Bài viết này được thực hiện để kết hợp cả ba loại vật liệu trên vào trong một vật liệu bằng phương pháp chiếu xạ, chế tạo AgNPs gắn trên nền của vi hạt silic được ổn định trong OCTS bằng phương pháp chiếu xạ và đánh giá khả năng tăng cường sinh trưởng và hiệu ứng kích kháng bệnh thông qua đánh giá hoạt tính enzyme chitinase trên mầm cây đậu nành. Mời các bạn cùng tham khảo!
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 03(124)/2021 nông nghiệp Việt Nam giải pháp hạn chế Kỷ yếu hội thảo quốc gia kha học công nghệ bảo vệ thực vật Nhà xuất Nông nghiệp: 172-180 Phạm Văn Lầm, 2000 Danh mục loài sâu hại lúa thiên địch chúng Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Viện Bảo vệ thực vật, 1999 Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thưc vật Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội Viện Sinh thái học miền Nam, 2017 Hướng tới quản lý tài nguyên thiên nhiên bền vững Việt Nam Nhà xuất ế giới Hà Nội Borror Donald, J., M Delong Dwight, and A Triplehorn Charles, 1976 An introduction to the study of insects (fourth edition): 852 p Rosenzweig M.L, 1995 Species Diversity in Space and Time Cambridge University Press, New York Initial survey of natural enemy insects diversity on oating rice eld at Vinh Phuoc commune, Tri Ton district, An Giang province Nguyen i Son, Tran Vinh Sang Abstract e research was conducted in Vinh Phuoc commune, Tri Ton district, An Giang province to identify the diversity of natural enemy insects on oating rice eld e results showed that the natural insects in the led included 86 species belonging to 10 families (Diptera, Coleoptera, Hemiptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Orthoptera, ysanoptera, Odonata, Dermaptera, Homoptera) with four major families (Hemiptera, Hymenoptera, Diptera and Coleoptera) e result also identi ed 17 spider species; of which, 16 species belong to Araneae order and species belong to Acari order e diversity index of insects and spiders on oating rice elds were higher than on high-yielding rice elds Keywords: Natural enemy, diversity, oating rice, An Giang province Ngày nhận bài: 05/3/2021 Ngày phản biện: 18/3/2021 Người phản biện: TS Vũ Tiến Khang Ngày duyệt đăng: 30/3/2021 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM TĂNG TRƯỞNG VÀ KÍCH KHÁNG BỆNH AgNPs@SiO2/OCTS BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ Nguyễn Xuân Tuấn1, Trần Đức Trọng1, Nguyễn anh Vũ1, Lê Quang Luân1* TÓM TẮT Chế phẩm nano bạc gắn vi hạt silica ổn định oligochitosan (AgNPs@SiO2/OCTS) chế tạo phương pháp chiếu xạ hỗn hợp gồm mM Ag+, 2% vi hạt silica 5% CTS Mw thấp Các đặc trưng trúc kích thước AgNPs Mw chitosan phân tích phổ tử ngoại - khả kiến (UV- vis), phổ nhiễu xạ tia X (XRD), ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) sắc ký qua gel (GPC) Kết cho thấy, chế phẩm AgNPs@SiO2/OCTS có hình thành nano bạc với kích thước khoảng 6,67 nm khối lượng phân tử (Mw) oligochitosan khoảng 19,5 kDa liều chiếu xạ kGy Chế phẩm tạo thành có tác dụng gia tăng tỷ lệ nảy mầm hạt đậu nành lên đến 96,33%, rút ngắn thời gian nảy mầm trung bình hạt đậu nành xuống 26,67 làm gia tăng sinh khối tươi mầm đậu nành lên 40,4 gram/100 mầm sau ngày sinh trưởng Ngoài ra, chế phẩm cịn làm tăng hoạt tính enzyme chitinase mầm đậu nành lên 159% so với đối chứng Từ khóa: Bạc nano, chiếu xạ, kích kháng, oligochitosan, silic, thúc đẩy sinh trưởng ĐẶT VẤN ĐỀ Chitosan sản phẩm deacetyl từ chitin, chitosan gọi 2-amino-2-deoxy-β(1.4)-D-glucopyranose Chitosan polymer khơng độc, có khả kháng khuẩn phân hủy sinh học cao, phụ phẩm ngành chế biến thủy hải sản Tuy nhiên, chitosan không hòa tan nước nên khả Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh 74 ứng dụng chitosan thấp (Rinaudo, 2006) Oligochitosan (OCTS) sản phẩm cắt mạch chitosan, gia tăng khả hòa tan chitosan nước Nhiều nghiên cứu cho thấy OCTS kích thích hệ thống kháng loại vi sinh vật gây bệnh thực vật thông qua chế phytoalexin (Ryan, 1988; Darvill et al., 1984) OCTS thúc đẩy hoạt Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 03(124)/2021 động enzyme chitinase, gia tăng tỷ lệ sống sót ngồi vườn ươm cúc, salem, hoa cát tường dâu tây in vitro (Luan et al., 2005), tăng cường hoạt động enzyme phytoalexin khác phenylalanine ammonia lyase, peroxidases chitinase trình nảy mầm hạt đậu nành đại mạch (Luan et al., 2006) Silica chế tạo từ tro trấu quan tâm rộng rãi gần với ưu điểm như: nguồn nguyên liệu rẻ tiền, phụ phẩm từ nông nghiệp, thành phần cấu trúc vách tế bào thực vật, tăng cường khả chống xâm nhập vi sinh vật gây bệnh vào tế bào thực vật thông qua chế tăng cường hoạt động enzyme chitinase, peroxidase, polyphenol oxydase,… (Belanger et al., 1995) Các nghiên cứu khả tăng cường chống chịu, đề kháng thực vật silica, silica kết hợp với OCTS kháng lại vi sinh vật gây bệnh tăng cường khả sinh trưởng, phát triển thực vật ngày quan tâm rộng rãi nước (Dung et al., 2017; Suriyaprabha, 2014) Các nghiên cứu hiệu kích kháng bệnh gia tăng suất trồng chế phẩm phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, kích thước phân đoạn oligochitosan kích thước hạt silica Nano bạc (AgNPs) biết đến tác nhân có khả kháng khuẩn, kháng nấm virus (Shin et al., 2004) Nano bạc tham gia vào số chu trình chuyển hóa trồng, hấp phụ ethylen, hợp chất phenolic tăng cường sinh trưởng phát triển trồng Hiện nay, có nhiều phương pháp để chế tạo nano bạc cắt mạch chitosan tạo OCTS Trong đó, phương pháp chiếu xạ cho thấy nhiều ưu điểm như: khơng sử dụng tác nhân khử hóa học, tác nhân khử tự sinh trình chiếu xạ, sản phẩm có độ đồng tinh cao, dễ dàng điều chỉnh phân bố kích thước hạt nano tạo thành cách điều chỉnh suất liều chiếu xạ, thực phản ứng điều kiện nhiệt độ áp suất thường, dễ triển khai, sản xuất quy mô công nghiệp (Li et al., 2007) Chính vậy, nghiên cứu thực để kết hợp ba loại vật liệu vào vật liệu