Bài viết trình bày việc sàng lọc các hợp chất có tác dụng ức chế enzym PTP1B trong cây mướp đắng bằng phương pháp docking phân tử nhằm tìm kiếm hợp chất có thể phát triển thành thuốc để điều trị bệnh đái tháo đường.
VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 37, No (2021) 39-49 Original Article Evaluating Protein Tyrosine Phosphatase 1B Inhibitory Activity of Bioactive Compounds from Momordica charantia for Diabetes Treatment Type by using Molecular Docking Method Nguyen Hong Nhung1, Ta Thi Thu Hang1, Vu Khanh Linh1, Nguyen Bao Kim1, Pham The Hai2, Phan Hong Minh1, Bui Thanh Tung1,* VNU University of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Hanoi University of Pharmacy, 13-15 Le Thanh Tong, Hoan Kiem, Hanoi, Vietnam Received 16 March 2021 Revised 22 March 2021; Accepted 22 March 2021 Abstract: Diabetes mellitus is a chronic metabolic disease, which is characterized by elevated blood glucose levels, caused by a deficiency in insulin secretion from the β pancreatic’s cells or the operability of insulin The protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) catalyzes to removing the phosphate group from the insulin receptor's phosphotyrosine, then reducing insulin’s effects Therefore, inhibiting this enzyme is an effective method to treat diabetes mellitus Momordica charantia is effective in the treatment of diabetes mellitus In this study, we evaluated the inhibitory effects of PTP1B enzyme of Momordica charantia’s compounds by using molecular docking method Based on the previous publication of Momordica charantia, we have collected 57 compounds The results showed that compounds have PTP1B inhibitory effect stronger than the positive control including Luteolin-7-O-glycoside, apigenin-7-O-glycoside and δ-cadinene Analysis Lipinski Rule of Five showed that Luteolin-7-O-glycoside and δ-cadinene have druglikeness properties Moreover, predict ADMET showed that these two compounds have good intestinal absorption, not metabolized in the liver, excretion by the kidney and low toxicity Conclusion: Our findings suggested that luteolin-7-O-glycoside, δ-cadinene may be potential natural product compounds for diabetes treatment type Keywords: Momordica charantia, PTP1B, Diabetes mellitus, Molecular docking, in silico * Corresponding author E-mail address: tungasia82@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4298 39 N.H Nhung et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 37, No (2021) 39-49 40 Đánh giá hợp chất ức chế enzym Protein tyrosin phosphatase 1B nhằm điều trị bệnh đái tháo đường tuýp từ Mướp đắng phương pháp docking phân tử Nguyễn Hồng Nhung1, Tạ Thị Thu Hằng1, Vũ Khánh Linh1, Nguyễn Bảo Kim1, Phạm Thế Hải2, Phan Hồng Minh1, Bùi Thanh Tùng1,* Trường Đại Học Y Dược, Đại Học Quốc Gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Trường Đại Học Dược Hà Nội, 13-15 Lê Thánh Tơng, Hồn Kiếm, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 16 tháng năm 2021 Chỉnh sửa ngày 22 tháng năm 2021; Chấp nhận đăng ngày 22 tháng năm 2021 Tóm tắt: Đái tháo đường bệnh rối loạn chuyển hóa, đặc trưng nồng độ glucose máu tăng cao, nguyên nhân thiếu hụt tiết insulin từ tế bào β đảo tụy khả hoạt động insulin bị suy giảm Protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B) xúc tác trình loại bỏ nhóm phosphate từ phosphotyrosin thụ thể insulin làm giảm tác dụng insulin tới mơ đích Vì vậy, ức chế enzym phương pháp hiệu