Le Thanh Tong, Hoan Kiem, Ha Noi Vietnam National University of Forestry, Xuan Mai, Chuong My, Ha Noi Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Ha Noi Received September 2020 Revised 15 April 2021; Accepted 24 June 2021 Abstract: Endophytic bacteria reside in the intercellular spaces in different plant tissues without causing damage This study aimed to select endophytic bacterial strains from Man Trau grass (Eleusine indica) that are able to inbibit the fungus A alternata causing stem rot disease on pitaya The result showed that one fungal isolate was pathogenic and caused stem rot disease on dragonfruit The analysis results based on morphological characteristics and ITS region sequence indicated that the isolated fungal strain is 100% identical to A alternata In addition, a total of 16 endophytic bacterial strains were isolated from Man Trau grass samples in Binh Thuan and screened for antifungal activity Ten bacterial strains with antagonistic activity against A alternata causing stem rot disease on pitaya were detected Among those, strain MT47 showed the strongest antifungal activity with an efficiency of 36.67% Moreover, the result also presented that the antagonistic strain MT47 pocesses the ability of biofilm formation significantly higher than the control The results suggest that these endophytic bacteria can be used in biocontrol of the stem rot disease on pitaya Keywords: Stem rot disease, Hylocereus undatus, Eleusine indica, Alternaria alternata, biofilm *Corresponding author Email address: trungcnsinh@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.5020 60 D.Q Trung et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 37, No (2021) 60-69 61 Khả đối kháng vi khuẩn nội sinh từ cỏ Mần Trầu với vi nấm gây bệnh thối cành long (Hylocereus undatus) Đỗ Quang Trung 1,*, Nguyễn Thị Thu Hằng 2, Đinh Mai Vân2, Phạm Bích Ngọc3, Trần Thị Hằng2, Lưu Thế Anh1, Phí Quyết Tiến3 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, 19 Lê Thánh Tơng, Hồn Kiế, Hà Nội Trường Đại học Lâm nghiệp, Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam,18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Nhận ngày xx tháng xx năm xxxx (Cỡ chữ: 10) Chỉnh sửa ngày xx tháng xx năm xxxx; Chấp nhận đăng ngày xx tháng xx năm xxxx Tóm tắt: Vi khuẩn nội sinh (VKNS) khu trú khoảng gian bào mô thực vật khác mà không gây tổn thương Nghiên cứu nhằm tuyển chọn chủng VKNS từ cỏ Mần Trầu (Eleusine indica) có khả đối kháng với vi nấm A alternata gây bệnh thối cành (TNC) long Kết phân lập chọn 01 chủng vi nấm gây nhiễm bệnh TNC long Dựa đặc điểm hình thái trình tự vùng ITS cho thấy chủng vi nấm 100% tương đồng với A alternata Về VKNS, đề tài phân lập sàng lọc 16 chủng VKNS từ mẫu cỏ Mần Trầu thu Bình Thuận Trong đó, có 10 chủng đối kháng với A alternata gây bệnh TNC long Chủng MT47 cho kết đối kháng tốt với hiệu suất đối kháng 32,24% Kết cho thấy khả tạo màng sinh học chủng VKNS kháng nấm (MT47) cao nhiều so với đối chứng Các kết cho thấy chủng VKNS có tiềm ứng dụng kiểm soát sinh học nấm A alternata gây bệnh long Từ khóa: bệnh thối cành, Thanh Long, cỏ Mần Trầu, Alternaria alternata, màng sinh học Mở đầu* Ở Việt Nam, phần lớn long trồng lồi Hylocereus undatus, có đặc điểm vỏ đỏ hay hồng ruột trắng ruột đỏ Quả long loại trái phổ biến, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe người, chúng chứa hàm lượng natri, kali vitamin A cao; tổng hàm lượng chất rắn lên tới 16,6% [1] Với ưu điều kiện đất đai khí hậu kinh nghiệm canh tác, long trồng chiếm vị trí quan trọng ngành trồng ăn theo hướng xuất Việt Nam *Tác giả liên hệ Email address: trungcnsinh@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.5020 Tuy nhiên nay, tình hình dịch bệnh long diễn nghiêm trọng, đáng ý bệnh thối cành (TNC) Bệnh TNC nấm A alternata gây Bệnh thường xuất quanh năm, đặc biệt vào điều kiện nhiệt độ, độ ẩm cao vào đầu mùa mưa Ngọn cành hay đầu cành long bị bệnh chuyển sang màu vàng, mềm sau bị thối Bệnh thối khiến bị chết, cành không phát triển, ảnh hưởng đến phát triển long Đặc biệt, bệnh xảy đất phèn (đất thấp) mà cịn đất cao Đã có số cơng trình nghiên cứu nhằm kiểm sốt mầm bệnh long 62 D.Q Trung et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 37, No (2021) 60-69 phương pháp vật lý hóa học [2-3] Tuy nhiên, phương pháp tồn số hạn chế áp dụng phạm vi nhỏ, nhiều ảnh hưởng đến chất lượng mức độ an toàn long Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng giải pháp phòng trừ sâu bệnh biện pháp sinh học lựa chọn ưu tiên chiến lược phát triển sản xuất long nhằm đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm xuất sang thị trường khó tính Mỹ, Châu Âu nước khác Trong đó, sử dụng vi khuẩn nội sinh (VKNS) với vai trị tác nhân sinh học để kiểm sốt bệnh (trong có bệnh thối cành) hướng nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn, đáp ứng yêu cầu sản phẩm an toàn để xuất khẩu, tiêu dùng nước, góp phần hạn chế sử dụng hóa chất sản xuất nơng nghiệp VKNS khu trú khoảng gian bào mô thực vật khác mà không gây tổn thương Chúng thường xâm nhập vào thân rễ tận dụng vị trí vết thương xâm nhập vào mô bên thông qua lỗ mở gốc rễ bên, tế bào biểu bì lơng rễ Ứng dụng vi khuẩn nội sinh để ngăn chặn dịch bệnh (kiểm soát sinh học) cách tiếp cận thân thiện với môi trường [4-7] sản xuất nông nghiệp bền vững Ví dụ, VKNS chất chuyển hóa chúng phát có tiềm đầy hứa hẹn việc kiểm soát mầm bệnh bệnh tật nho [8] Những vi khuẩn tác nhân tốt chế bảo vệ thực vật bên cạnh việc gây tác động đối kháng trực tiếp với nấm bệnh vi khuẩn Đề kháng toàn thân cảm ứng (ISR) tạo gen khác để tạo miễn dịch cho trồng mặt chuyển hóa học cách thay đổi sinh lý vật chủ phản ứng trao đổi chất, tăng sức bền thành tế bào tăng cường tổng hợp hóa chất bảo vệ thực vật [9] Các chất chuyển hóa thứ cấp cứu vật chủ khỏi công mầm bệnh tương lai [9] Bằng cách kết hợp sinh vật thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGP) với vi sinh vật nội sinh đối kháng với mầm bệnh, chiến lược kiểm soát sinh học tồn diện phát triển Trên giới, có nghiên cứu tìm chủng VKNS từ số loài cỏ dại mọc tự nhiên ruộng trồng long có khả ức chế bệnh đốm nâu long có khả kích thích sinh trưởng phát triển long [10] Tuy nhiên, Việt Nam việc khai thác loài vi sinh vật nội sinh từ cỏ dại nhiều hạn chế chưa quan tâm Vì vậy, nghiên cứu chúng tơi sử dụng loài cỏ Mầu Trầu (Eleusine indica) dại mọc địa điểm trồng long để phân lập tuyển chọn chủng VKNS có khả ức chế nấm A alternata gây bệnh thối cành long Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Chủng VKNS phân lập từ mẫu cỏ Mần trầu mọc hoang vườn vườn long huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận Chủng vi nấm A alternata gây bệnh thối cành long phân lập từ mẫu long bị bệnh huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận 2.1.2 Mơi trường sử dụng nghiên cứu Môi trường phân lập, nuôi cấy A alternata thử nghiệm đối kháng: PDA (Potato Glucose Agar): potato 200 g/l, D – glucose 20 g/l, agar: 20 g/l, nước cất vừa đủ 1l Môi trường phân lập nuôi cấy VKNS: LB (Luria – Bertani): tryptone: 10 g, cao nấm men: g, NaCl: g, nước cất vừa đủ: 1l, môi trường thạch bổ sung agar: 15 g/l Các môi trường hấp khử trùng 121oC, 15 phút trước sử dụng 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập, làm nấm gây bệnh TNC Phân lập, làm nấm gây bệnh TNC theo phương pháp Meena cộng [11] Chọn D.Q Trung et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 37, No (2021) 60-69 mô thực vật bị bệnh để phân lập, rửa mẫu nước để loại bỏ bụi tạp chất khác Khử trùng bề mặt sodium hypochloride 1% phút sau rửa lại lần với nước cất vô trùng Dùng dụng cụ khử trùng cắt miếng nhỏ (khoảng 2x2 mm) từ phần ranh giới mơ khỏe mơ bệnh, sau cấy lên môi trường PDA, ủ 25oC-28oC tối Kiểm tra đĩa cấy ngày, tản nấm phát triển từ mẫu nhiễm bệnh, cấy truyền chúng sang môi trường PDA 2.2.2 Phương pháp định danh nấm gây bệnh TNC Các chủng nấm định danh sơ mô tả Meena cs [11] Sau định danh hình thái sinh hóa thử nghiệm đối kháng, chủng nấm định danh đến loài phương pháp giải trình tự vùng ITS – rDNA: Tách chiết gen vi nấm kit QIAgen, khuếch đại trình tự phản ứng PCR với cặp mồi có trình tự sau ITS1 (3’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-5’) ITS4 (3’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-5’) Phản ứng PCR thực ống PCR 0,1 ml có chứa: 25 µl 2X Taq Master Mix (Biobasic Canada); loại mồi nồng độ 10 µM: 1,5 µL; 11 µL nước cất (dH2O) µL DNA từ nấm Phản ứng PCR gồm 35 chu kì bao gồm giai đoạn tiền biến tính: 950C phút; giai đoạn biến tính 95oC 30 giây; giai đoạn bắt cặp mồi: 58oC phút; giai đoạn kéo dài đoạn khuếch đại: 72oC phút giai đoạn kéo dài cuối: 72oC 10 phút Các sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% dung dịch TBE 1X Sử dụng 10 µL sản phẩm cho vào giếng Chạy điện di với hiệu điện 100 V 25 phút Kết điện di quan sát máy chụp ảnh gel (Bio-Rad, Hoa Kì) Đoạn khuếch đại PCR vùng ITS mẫu nấm gửi giải trình tự hãng First Base (The Gemini, Singapore Science Park II, Singapore) Các trình tự nucleotide hồn chỉnh so sánh với ngân hàng liệu GenBank NCBI cách sử dụng công cụ BLAST 63 2.2.3 Phương pháp thử nghiệm khả gây bệnh chủng A alternata phân lập Nuôi cấy nấm bệnh A alternata môi trường PDA (ủ tối 25oC-28oC) khoảng 47 ngày, sau hịa tan bào tử đưa mật độ 105 CFU/ml Sử dụng kim tiêm vô trùng tiêm 100 μl dịch treo bào tử (105 CFU/ml) vào cành long (H undatus) khỏe mạnh Nghiệm thức đối chứng tiêm nước cất vô trùng Tất mẫu đoạn cành long sau tiêm đặt hộp nhựa kín 25oC-28oC, ủ điều kiện tối [12] Mỗi thí nghiệm sử dụng đoạn cành long cho lần lặp Mỗi cơng thức thí nghiệm lặp lại lần - Ghi nhận kết quả: Quan sát ngày đánh giá biểu bệnh đoạn thân gây bệnh so sánh đặc điểm bệnh tự nhiên Chọn mẫu nấm có khả gây bệnh