phương pháp chiếu xạ, chế tạo AgNPs gắn vi hạt silic ổn định OCTS phương pháp chiếu xạ đánh giá khả tăng cường sinh trưởng hiệu ứng kích kháng bệnh thơng qua đánh giá hoạt tính enzyme chitinase mầm đậu nành II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Chitosan Mw thấp có Mw ~ 48,4 kDa, độ deacetyl hóa (DD) ~ 80%, vi hạt silic có kích thước trung bình khoảng 1,021 µm cung cấp Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh Hạt giống đậu nành DT84 cung cấp công ty Hồng Nơng, Tp.HCM 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chế tạo AgNPs gắn vi hạt silica ổn định OCTS Hịa tan hồn tồn 10 g chitosan Mw thấp 150 ml acid lactic 2% Bổ sung từ từ 0,034 g AgNO3 vào dung dịch chitosan khuấy tạo hỗn hợp CTS/AgNO3 Sau đó, g vi hạt silica bổ sung vào dung dịch CTS/AgNO3, đồng hóa mẫu 30 phút bổ sung thêm nước khử ion để thể tích mẫu đạt 200 ml tạo hỗn hợp AgNO3/SiO2/CTS (2% SiO 2, mM AgNO3 5% CTS) Các mẫu AgNO3/SiO2/CTS sau chế tạo cho vào bình thủy tinh có nắp đậy chiếu xạ liều xạ - 16 kGy nguồn gamma Co-60 (GC 5000, BRIT, Ấn Độ) tạo chế phẩm AgNPs@Si/OCTS 2.2.2 Xác định đặc trưng mẫu AgNPs@SiO2/ OCTS sau chiếu xạ Phổ tử ngoại- khả kiến (UV-vis): Phổ UV-vis mẫu AgNPs@SiO2/OCTS xác định máy Genesys 10S UV-vis ( ermo Scienti c-Mỹ) Các mẫu AgNPs@Si/OCTS pha loãng 20 lần tiến hành đo 375 - 425 nm để xác định bước sóng hấp thu cực đại (λmax) mẫu Mw OCTS: Mẫu AgNPs@SiO 2/OCTS ly tâm 15000 vòng/phút để loại bỏ phần cặn, thu OCTS Mw OCTS sau chiếu xạ xác định máy GPC Agilent e2965 (Water, Mỹ) với hệ dung môi CH3COOH /CH3COONa sử dụng Pullulan mẫu chuẩn Phổ nhiễu xạ tia X (XRD): Phổ XRD mẫu AgNPs@SiO2/OCTS sau đông khô xác định hệ máy nhiễu xạ tia X D8 Advance Eco (Bruker, Mỹ), sử dụng ống phát xạ CuKα (1q = 1,5406 Å, U = 40 kV, I = 25 mA) Xác đinh kích thước hạt AgNPs: Kích thước hạt AgNPs tính tốn dựa diện tích peak 38,1ο phổ nhiễu xạ tia X công thức DebyeScherrer phần mềm Di rac.Eva V.4.3.1 75 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 03(124)/2021 Phân tích kích thước hạt AgNPs ảnh SEM: Mẫu AgNPs@SiO2/OCTS rửa nhiều lần nước khử ion ly tâm 15.000 vòng/phút thu nhận vi hạt silic gắn bạc nano (AgNPs@SiO2) Mẫu AgNPs@SiO2 sau ly tâm phân tích kích thước hạt AgNPs tạo thành ảnh SEM phân tích thành phần cấu tạo phổ tán sắc lượng tia X (EDX) máy FE-SEM S4800 (Hitachi Nhật Bản) 2.2.3 Xác định hiệu ứng tăng trưởng chế phẩm AgNPs@SiO2/OCTS mầm đậu nành Các hạt đậu nành (không sâu, lép, hỏng) xử lý với cồn 70ο trước ngâm chế phẩm AgNPs@Si/OCTS với nồng độ 0,06 - 0,22% chế phẩm 30 phút Sau đó, hạt đặt khay nhựa có lót bơng giữ ẩm Mỗi nghiệm thức bao gồm 100 hạt lặp lại lần Quan sát, ghi nhận tiêu sinh trưởng như: Tỉ lệ nảy Hoạt độ enzyme chitinase (UI/ml) = mầm, thời gian nảy mầm trung bình sinh khối tươi/100 mầm đậu nành công thức sau (Ranal and Santana, 2006) Tỷ lệ nảy mầm (%) = 100 (số hạt nảy mầm/tổng số hạt) ời gian nảy mầm (giờ) = (G1T1 + G2T2 + + GnTn)/(G1 + G2 + + G n) (Trong G: số hạt nảy mầm, T: thời gian theo dõi) 2.2.4 Xác định hiệu ứng tăng cường hoạt tính enzyme chitinase mầm đậu nành chế phẩm AgNPs@SiO2/OCTS Enzyme chitinase từ mầm đậu nành xử lý với nồng độ khác chế phẩm AgNPs@Si/ OCTS ly trích thu nhận theo quy trình Dinesh cộng tác viên (2010) Sau đó, hoạt tính enzyme chitinase xác định chitinase assay kit (Sigma, Mỹ) Hoạt độ enzyme chitinase tính tốn dựa cơng thức sau: (ODmẫu _ ODblank) ˟ 0,05 ˟ 0,3 ˟ DF OD chuẩn ˟ 15 ˟ 0,3 Trong đó: OD mẫu: độ hấp thụ mẫu bước sóng 405 nm; OD Blank: độ hấp thụ đệm CH3COONa bước sóng 405 nm; DF: hệ số pha lỗng (1*); OD mẫu chuẩn: độ hấp thụ mẫu chuẩn bước sóng 405 nm 2.3 ời gian địa điểm nghiên cứu í nghiệm tiến hành phịng Cơng nghệ Sinh học Vật liệu Nano, Trung tâm Công nghệ Sinh học ành phố Hồ Chí Minh từ tháng 4/2019 đến tháng 02/2021 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng liều xạ đến đặc trưng cấu tạo mẫu AgNPs@SiO2/OCTS Kết nhận từ hình bảng cho thấy phổ UV-Vis mẫu AgNPs@SiO2/OCTS tạo thành sau chiếu xạ có đỉnh hấp thu đặc trưng cho hình thành nano bạc với bước sóng hấp thu cực đại khoảng 390 - 415 nm hiệu ứng plasmon bề mặt nano bạc (Đặng Văn Phú ctv., 2015), mẫu khơng chiếu xạ hồn tồn khơng có đỉnh hấp thu đặc trưng vùng Các đỉnh hấp thu cực đại có bước sóng hấp thu cực đại tăng dần tăng dần liều xạ Cụ thể, liều chiếu xạ kGy, bước sóng hấp thu cực đại mẫu AgNPs@SiO2/OCTS 397,5 nm Khi tăng dần liều chiếu xạ lên từ - 16 kGy, bước sóng hấp thu cực đại mẫu AgNPs@SiO2/OCTS tăng từ 404,5 - 413,5 nm 76 Hình Phổ UV-Vis mẫu AgNPs@Si/OCTS sau chiếu xạ Bảng Bước sóng hấp thu cực đại mẫu AgNPs@SiO2/OCTS chiếu xạ liều xạ khác Liều chiếu xạ (kGy) Bước sóng hấp thu cực đại (λmax) 12 16 397,5 404,5 405,0 413,5 Phân tích mẫu SiO2/CTS, SiO2/Ag+/CTS (mẫu khơng chiếu xạ) mẫu AgNPs@SiO2/OCTS phổ nhiễu xạ tia X (XRD) với góc theta từ 30 đến 80° Kết thể hình cho thấy diện đỉnh peak 38,1; 44,2; 64,4 77,4° mẫu AgNPs@SiO2/OCTS Đây đỉnh sóng đặc Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 03(124)/2021 trưng cho mặt phẳng nhiễu xạ (111), (200), (211) (220) nano bạc mẫu AgNO3/Si/CTS sau chiếu xạ (Phú ctv., 2015) Trong mẫu đối chứng SiO2/CTS AgNO3/SiO2/CTS khơng chiếu xạ hồn tồn khơng có đỉnh góc nhiễu xạ kể Kết với kết phổ UV-vis khẳng định hình thành nano bạc mẫu AgNO3/Si/CTS sau chiếu xạ 12 kGy Kích thước hạt nano bạc tiếp tục tăng đến 10,6 nm mẫu AgNPs@Si/OCTS sử dụng liều xạ 16 kGy Để khẳng định trình gắn AgNPs lên vi hạt silic, mẫu AgNPs@SiO2/OCTS rửa nước nhiều lần ly tâm để loại bỏ hạt AgNPs không liên kết vi hạt silic chụp ảnh SEM để phân tích kích thước hạt Kết hình cho thấy có diện hạt AgNPs, hạt AgNPs gắn bề mặt vi hạt silic với kích thước hạt khoảng 6,1 - 10,5 nm Hình Phổ nhiễu xạ tia X (XRD) mẫu AgNPs@SiO2/OCTS sau chiếu xạ Bảng Kích thước hạt nano bạc mẫu AgNPs@SiO2/OCTS chiếu xạ liều xạ khác Liều xạ (kGy) Kích thước hạt (nm) 6,69 7,6 12 9,41 16 10,6 Trong nghiên cứu này, kích thước AgNPs xác định từ diện tích đỉnh vị trí 38.1° dựa công thức Debye-Scherrer chế phẩm sau chiếu thể bảng Kết cho thấy tăng dần liều chiếu xạ từ đến 16 kGy kích thước hạt nano bạc tạo thành tăng dần Ở liều chiếu xạ kGy kích thước hạt nano bạc tạo thành 6,69 nm Kích thước hạt nano bạc tăng đáng kể tăng dần liều chiếu xạ, nano bạc có kích thước 7,76 9,41 nm tăng liều chiếu xạ lên Hình Ảnh SEM hạt AgNPs gắn vi hạt silic chế phẩm AgNPs@SiO2/OCTS Kết hình sau rửa nước ly tâm, mẫu AgNPs@SiO2 có thành phần cấu tạo bao gồm nguyên tố: cacbon, oxi, Si Ag Trong hàm lượng C chiếm 3,61% (w/w) cho thấy toàn OCTS loại bỏ khỏi mẫu trước phân tích phổ tán xạ lượng tia X Hàm lượng AgNPs mẫu AgNPs@SiO2 phân tích chiếm 0,5% tương đương với 108 ppm AgNPs (~ mM Ag+) Kết cho thấy toàn lượng Ag+ trước chiếu xạ khử tạo thành nano bạc toàn lượng AgNPs gắn vi hạt silica chế phẩm tạo thành sau chiếu xạ Hình Phổ tán xạ lượng tia X thành phần cấu tạo mẫu AgNPs@SiO2 sau ly tâm 77 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 03(124)/2021 CTS với Mw khoảng 48,4 kDa sử dụng để chế tạo chế phẩm AgNPs@SiO2/OCTS với mục đích vừa chất ổn định hạt nano vừa chất kích kháng, tăng cường sinh trưởng thực vật, Mw CTS sau chiếu xạ đóng vai trị quan trọng Sự suy giảm Mw CTS sau chiếu xạ liều xạ khác thể hình Kết cho thấy sau chiếu xạ, Mw CTS giảm tăng dần liều xạ Mw CTS giảm mạnh, từ 48,4 kDa xuống khoảng 19,5 chiếu xạ liều xạ thấp (4 kGy) tiếp tục suy giảm chậm tiếp tục tăng liều xạ lên từ - 16 kGy (18,1; 16,1 11,6 kDa) Nhiều nghiên cứu trước cho thấy CTS có Mw từ 10 - 20 kDa có hoạt tính tăng cường sinh trưởng thực vật (Luan et al., 2006) Do đó, để tạo thành chế phẩm gia tăng sinh trưởng tên thực vật, với kích thước hạt AgNPs nhỏ, chế phẩm AgNPs@Si/ OCTS chiếu xạ với liều kGy lựa chọn khoảng 24 đầu sau ngâm chế phẩm Khơng có khác biệt mặt thống kê nghiệm thức tiêu tỷ lệ nảy mầm, thời gian nảy mầm trung bình sinh khối tươi mầm đậu nành Tỷ lệ nảy mầm đạt 96,33% thời gian nảy mầm trung bình đạt 26,77 Hạt mầm đậu nành phát triển mạnh, sau ngày sinh trưởng, sinh khối tươi hạt mầm tăng đến 40,4 g Kết nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu tác giả khác (Amira et al., 2015; Hameed, 2013; Noshad et al., 2019) cho thấy silic, oligochitosan AgNPs đóng vai trị quan trọng trình tăng cường sinh trưởng hạt mầm Bảng Hiệu ứng tăng trưởng chế phẩm AgNPs@SiO2/OCTS mầm đậu nành Nồng độ chế phẩm, % (ĐC) 0,06 0,1 0,14 0,18 0,22 Tỷ lệ nảy mầm, % 74,67a ± 2,52 82,00b ± 6,25 85,67b ± 4,04 92,33a ± 2,08 96,33a ± 1,53 95,33a ± 1,15 ời gian nảy mầm, 38,34c ± 1,52 37,42c ± 2,79 33,37b ± 2,22 31,47b ± 1,88 26,77a ± 1,20 25,60a ± 0,71 Sinh khối tươi, g/100 mầm 35,5 c ± 0,39 37,2 c ± 0,26 38,4 b ± 0,28 38,8 b ± 0,54 40,4a ± 0,91 40,5a ± 0,95 Ghi chú: Trong cột, giá trị theo sau ký tự khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê (P