BÁO CÁO môn SINH HỌC PHÂN tử đề tài kĩ thuât và nguyên tắc tạo hoa hồng xanh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG KHOA HÓA  BÁO CÁO MÔN SINH HỌC PHÂN TỬ Đề tài: Kĩ thuật và nguyên tắc tạo hoa hồng xanh Giáo viên hướng dẫn: TS Ngô Thái Bích Vân Sinh viên thực hiêṇ : Hồ Thị Nga Nguyễn Thị Tuyết Nhi Nguyễn Thị Ái Nhi Phạm Thị Quỳnh Như Nguyễn Thị Nguyêṭ Nguyễn Thị Kim Ngân Lớp : 17SH Nhóm :6 MỤC LỤC 1.Đă ̣t vấn đề 2.Lịch sử phát triển 3.Kĩ thuâ ̣t RNAi 3.1.Khái niê ̣m RNAi 3.2.Cơ chế hoạt động .4 * Một số đặc điểm kĩ thuật RNAi Kĩ thuâ ̣t DNA tái tổ hợp 4.1.Khái niê ̣m DNA tái tổ hợp 4.2 Cơ chế hoạt động 5.Nguyên tắc tạo hoa hồng xanh 11 5.1 Tổng quan 11 5.2 Cơ chế tạo hoa hồng xanh .12 *Chu trình hình thành sắc tố .14 5.3 Những yếu tố ảnh hưởng 15 6.Kết luâ ̣n và kiến nghị .16 6.1 Kết luận 16 6.2 Kiến nghị 16 1.Đặ t vấn đề Hoa hồng loài hoa đẹp trồng phổ biến nhiều quốc gia giới Nó biểu tượng đặc trưng tình yêu, mang ý nghĩa văn hóa khác Khơng đẹp, lồi hoa cịn mang lại nhiều lợi ích kinh tế cho sức khỏe vẻ đẹp người như: làm đẹp da, cải thiện trí nhớ, tâm trạng, kháng viêm, Hoa hồng loài hoa quan trọng toàn cầu, hoa phổ biến châu Âu Năm 2007, hoa hồng chiếm 70% ngành công nghiệp hoa cắt cành giới, chợ hoa trung tâm thu hút người tiêu dùng nhà tạo giống để tạo giống hoa với màu sắc khác nhau: đỏ, cam, vàng, [1] Cùng với nhu cầu hoa đa dạng màu sắc hoa ngày gia tăng, đòi hỏi đổi Màu xanh dương màu trời, biển, màu tinh khiết, yên bình vĩnh cửu, hoa hồng xanh gắn liền với tri thức trí tuệ, mang ý nghĩa vẻ đẹp riêng lại loài hoa không tồn cách tự nhiên hoa hồng thiếu gen cụ thể có khả tạo màu "xanh thật"[2], nên hoa hồng xanh tạo theo cách truyền thống: nhuộm hoa hồng trắng Vì hoa hồng xanh trở thành lồi hoa bí ẩn nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu Vào năm 1840, Hoa hồng xanh coi chén thánh (Holy Grail) nhà lai tạo hoa hồng Khi hiệp hội làm vườn Anh Bỉ treo giải thưởng 500.000 francs cho người tạo hoa hồng màu xanh [3] 2.Lịch sử phát triển Vừa hội nghị hoa hồng giới 2006 tổ chức thành phố Osaka từ ngày 11-17/5/2006 Tại hoa hồng xanh tạo kỹ thuật RNAi hợp tác nhà khoa học hai công ty Florigene Suntory trợ giúp mắt kỹ thuậtcủa Viện Khoa Học Kỹ Thuật Úc Châu (CSIRO) giới thiệu giành giải thưởng 5000.000 francs Q trình để có hoa hồng xanh:[4] + Năm 1990-2004, nhóm nghiên cứu đạt thành cơng việc ni trồng phát triển hoa hồng xanh + Công ty Florigene, Australia phối hợp với công ty Suntory Holdings, Nhật nghĩ cách bổ sung gene mang màu xanh lấy từ hoa păng-xê diên vĩ vào hoa hồng + Các nhà khoa học ứng dụng công nghệ gene lặn, thuộc sở hữu tổ chức NCKH liên bang australia (CSIRO) + Do hợp tác nhà khoa học hai công ty Florigene – Suntory, trợ giúp mặt kỹ thuật Viện Khoa Học Kỹ Thuật Úc Châu (SCIRO) · Cùng với phát triển vượt bật khoa học – kĩ thuật, nhà khoa học nghiên cứu, cải tiến kĩ thuật nhằm tăng đường sinh tổng hợp flavonoid (tác nhân tạo màu hoa) để đưa đến phiên thay tốt sử synthetase peptide khơng phải ribosome (NRPS) mà tổng hợp sắc tố màu xanh indigoidine, để tạo hoa hồng xanh.[5] 3.Kĩ thuậ t RNAi 3.1.Khái niệ m RNAi "RNA can thiệp" (RNAi- RNA interference) loại RNA ngắn có kích thước khoảng 19-25 nu, có khả tham gia can thiệp vào trình phiên mã dịch mã, giúp kiểm soát gene hoạt động RNAi chế để bất hoạt gene gây nên RNA mạch kép (dsRNA) Đó trình tự đặc biệt liên quan đến suy thoái hai loại phân tử RNA: RNA sợi kép (dsRNA) RNA sợi đơn thường mRNA sợi tương đồng trình tự dsRNA làm kích hoạt phản ứng trả lời Các phân tử RNAi gây nên hiệu ứng: Ức chế dịch mã đơn vị mRNA, ức chế phiên mã gene nhân, phân giải mRNA.[1] 3.2.Cơ chế hoạt độ ng * Chú thích[1,3] => Hình 1: Cấu trúc siRNA[1] (Mỗi sợi có nhóm 'phosphate nhóm 3' hydroxyl (-OH) Cấu trúc kết trình xử lý Dicer, loại enzyme chuyển đổi chuỗi RNA dài RNA kẹp tóc thành siRNA.) - siRNA : RNA can thiệp nhỏ (siRNA), gọi RNA can thiệp ngắn RNA im lặng, loại gồm phân tử RNA sợi đôi dài 20-25 nucleotide siRNA đưa vào ngoại sinh (nhân tạo) vào tế bào nhiều phương pháp thay thế khác - miRNA:RNA can thiệp nhỏ (micro RNA), RNA khơng mã hóa hình thành cấu trúc kẹp tóc  - ds RNA :dsRNA(double strand RNA) đọan RNA dài mạch kép mang trình tự bắt că ̣p bổ sung được với gen mục tiêu -  RdRp :Enzyme tổng hợp khuôn RNA (RdRp)là sợi dsRNA, nhân siRNA hoă ̣c miRNA - Dicer: (nuclease RNAse III ) tách RNA sợi đôi (DSRNA) tiền microRNA (miRNA) thành đoạn RNA sợi đôi ngắn gọi RNA can thiệp nhỏ (siRNA) -Phức hệ RISC (RNA – incluced silencing complex): Sự kết hợp RNA Argonaut, cùng với các protein khác -Ago (Argonaute ):Argonaute thành phần xúc tác phức hợp RISC endonuclease có khả làm suy giảm RNA thơng tin (mRNA) có trình tự bổ sung cho chuỗi dẫn siRNA RITS Phức hợp protein (phức hợp chứa argonaute, protein chromodomain Chp1 protein gọi TAS3 - Sửa đổi histone liên quan đến hình thành heterochromatin phục vụ để điều hòa gen trước phiên mã ; gọi trình im lă ̣ng phiên mã RNA gây =>Hình 2: Con đường RNAi [tấn 2] ( ) chuỗi RNA dài - xuất phát từ a) bên từ microRNA (miRNA), RNA tác động chuyển hóa (tasiRNA) RNA vi mơ (miRNA) b) từ bên khỏi virus xâm nhập, giới thiệu DSRNA - phân tách endonuclease gọi Dicer cho RNA can thiệp sợi đôi nhỏ (siRNA)trung bình 21-27 nt kích thước ( ) Các song công(đồng công) siRNA tạo phức hợp với protein khác Nếu song công siRNA / mRNA chứa khơng khớp mRNA khơng bị phân cắt Thay vào đó, im lặng gen kết ức chế tịnh tiến ( ) Phức hợp (RISC) giúp tách hai sợi miRNA siRNA phức hợp  ( ) Phức hợp siRNA-RISC chuỗi đơn nhắm vào mục tiêu cụ thể mRNA cách ghép cặp sở Watson-Crick cụ thể siRNA mRNA nhắm mục tiêu  ( ) Điều dẫn đến việc loại bỏ mRNA cụ thể cách phân cắt enzyme ức chế dịch mã  ( ) Cuối