để điều trị bệnh đái tháo đường tuýp Cây mướp đắng (Momordica charantia) chứng minh có tác dụng điều trị bệnh đái tháo đường Trong nghiên cứu này, sàng lọc hợp chất có tác dụng ức chế enzym PTP1B mướp đắng phương pháp docking phân tử nhằm tìm kiếm hợp chất phát triển thành thuốc để điều trị bệnh đái tháo đường Dựa công bố trước mướp đắng, thu thập 57 hợp chất Kết cho thấy có hợp chất có tác dụng ức chế PTP1B mạnh luteolin-7-O-glycoside, apigenin-7-O-glycoside δ-cadinene Phân tích quy tắc tiêu chí Lipinski cho thấy hợp chất có đặc tính giống thuốc luteolin-7-O-glycoside δ-cadinene Ngồi ra, kết dự đốn thơng số dược động học cho thấy hợp chất có khả hấp thu ruột tốt, khơng bị chuyển hóa qua gan, thải trừ qua thận độc tính thấp Kết luận: hợp chất luteolin7-O-glycoside, δ-cadinene mướp đắng hợp chất tiềm phát triển thành thuốc điều trị bệnh đái tháo đường Từ khóa: Mướp đắng, PTP1 B, Đái tháo đường, Docking phân tử, in silico Mở đầu* Đái tháo đường bệnh chuyển hóa mãn tính, đặc trưng nồng độ glucose máu tăng cao, theo thời gian, dẫn đến tổn thương nghiêm trọng cho tim, mạch máu, mắt, thận thần kinh Bệnh đái tháo đường tuýp xảy thể trở nên đề kháng với insulin không tổng hợp đủ insulin Tỷ lệ mắc bệnh đái tháo * Tác giả liên hệ Địa email: tungasia82@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4298 đường typ tăng đáng kể quốc gia ba thập kỷ qua [1] Theo Hiệp hội đái tháo đường quốc tế, khoảng 463 triệu người trưởng thành (20-79 tuổi) mắc bệnh đái tháo đường khoảng 4,2 triệu người chết bệnh đái tháo đường biến chứng vào năm 2019 [2] Tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường Việt Nam vào năm 2017 khoảng 5,76 triệu người chiếm xấp xỉ 6% dân số [3] N.H Nhung et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 37, No (2021) 39-49 PTP1B biểu nhiều mô khác mô gan, não, mô PTP1B liên quan đến bệnh béo phì đái tháo đường PTP1B xúc tác q trình loại bỏ nhóm phosphate từ phosphotyrosin thụ thể insulin làm giảm tác động insulin tới mơ đích [4] Ngồi ra, PT1B cịn tham gia vào điều hịa âm tính đường tín hiệu leptin gây trạng thái béo phì rối loạn chuyển hóa [4] Những nghiên cứu gần biểu mức PTP1B bệnh nhân mắc đái tháo đường béo phì [5] Do ức chế enzym PTP1B khơng giúp tăng hoạt động insulin mà giúp làm giảm tình trạng béo phì, yếu tố nguy quan trọng bệnh đái tháo đường [6] Cây mướp đắng có tên khoa học Momordica charantia, thuộc họ Cucurbitaceae (bầu bí), phân bố rộng rãi vùng nhiệt đới cận nhiệt giới Quả mướp đắng dùng loại rau vị thuốc để điều trị bệnh đái tháo đường y học dân gian Mướp đắng có tác dụng dược lý chứng minh kháng khuẩn, tẩy giun sán, điều hịa miễn dịch, chống oxy hóa, thuốc chống ung thư viêm, hoạt động bảo vệ gan có tác dụng bệnh đái tháo đường [7] Một nghiên cứu cho thấy momordicin, hợp chất mướp đắng, có tác dụng ức chế α-amylase với IC50 15,86 μg/ml [8] Ngoài ra, hợp chất chiết xuất từ mướp đắng cịn có tác dụng ức chế trình tạo glucose (gluconeogenesis) phân giải glycogen (glycogenolysis) bảo vệ tế bào β tuyến tụy [9] Docking phân tử kỹ thuật mơ hình hóa với mục đích dự đốn vị trí cấu hình mà phân tử chất (ligand) liên kết với phân tử protein (target) Phân tử chất cho dịch chuyển không gian bao quanh phân tử protein để tìm vị trí có lượng liên kết tự thấp sử dụng hàm đánh giá phương pháp tìm kiếm cực trị tồn cục khác Từ tìm hợp chất có tác dụng ức chế protein [10] Phương pháp docking phân tử gcó ưu điểm tiết kiệm thời gian chi