tương tự mơ tả ngồi tự nhiên để tiếp tục nghiên cứu Tính tỉ lệ gây bệnh: TLB (%) = Số đoạn thân bệnh/tổng số đoạn thân x 100 2.2.4 Phân lập VKNS từ cỏ Mần Trầu Rễ, chồi, cắt thành mảnh nhỏ có kích thước × mm lưỡi dao vơ trùng luồng khơng khí Các mảnh đặt đĩa thạch LB bổ sung chất chống nấm (bavistin, 30μg/mL) ủ 2-4 ngày 37oC Sau ủ, khuẩn lạc vi khuẩn hình thái khác lựa chọn cấy sang đĩa để có khuẩn lạc phân lập Các vi khuẩn phân lập nghiên cứu cho đặc tính gram hóa sinh chúng 2.2.5 Phương pháp khảo sát khả đối kháng với nấm bệnh A alternata Sử dụng phương pháp đối kháng trực tiếp [13] phương pháp khuếch tán qua đĩa thạch [14-15] để khảo sát đặc tính đối kháng với vi nấm gây bệnh TNC Thanh long Với phương pháp đối kháng trực tiếp đánh giá khả đối kháng thông qua hiệu ức chế (%) sau H = (Ddc – D)/ Ddc x 100, theo dõi sau ngày thử nghiệm Trong đó: H: Hiệu ức chế (%); D: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh 64 D.Q Trung et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 37, No (2021) 60-69 trung bình đĩa đối kháng; Ddc: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình đĩa đối chứng Với phương pháp khuếch tán qua đĩa thạch đánh giá khả đối kháng sau ngày thử nghiệm đánh giá thơng qua kích thước vòng đối kháng (vòng tròn suốt bao quanh khuẩn lạc), tính mm theo cơng thức: Kích thước vịng đối kháng = D – d Trong đó: D (mm) đường kính vịng đối kháng; d (mm) đường kính khuẩn lạc Thí nghiệm lặp lại lần chủng vi khuẩn cần chọn lọc, kết giá trị trung bình cộng lần lặp lại 2.2.6 Phương pháp đánh giá khả tạo màng sinh vật chủng vi sinh vật [16] Các chủng vi khuẩn lựa chọn nuôi lắc (200 vịng/phút) riêng rẽ ống nghiệm chứa 10ml mơi trường LB lỏng tủ lắc ổn nhiệt 30oC Ống nghiệm chứa môi trường LB lỏng dùng làm đối chứng Sau ngày nuôi cấy, hút 1ml dịch vi khuẩn vào ống eppendorf khử trùng ủ tủ lắc ổn nhiệt 30oC, tốc độ 200 vịng/phút Sau ngày tiếp theo, dịch ni cấy chuyển sang ống eppendorf khác để xác định mật độ tế bào cách đo mật độ quang học λ = 600 (OD600) Ống eppendorf (sau hút hết dịch nuôi cấy bước 3) rửa lần nước cất khử trùng Sau ống eppendorf bổ sung 1ml dung dịch tím kết tinh % giữ 20 phút nhiệt độ phịng Dung dịch nhuộm tím kết tinh sau loại bỏ, rửa lần nước cất quan sát bắt màu tế bào bám thành ống với tím kết tinh 2.2.7 Phương pháp xử lí số liệu Các số liệu thí nghiệm đánh giá phương pháp thống kê phân tích biến lượng (Analysis of Variance, ANOVA), so sánh trung bình theo phương pháp trắc nghiệm Ducan Các số liệu ghi nhận xử lí Excel phần mềm Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) phiên 19 Kết thảo luận 3.1 Phân lập sàng lọc chủng vi nấm A alternata Từ mẫu long bệnh thu tiến hành phân lập A alternata môi trường PDA lựa chọn dịng có đặc tính vi nấm A alternata theo mô tả Meena cs [11] như: Tản nấm có màu xám đen đến nâu đen (Hình 1A), mặt sau tản nấm có màu đen, có vịng đồng tâm (Hình 1B) Sợi nấm phân nhánh có màu nâu đến nâu đậm, vươn cao bơng gịn bề mặt mơi trường (Hình 1A) Quan sát kính hiển vi quang học cho thấy sợi nấm phân nhánh có vách ngăn (Hình 1C 1F) Bào tử hình chữ nhật, hình bầu dục hình que (Hình 1C, 1D 1E) Kết thí nghiệm chọn chủng TNC1 mang đặc điểm Alternaria alternata Hình Đặc điểm hình thái vi nấm A alternata sau