protein tương ứng liên quan chức bị loại bỏ tế bào sinh vật (7)Tái chế phức hợp siRNA-RISC xảy ra  thực vật, nấm tuyến trùng (nhưng động vật có xương sống) (8)Nơi có trình khuếch đại nhóm siRNA nhỏ RNA phụ thuộc ↳  KL(ứng dụng kĩ thuật tạo hoa hồng xanh) : Dùng kỹ thuật RNAi nhằm ức chế hoạt động gen DFR hoa hồng đỏ dẫn đến ức chế chu trình cyanidin * Một số đặc điểm kĩ thuật RNAi  - dsRNA có khả gây bất hoạt gen hiệu - Kĩ thuật RNAi có khả gây bất hoạt dsRNA có trình tự tương đồng với mRNA Trình tự RNA tương đồng với intron, promoter khơng có tác dụng - RNAi gây bất hoạt gen giai đoạn sau phiên mã, xảy tế bào chất Kĩ thuậ t DNA tái tổ hợp 4.1.Khái niệ m DNA tái tổ hợp DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) DNA lai với công nghệ sử dụng enzyme để cắt dán chuỗi DNA quan tâm thuộc loài khác cá thể khác lồi.[4] Trình tự DNA tái tổ hợp đặt vào phương tiện gọi vectơ đưa DNA vào tế bào chủ thích hợp nơi chép thể Ví dụ: Hai vector plasmid, phage λ cài mảnh DNA lạ để tạo DNA tái tổ hợp.(Hình dưới) [5] Các DNA lạ gọi đoạn cài hay DNA ngoại lai Nó mảnh (đoạn) DNA gen mà người nghiên cứu quan tâm ghép vào DNA plasmid hay DNA virus 4.2 Cơ chế hoạt độ ng Hình 3.Cơ chế hoạt động DNA tái tổ hợp[6] http://www.biotechnologynotes.com Cơ chế hoạt động (các bước )[5] B1 Tách lập DNA lạ cần tạo dòng Chọn cắt DNA lạ tế bào cho enzyme cắt hạn chế - type II Restriction endonucleases (RE) B2 Chọn xử lí vector Chọn vector cần phải ý yêu cầu sau: độ lớn gen lạ (đoạn cài), loại tế bào chủ tiếp nhận vector phương pháp ứng dụng Xử lí vector: cắt vector enzyme cắt hạn chế loại với enzyme cắt DNA nói (để tạo vết cắt giống nhau, thuận tiện cho việc nối ghép sau này) Khử nhóm phosphat enzyme alkanline phosphotase để tránh hai đầu vector đóng kín trở lại B3 Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp) Việc tạo DNA tái tổ hợp cách ghép DNA lạ vào vector cắt loại enzyme cắt hạn chế loại II, đó, chúng gắn nucleotide tương ứng vào chỗ trống theo nguyên tắc bổ sung enzyme DNA-polymerase I Một phản ứng ghép nối xảy với có mặt enzyme DNA ligase E Coli phage T4 để nối liên kết  phosphodiester cuối tạo plasmid tái tổ hợp hoàn thiện ↳  KL( ứng dụng kĩ thuật tạo hoa hồng xanh): Chuyển gen delphinidin với gen DFR hoàn toàn nhằm hồn chỉnh chu trình tổng hợp delphinidin hoa hồng B4 Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ phương pháp biến nạp tải nạp *Một số phương pháp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ[5] Biến nạp Hóa biến nạp Hóa biến nạp phương pháp sử dụng chất hóa học nhằm để thay đổi màng tế bào , tạo điều kiện để đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ Điện biến nạp Sử dụng dòng điện cao cục theo xung để tạo lỗ nhỏ màng sinh học tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ DNA tái tổ hợp dễ dàng Biến nạp tế bào trần Là phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ xử lí polyetylen glycol (PEG) - tạo tế bào trần  Phương pháp bắn gen Người ta sử dụng hạt kim loại nặng bao bọc DNA bắn trực tiếp vào tế bào Phương pháp vi tiêm Phương pháp vi tiêm phương pháp sử dụng vi kim kính hiển vi để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào định Tải nạp Tải nạp tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector virus từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, có q trình chuyển gen tái tổ hợp gen vi khuẩn nhờ thực khuẩn thể (Bacteriophage) 5.Nguyên tắc tạo hoa hồng xanh 5.1 Tổng quan -Flavonoid, carotenoids betalain sắc tố chịu trách nhiệm màu sắc hoa Trong số đó, flavonoid”đặc biệt anthocyanin” đóng góp nhiều vào phạm vi loại sắc tố màu -Các nhiễm sắc thể anthocyanin pelargonidin,cyanidin delphinidin Anthocyanin dihydrokaempferol (DHK), tiền chất phổ biến nhiễm sắc thể, đóng vai trị quan trọng việc xác định màu hoa, chi phối chu trình hình thành sắc tố trồng bao gồm: pelargonidin,cyanidin delphinidin -Sau hàng loạt các nghiên cứu thì các nhà khoa học của công ty Florigene đã tìm yếu tố tạo màu xanh hoa hồng gen delphinidin được clone từ loài hoa păng-xê (Pansy) (Viola x wittrockiana) để tổng hợp trực tiếp màu xanh hoa hồng -Vai mượn thêm gen iris nhằm tạo enzyme DFR (the dihydroflavonol reductase), enzyme hoàn thành chu trình phản ứng tổng hợp delphinidin hoa hồng -Mơ ̣t yếu tố gen nhân tạo được tạo bằng kĩ thuâ ̣t RNAi nhằm tắt sự hoạt đô ̣ng của gen tạo màu đỏ hoa hồng 5.2 Cơ chế tạo hoa hồng xanh Từ năm 1990 nhà sinh học phân tử Suntory hợp tác với Florigene để biến giấc mơ “ Hoa hồng xanh” thành thật Và, đến tháng năm 2005, họ thức cơng bố giới thiệu biến đổi đồng thời để tạo nên loài hoa đặc biệt Bước 1: Tạo bơng hồng trắng có gene DFR bị bất hoạt kỹ thuật RNAi ức chế gene mà mong muốn để chèn gene khác vào Gene DFR gene giúp hoa hồng tạo màu sắc tự nhiên Bởi mà nhóm phát triển nghiên cứu theo hướng bất hoạt gene Trong ứng dụng thương mại thực vật, công nghệ RNAi CSIRO phát triển sử dụng để loại bỏ gen mã hóa enzyme dihydroflavonol reductase (DFR) hoa hồng Từ nhóm nghiên cứu Suntory Florigene ứng dụng RNAi để bất hoạt gene DFR hoa hồng Bước 2: Chèn gene lấy từ loài Pansy để tạo màu xanh delphinidin kỹ thuật DNA tái tổ hợp Delphinidin mã hóa enzyme tương đồng cho việc thay đổi enzyme DHK nhằm mục đích hình thành tổng hợp màu theo chu trình delphinidin Để làm bước nhà khoa học phải đối mặt với thử thách lớn phân lập gene màu xanh để tổng hợp nên sắc tố xanh (Delphinidin) từ hàng ngàn loài hoa màu xanh Và để vượt qua đối thủ họ phải hồn thành sớm việc phân lập gene màu xanh xin cấp sáng chế cho gene Để phân lập gene xanh từ lồi dã n thảo màu tím đậm phương pháp đưa gen ứng cử viên gen xanh vào nấm men thay thực vật kiểm tra hoạt động enzyme chúng nấm men Nhờ phương pháp này, họ thu kết sau tuần