phí việc sàng lọc hợp chất so với phương pháp thực nghiệm [11] Mục tiêu nghiên cứu sàng lọc hợp chất có tác 41 dụng ức chế enzym PTP1B mướp đắng phương pháp docking phân tử nhằm tìm kiếm hợp chất phát triển thành thuốc để điều trị bệnh đái tháo đường Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Mơ hình docking Chuẩn bị cấu trúc protein: cấu trúc đồng kết tinh phức hợp protein tyrosin protease 1B axit 4-bromo-3-(carboxymethoxy)-5-[3(cyclohexylamino)phenyl]thiophene-2-carboxylic (pdb file) download từ Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/) với ID: 2QBS Quá trình chuẩn bị thực bước: loại bỏ phân tử nước, tách cấu trúc đồng tinh thể khỏi protein Chuẩn bị cấu trúc chất docking: cấu trúc chất docking thu thập từ tài liệu thành phần hóa học mướp đắng cấu trúc lấy từ sở liệu PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) Sau đó, chúng gắn trường lực tối ưu hóa lượng sử dụng phần mềm Avogadro Thực docking phân tử: chất dock vào trung tâm hoạt động protein phần mềm Autodock vina Đánh giá kết docking: để đánh giá kết trình docking, chất đồng tinh thể re-dock lại vào vị trí hoạt động mục tiêu Quá trình thực thành cơng giá trị độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) nhỏ 1.5 Å Đối với chất cần docking, khả gắn kết chúng đánh giá thông qua tương tác với axit amin hốc phản ứng lượng tương tác tính hàm tính điểm (scoring function) Autodock vina 2.2 Đánh giá quy tắc tiêu chí Lipinski Quy tắc tiêu chí Lipinski sử dụng để đánh giá khả đặc tính giống thuốc khơng giống thuốc hợp chất [12] Chúng sử dụng công cụ online (http://www.scfbioiitd.res.in/software/drugdesign/lipinski.jsp) để đánh giá quy tắc tiêu chí Lipinski [13] 42 N.H Nhung et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 37, No (2021) 39-49 2.3 Dự đốn thơng số dược động học Kết dự đốn thơng số dược động học bao gồm hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ độc tính (ADMET) hợp chất tiềm phân tích qua cơng cụ pkCSM [14] (http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/prediction) Kết 3.1 Chuẩn bị cấu trúc chất docking Dựa cơng bố trước đây, nhóm nghiên cứu tập hợp 57 hợp chất có khả ức chế PTP1B từ mướp đắng [7, 15-17] Các hợp chất vẽ cấu trúc 2D phần mềm Chemdraw 18.0 sau chuyển sang cấu trúc 3D phần mềm Avogadro lấy từ sở liệu PubChem định dạng sdf sau chuyển thành định dạng pdb phần mềm Chimera Tiếp theo, chất docking tối ưu hóa phần mềm Avogadro sử dụng phương pháp Gradient liên hợp (Conjugate Gradients) chuyển thành định dạng pdbqt phần mềm Autodock Tools 3.2 Chuẩn bị protein Cấu trúc tinh thể phức hợp chất ức chế PTP1B với ID: 2QBS thu thập từ ngân hàng liệu protein RCSB (www.rcsb.org) Trong phức hợp 2QBS chứa sẵn ligand đồng kết tinh 4-bromo-3-(carboxymethoxy)-5-[3(cyclohexylamino)phenyl] thiophene-2-carboxylic acid Sau tải từ ngân hàng RCSB, phân tử ligand đồng kết tinh phân tử nước tách khỏi phức hợp phần mềm Discovery Studio 2020 Client, nguyên tử hydro thêm vào trước tái lập vùng hoạt động enzym phần mềm MGL Autodock tools 1.5.6 Vùng hoạt động enzym bao bọc hộp lưới có kích thước 60Å×60Å×46Å, center x = 46.535, center y = 16.643, center z = 5.369 Sau lưu protein định dạng pdbqt để chuẩn bị cho trình docking (Hình 1) Hình Vùng hoạt động PTP1B 3.3 Đánh giá mơ hình docking Trước sàng lọc hợp chất, chất đồng kết tinh tách khỏi phức hợp 2QBS re-dock lại vào vị trí hoạt động mục tiêu để xác định độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) từ đánh giá tính phù hợp thông số docking Kết sau docking lại chất đồng tinh thể thu giá trị RMSD 0.616Å (Hình 2) Giá trị thỏa mãn điều kiện RMSD nhỏ 1.5 Å chứng tỏ kết docking phân tử vào mục tiêu đáng tin cậy Hình Kết re-dock chất đồng kết tinh N.H Nhung et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 37, No (2021) 39-49 Sự tương tác chất đồng kết tinh PTP1B thể Hình Từ hình ta thấy chất đồng kết tinh hình thành liên kết với nhiều axit amin như: liên kết -alkyl, 43 -σ với ALA217; liên kết hydro với TYR46, ASP181, GLN266; - với TYR46 liên kết với nhiều axit amin khác như: MET258, ARG221, LYS120 Hình Biểu diễn tương tác 2D ligand đồng kết tinh với PTP1B Bảng Kết docking phân tử hợp chất vào đích PTP1B với mức lượng liên kết tương ứng STT 10 11 12 13 14 15 Tên 3β-hydroxy-7β,25dimethoxycucurbita-5,23(E)diene 3β,25-dihydroxy-7βmethoxycucurbita5,23(E)diene 3β,7β,25-trihydroxycucurbita5,23(E)-dien-19-al 5β,19-epoxycucurbita6,23(E)-diene-3β,19,25-triol 5β,19-epoxy-19methoxycucurbita-6,23(E)diene-3β,25-diol Momordicine L Axit para-methoxybenzoic Karavilagennin A Kuguacin J Chanrantoside III Karaviloside I Goyaglycosde A Axit Gallic Axit protocatechuic Axit Gentistic Năng lượng liên kết (kcal/mol) STT Tên Năng lượng liên kết (kcal/mol) -5,7 30 Apigenin-7-Oglycoside -8,3 -6,1 31 Axit caffeic -6,9 -6,1 32 Naringenin-7-Oglycoside -7,9 -7,3 33 Charantin -7,4 -6,8 34 α-Pinene -5,1 6,8 -5,6 -5,9 -5,7 -7,2 -7,0 -5,9 -5,5 -5.7 -5,9 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 β-Pinene Octanal p-Cymene Limonene 1,8-Cineole β-Phellandrene Linalool cis-Dihydrocarveol trans-Dihydrocarveol Carvone -4,8 -4,2 -6,5 -6,4 -4,9 -6,4 -5,2 -6,3 -6,6 -6,5 44 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 N.H Nhung et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 37, No (2021) 39-49 (+)-catechin Axit vanillic Axit syringic (−)-Epicatchin Axit p-coumaric Axit benzoic Axit sinapinic Axit o-coumaric Axit chlorogenic Axit t-cinnamic Axit t-ferulic Axit ascorbic Axit 3-coumaric Luteolin-7-O-glycoside -7,5 -5,7 -5,5 -7,1 -6,0 -6,0 -5,8 -6,4 -7,2 -6,8 -6,8 -5,5 -7,1 -8,4 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 3.4 Sàng lọc chất ức chế PTP1B mướp đắng Sau chuẩn bị chất docking, tiến hành docking tồn 57 hợp chất có mướp đắng enzym PTP1B để tìm kiếm hợp chất có khả ức chế PTP1B Kết thu Bảng Chúng sử dụng trodusquemine (MSI-1436) chất chứng dương, chất dược chứng minh ức chế chọn lọc enzym PTP 1B với giá trị IC50 ∼1 µmol/l [18] So sánh lượng liên kết trodusquemine với 57 hợp chất, nhận thấy có 38/57 hợp chất có lượng liên kết tự với enzym thấp (E)-Anethole Safrole Methyl eugenol Germacrene D β-Selinene α-Selinene Myristecin δ-Cadinene trans-Nerolidol Spathulenol Cedrol β-Bisabolol Apiole Ligand đồng kết tinh Trodusquemine (chứng dương) -6,3 -6,8 -5,7 -6,3 -7,7 -7,7 -6,5 -8,1 -6,2 -6,0 -6,3 -6,3 -5,8 -8,1 -5,9 chất chứng dương Tuy nhiên chúng tơi lựa chọn hợp chất tối ưu luteolin-7-O-glycoside, apigenin-7-O-glycoside δ-Cadinene với lượng -8,4; -8,3 -8,1 kcal/mol Tương tác hợp chất với đích PTP1B biểu diễn 2D 3D Hình Khả liên kết với đích PTP1B phân tử có tương đồng với chất đồng tinh thể Điều thể qua khả liên kết với axit amin VAL49, TYR46, ARG221, đặc biệt liên kết -alkyl với ALA217 Ngồi ra, phân tử có tương tác -alkyl - với PHE182, lý mức lượng chất thấp so với chất đồng tinh thể a) Luteolin-7-O-glycoside N.H Nhung