ngày nuôi môi trường PDA Khuẩn lạc vi nấm mặt trước (A) mặt sau (B); C-F: Sợi nấm bào tử quan sát vật kính x100 Thanh tỷ lệ: A, B: cm; C-F: 20 µm Chủng vi nấm sau định danh hình thái lựa chọn tiếp tục định danh đến loài phương pháp giải trình tự vùng ITS – rDNA Kết PCR minh họa Hình Kết cho thấy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 600 bp, kích thước đoạn gen ITS PCR cặp mồi ITS1 ITS4 D.Q Trung et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 37, No (2021) 60-69 65 Bảng Tóm tắt kết định danh chủng vi nấm TNC1 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR M: thang chuẩn DNA; TNC1: sản phẩm PCR mẫu nấm; ĐC: đối chứng âm Vùng trình tự sau khuếch đại gửi giải trình tự Cơng ty 1st Base (Singapore) (Bảng 1) so sánh độ tương đồng di truyền với loài ngân hàng gen NCBI cơng cụ BLAST (Bảng 2) Bảng Trình tự đoạn gen ITS chủng vi nấm TNC1 AAGAAAGGAAGGCGGGCTGGAATCTCT CGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCA CCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCC TTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAA ACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGC GTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTT CTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCA TCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT AAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGA ATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCG CCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTG TTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTT GCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCT TTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTG GCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCA GCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAG GTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTCCAC TTTTGACCTCGGATCAGGTACGGATACC CGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGG AGGAA Dựa kết phân tích trình tự chủng tuyển chọn xác định chủng phân lập có độ tương đồng 100% với chủng nấm A alternata (Bảng 2) Tên chủng Điểm đạt cao Tổng điểm Tỷ lệ trùng lặp Mã số NCBI Alternaria alternata strain YZU 874 874 100% MN822 486.1 3.2 Khả gây bệnh chủng Alternaria alternata Chủng nấm bệnh sau định danh tiến hành thử nghiệm khả gây bệnh cành long Tiến hành thí nghiệm quan sát thời điểm cho thấy: Với nghiệm thức tiêm nấm bệnh, 6-7 ngày sau tiêm số vị trí tiêm nấm bệnh thân bắt đầu xuất đốm bệnh màu vàng tương tự với mô tả bệnh thối cành Đến thời điểm sau tuần gần mẫu thân nấm bệnh có biểu bệnh (Hình 3B) Trong đó, nghiệm thức đối chứng không quan sát thấy tượng nhiễm bệnh sau tuần tiêm (Hình 3A) A B Hình Cành long sau lây nhiễm A: Cành long nghiệm thức tiêm nước cất vô trùng (sau tuần); B: Triệu chứng bệnh xuất cành long sau tiêm vi nấm TNC1 sau tuần Tiến hành xác định tỉ lệ bệnh nghiệm thức sau tuần tuần theo dõi thu kết Bảng 66 D.Q Trung et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 37, No (2021) 60-69 Bảng Tỉ lệ bệnh cành long theo thời gian sau lây nhiễm A alternata Nghiệm thức Đối chứng TNC1 Tỉ lệ bệnh đoạn cành long (%) Sau tuần 0,00 ± 0,00a 60,32 ± 4,72b Sau tuần 0,00 ± 0,00a 92,23 ± 2,41b Các ký tự khác theo sau giá trị trung bình thể khác biệt mặt thống kê (p