kiểm tra hoạt động nhiều gen Cuối đến ngày 13/06/1991 họ thành công việc phân lập gene xanh Tuy nhiên, gene xanh từ loài dã yên thảo đưa vào hoa hồng công nghệ DNA tái tổ hợp màu sắc hoa màu đỏ khơng có sắc tố xanh phát Vì vậy, họ tiến hành phân lập gene xanh từ lồi thực vật có hoa màu xanh khác khổ sâm, hạt đậu bướm, vạn thọ đưa chúng vào hoa hồng Nhưng kết “chỉ có hoa hồng có gene màu xanh khơng có sắc tố xanh nở rộ.” Vào năm 1996, thay đổi màu sắc hoa hồng cuối quan sát mà họ tiến hành đưa gene màu xanh lồi Pansy vào bơng hoa hồng đỏ Tuy màu quan sát màu đỏ sẫm coi bước tiến lớn Bước 3: Chèn gene DFR lấy từ lồi Iris nhằm mục đích tạo sắc tố xanh cho hoa hồng Ở sử dụng loài Iris gene hoa hồng Iris giống chia sẻ cho nhiều mã DNA, RNAi xác việc nhắm vào trình tự DNA gene DFR hoa hồng, mà khơng làm bất hoạt gene DFR Iris (Gói ba gen (pansy delphinidin, iris DFR, anti-rose DFR) hoạt động: Hoa hồng chuyển gen Suntory tạo lượng delphinidin cao cánh hoa lượng cyanidin nhỏ.) [03] *Chu trình hình thành sắc tớ DHK hydroxyl hóa vị trí 3’ để tạo dihydroquercetin (DHQ) vị trí 3’ 5’ để sản xuất dihydromyricetin (DHM) DHK dẫn đến sản xuất anthocyanin dựa pelargonidin để hoa màu vàng DHQ dẫn đến việc tạo cyanidin-anthocyanin dựa đóng góp cho hoa màu đỏ hồng DHM dẫn đến việc tạo anthocya dựa delphinidin-nins tạo hoa màu xanh tím Những phản ứng hydroxyl hóa thường xúc tác hai enzyme cytochrom P450 mono-oxyase, đặc trưng, flavonoid 3′-hydroxylase (F3′H) flavonoid 3, 5′-hydroxylase (F3′5'H) => Do đó, diện hay vắng mặt enzyme loài thực vật khác đa dạng để quan sát màu cánh hoa biến thể thực vật hạt kín Nhóm hydroxy (-OH) nhiều cho màu xanh nhiều 5.3 Những yếu tố ảnh hưởng Độ pH tế bào là yếu tố quan trọng viê ̣c tạo màu sắc hoa, đó lý lồi hoa có chu trình anthocyanin lại có màu khác Khi nồng độ pH axit yếu hoă ̣c trung tính sẽ cho màu xanh lam, tế bào mang tính kiềm nhiều sắc tố anthocyanin thường trở nên xanh hơn, pH axit sẽ cho màu đỏ pH đất khơng ảnh hưởng hay ảnh hưởng đến pH tế bào cánh hoa Nồng độ pH tế bào cánh hoa thường mang tính di truyền Cánh hoa hồng thơng thường có nồng độ pH khoảng 4.5 để tạo cánh hoa hồng có nồng độ pH thấp hạn chế pH hoa cẩm chướng khoảng 5.5 Sự flavon flavonol, gây dịch chuyển ochromic chúng xếp chồng với anthocyanin tạo sự hình thành phức chất với ion kim loại (nhôm) yếu tố khác định màu cánh hoa 6.Kết luậ n và kiến nghị 6.1 Kết luậ n Kể từ năm 2008, hoa hồng GM trồng đợt thử nghiệm tổ chức hạt giống Martino Cassanova Nam Hampshire, theo phát ngôn viên công ty Atsuhito Osaka.[9] Suntory báo cáo bán 10.000 hồng xanh Nhật Bản vào năm 2010.[10] Giá từ 2.000 đến 3.000 Yen 22 đến 35 đô la Mỹ thân.[11] Công ty tuyên bố doanh số bán hàng Bắc Mỹ bắt đầu vào mùa thu năm 2011.