et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 37, No (2021) 39-49 45 b) Apigenin-7-O-glycoside c) δ-Cadinene Hình Sự tương tác phân tử Luteolin-7-O-glycoside (Hình 4a), Apigenin-7-O-glycoside (Hình 4b), δ-Cadinene (Hình 4c) với PTP1B biểu diễn 2D 3D Bảng Kết đánh giá quy tắc tiêu chí Lipinski STT Hợp chất Luteolin-7-Oglycoside Apigenin-7-Oglycoside δ-Cadinene Trọng lượng phân tử Nhóm cho liên kết hydrogen (HBD) Nhóm nhận liên kết hydrogen (HBA) logP Độ khúc xạ mol (MR) Hợp chất giống thuốc 448 11 -0,4017 105,209 Có 564 14 -1,6424 130,192 Khơng 312 -0,0531 77,1457 Có 46 N.H Nhung et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 37, No (2021) 39-49 3.6 Kết đánh giá quy tắc tiêu chí Lipinski tắc Lipinski Trong δ-cadinene thỏa mãn 5/5 điều kiện cho thấy đặc tính giống thuốc cao Do đó, chúng tơi tiếp tục đánh giá đặc tính dược động học bao gồm hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ độc tính hợp chất Kết đáp ứng quy tắc tiêu chí Lipinski hợp chất trình bày bảng Các hợp chất gọi “giống thuốc” chúng đáp ứng tiêu chí qui tắc Lipinski: i) Khối lượng phân tử 0,3) Đối với N.H Nhung et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 37, No (2021) 39-49 chuyển hóa, hệ cytochrome P450 hệ enzym quan trọng q trình chuyển hóa thuốc gan với hai CYP quan trọng CYP3A4 CYP2D6 Cả hai hợp chất không chất không ức chế hai enzym quan trọng này, chúng khơng bị chuyển hóa gan Ngồi ra, hai hợp chất có khả thải trừ qua thận δ-cadinene thải trừ nhanh lueotin-7-O-glycoside với Độ thải toàn phần (log ml/min/kg) 1,188 0,478 Về độc tính, hai hợp chất khơng có độc tính AMES, khơng có độc tính gan, δ-cadinene gây kích ứng da Bàn luận Trong nghiên cứu này, chúng tơi tìm kiếm hợp chất tìm thấy Mướp đắng Các nhóm hợp chất mướp đắng gồm saponin với phân nhóm tetracyclic triterpenoids, flavonoids, phenolic tinh dầu Các hợp chất polyphenol mướp đắng hợp chất thân nước có chứa nhiều nhóm hydroxyl axit gallic, catehcin, axit chlorogenic, epicatechin, axit protocatechuic, axit p-coumaric, axit o-coumaric, axit t-cinnamic [19] Các hợp chất chứng minh với tác dụng chống lại oxy hóa gốc tự [20] Gần đây, nghiên cứu lợi ích chế độ ăn chứa polyphenol đái tháo đường typ bao gồm bảo vệ tế bào β đảo tụy chống lại độc tính glucose, ức chế α-amylases α- glucosidases, chống viêm [21] Trong nghiên cứu nhận thấy hợp chất (+)-catechin, (−)-epicatchin, axit chlorogenic, axit t-cinnamic, axit t-ferulic, axit 3-coumaric có tiềm ức chế enzym PTP1B có lượng liên kết tự với protein thấp chất chứng dương Đối với flavonoid tìm thấy mướp đắng, luteolin-7-O-glycoside, apigenin-7-O-glycoside chứng minh tiềm ức chế enzym PTP1B cao với lượng liên kết -8,4 (kcal/mol), -8,3 (kcal/mol) Hai hợp chất dạng O-glycosid hai flavonoid tự nhiên luteolin 47 apigenin Khi so sánh tác dụng điều trị đái tháo đường dạng glycosid luteolin-7-Oglycoside luteolin người ta thấy dạng luteolin có tiềm tác dụng dạng luteolin chuột KK-Ay [22] Apigenin-7-O-glycoside có lượng liên kết thấp với enzym PTP1B thấp chất chứng dương nhiên theo đánh giá quy tắc lipinski hợp chất khơng có tiềm trở thành thuốc Các tinh dầu xác định từ Mướp đắng chiếm khoảng 90,9% tổng lượng tinh dầu bao gồm nhóm hợp chất sesquiterpenes (71,7%), phenylpropanoids (11,0%), and monoterpenes (7,6%), transnerolidol (61,6%) Alessandra Braca cộng đánh giá tác dụng kháng vi khuẩn, vi rút chứng minh tinh dầu hạt Mướp đắng kháng Staphylococus aureus với giá trị MIC