[12] Mang lại nhiều ý nghĩa: - Ý nghĩa kinh tế, xã hội: + Mang lại nguồn lợi kinh tế khổng lồ: Suntory báo cáo bán 10.000 hồng xanh Nhật Bản vào năm 2010 Giá từ 2.000 đến 3.000 Yen 22 đến 35 đô la Mỹ thân + Có ý nghĩa tâm linh - Ý nghĩa ngành CNSH + Việc ứng dụng kĩ thuật rnai không việc tạo hoa hồng xanh mà mở kĩ nguyên cho ứng dụng chuyển gen vào nông nghiệp Hoa hồng xanh Florigene báo trước tương lai tươi sáng cho nhà nhân giống trồng kỷ 21 6.2 Kiến nghị Để làm sâu sắc thêm màu xanh lam đòi hỏi phải sửa đổi thêm, cách nhân giống truyền thống kỹ thuật di truyền để làm cho hoa hồng axit Ứng dụng các công nghê ̣ để tạo được hoa hồng đa sắc( có nhiều màu sắc cùng mô ̣t hoa) và nhiều loại hoa với màu sắc khác nhau, đem lại sự mới mẻ công nghê ̣ tạo màu sắc hoa Nghiên cứu làm giảm giá thành của hoa hồng xanh, đem nó trở nên phổ biến rô ̣ng rãi thế giới TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] http://bannhanong.vn/danhmuc/MTA=/baiviet/Tinh-hinh-tieu-thu-hoa-kieng-trenthe-gioi/MTc0NA==/index.bnn [2] Engineering of the Rose Flavonoid Biosynthetic Pathway Successfully Generated Blue-Hued Flowers Accumulating Delphinidin (Yukihisa Katsumoto, Masako Fukuchi-Mizutani, Yuko Fukui, Filippa Brugliera, Timothy A Holton, Mirko Karan, Noriko Nakamura, Keiko Yonekura-Sakakibara, Junichi Togami, Alix Pigeaire, Guo-Qing Tao, Narender S Nehra, Chin-Yi Lu, Barry K Dyson, Shinzo Tsuda, Toshihiko Ashikari, Takaaki Kusumi, John G Mason and Yoshikazu Tanaka ,2007) [3] Origin of the Color of Cv Rhapsody in Blue Rose and Some Other Socalled “Blue” Roses (JEAN-FRANCü OIS GONNET, 2003) [4] http://sofri.org.vn/NewsDetail.aspx?l=&id=30&cat=1&catdetail=2 [5] Cloning and expression of a non-ribosomal peptide synthetase to generate blue rose (Ankanahalli N Nanjaraj Urs, Yiling Hu, Pengwei Li, Michael Yuchi, Yihua Chen, and Yan Zhang, 2018) [1] Theo https://en.wikipedia.org/wiki/RNA_interference ncbi - RNAi interference [2] Theo RNAi Technologies in Agricultural Biotechnology the Toxicology Forum 40th Annual Summer Meeting 2015 [3] Theo Genetic Engineering& Biotechnology News - RNAi & qRT-PCR https://www.gene-quantification.de/rnai.html p [4] Theo National Human Genome Research Institute - USA.gov -https://www.genome.gov/genetics-glossary/Recombinant-DNA [5] Theo https://voer.edu.vn/m/cong-nghe-dna-tai-to-hop-va-su-tach- dong/8a6785c1 [6] Theo http://www.biotechnologynotes.com/ ... delphinidin hoa hồng -Mô ̣t yếu tố gen nhân tạo được tạo bằng kĩ thuâ ̣t RNAi nhằm tắt sự hoa? ?t đô ̣ng của gen tạo màu đỏ hoa hồng 5.2 Cơ chế tạo hoa hồng xanh Từ năm 1990 nhà sinh học phân. .. DNA tái tổ hợp 4.2 Cơ chế hoa? ?t động 5 .Nguyên tắc tạo hoa hồng xanh 11 5.1 Tổng quan 11 5.2 Cơ chế tạo hoa hồng xanh .12 *Chu trình hình thành... tự nhiên hoa hồng thiếu gen cụ thể có khả tạo màu "xanh thật"[2], nên hoa hồng xanh tạo theo cách truyền thống: nhuộm hoa hồng trắng Vì hoa hồng xanh trở thành lồi hoa bí ẩn nhiều nhà khoa học