Tài liệu Nghiên cứu phân lập và thử hoạt tính sinh học các hợp chất Napthoquinoes

Tai lieu, luan van1 of 102 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - - Hà Huy Tùng NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT NAPHTHOQUINOES VÀ TRITERPENOID TỪ LÁ CÂY THỊ ĐÀI LÁ RỘNG - DIOSPYROS FLEURYANA LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Hà Nội - 2021 khoa luan, tieu luan1 of 102 Tai lieu, luan van2 of 102 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - - Hà Huy Tùng NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT NAPHTHOQUINOES VÀ TRITERPENOID TỪ LÁ CÂY THỊ ĐÀI LÁ RỘNG - DIOSPYROS FLEURYANA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Ninh Thế Sơn TS Nguyễn Thị Thu Hà Hà Nội - 2021 khoa luan, tieu luan2 of 102 Tai lieu, luan van3 of 102 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Nghiên cứu phân lập thử hoạt tính sinh học hợp chất naphthoquinoes triterpenoid từ Thị đài rộng - Diospyros fleuryana” thực với đồng ý hướng dẫn TS Ninh Thế Sơn TS Nguyễn Thị Thu Hà Đây chép cá nhân, tổ chức Các kết thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin luận văn tơi tiến hành, trích dẫn, tính tốn đánh giá Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung mà tơi trình bày luận văn Hà Nội, ngày 22 tháng 03 năm 2021 Học viên Hà Huy Tùng khoa luan, tieu luan3 of 102 Tai lieu, luan van4 of 102 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi cảm ơn sâu sắc đến TS Ninh Thế Sơn TS Nguyễn Thị Thu Hà – Phịng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam dành nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu giúp tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Để hồn thành luận văn này, Tơi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ Qũy phát triển khoa học công nghệ Quốc gia, MSĐT: Nafosted 104.012017.28 Tôi xin chân thành cảm ơn Học Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Hóa học – Viện HLKH & CN Việt Nam, Các cán phòng Hóa sinh ứng dụng, Trung tâm nghiên cứu phương pháp Phổ ứng dụng Mặc dù tơi có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn tất nhiệt tình lực mình, nhiên khơng thể tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận đóng góp q báu q thầy bạn Hà Nội, ngày 22 tháng 03 năm 2021 Học viên Hà Huy Tùng khoa luan, tieu luan4 of 102 Tai lieu, luan van5 of 102 I MỤC LỤC MỤC LỤC I BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT IV DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ V DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VI DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC VIII MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHI DIOSPYROS 1.1.1 Sơ lược chi Diospyros 1.1.2 Các nghiên cứu ạt tính sinh h c chi Thị Diospyros 1.1.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa 1.1.2.2 Hoạt tính kháng viêm 1.1.2.3 Hoạt tính kháng khuẩn 1.1.2.4 Hoạt tính kiểm sốt huyết áp 10 1.1.2.5 Hoạt tính bảo vệ hệ thần kinh 10 1.1.2.6 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 11 1.1.2.7 Hoạt tính điều trị tiểu đường 13 1.1.3 Một số nghiên cứu chi Thị Việt Nam 14 1.2 GIỚI THIỆU VỀ HỢP CHẤT NAPHTHOQUINONES VÀ TRITERPENOID 16 1.2.1 Sơ lược hợp chất naphthoquinones 16 1.2.2 Sơ lược hợp chất triterpenoid 17 khoa luan, tieu luan5 of 102 Tai lieu, luan van6 of 102 II 1.3 ỨNG DỤNG CỦA CHI THỊ - DIOSPYROS TRONG ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG 18 1.3.1 Ứng dụng ức chế tế bào ung 18 1.3.2 Ứng dụng điều trị bệnh tiểu đường 19 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20 2.2 HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 20 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.3.1 Cá ươ g gâm iết 21 2.3.2 Các ươ g â sắc ký 23 2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 23 2.3.2.2 Phương pháp sắc ký cột (CC) 26 2.3.3 Cá ươ g lý ổ xá định cấu trúc 28 2.3.4 Cá ươ g ứu hoạt tính sinh h c 29 2.3.4.1 Phương pháp nghiên cứu tính gây độc tế bào 29 2.3.4.2 Phương thử hoạt tính ức chế enzym alpha-glucosidase 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 PHÂN LẬP CÁC VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY THỊ ĐÀI LÁ RỘNG 33 3.1.1 Quy trình phân lập 33 3.1.2 Cấu trúc kiện phổ hợp chất phân lập 35 3.1.3 Xá định cấu trúc hợp chất phân lậ bằ g ươ g pháp quang phổ 36 3.2 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CHO CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP 61 khoa luan, tieu luan6 of 102 í qu g iê g Tai lieu, luan van7 of 102 3.2.1 Hoạ í III gây độc tế bào 61 3.2.2 Hoạt tính ức chế enzym alpha-glucosidase 64 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 4.1 KẾT LUẬN 67 4.2 KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC 76 khoa luan, tieu luan7 of 102 Tai lieu, luan van8 of 102 IV BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng anh Tên tiếng việt TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng CC Column Chromatography Sắc ký cột IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại MS Mass Spectroscopy Phổ khối lượng 1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR H-Nuclear Magnetic Resonance proton 13 C-NMR 13 C-Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon C-13 HSQC Heteronuclear single quantum Phổ tương tác hai chiều dị coherence spectroscopy HMBC H Heteronuclear Multiple hạt nhân Bond Phổ tương tác đa liên kết Correlation hai chiều dị nhân Proton-Chemical shift Độ dịch chuyển hóa học proton C Carbon-Chemical shift Độ dịch chuyển hóa học cacbon J Coupling constant Hằng số tương tác KB Human epidermic carcinoma Tế bào ung thư biểu mô Hep-G2 Hepatocellular carcinoma Tế bào ung thư gan LU Human lung carcinoma Tế bào ung thư phổi MCF-7 Human breast carcinoma Tế bào ung thư vú HPLC High Performance Liquid High Performance Liquid Chromatography Chromatography Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối IC50 tượng thử nghiệm khoa luan, tieu luan8 of 102 Tai lieu, luan van9 of 102 V DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ Bảng 1: Dữ kiện 1H (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) hợp chất DS-1 …………………………………………………………… 37 Bảng 2: Dữ kiện 1H (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) hợp chất DS-2 …………………………………………………………… 42 Bảng 3: Dữ kiện 1H (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) hợp chất DS-3 …………………………………………………………… 48 Bảng 4: Dữ kiện 1H (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) hợp chất DS-4 …………………………………………………………… 44 Bảng 5: Kết gây độc tế bào ung thư hợp chất thử nghiệm … 62 Bảng 6: Kết ức chế enzyme alpha-glucosidase hợp chất thử 65 nghiệm ………………………………………………………… Sơ đồ 1: Quy trình phân lập hóa học Thị đài rộng …………… 34 khoa luan, tieu luan9 of 102 Tai lieu, luan van10 of 102 VI DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1: Các hợp chất secoiridoid lignan phân lập từ lồi D kaki … Hình 2: Các dẫn xuất norbergenin phân lập từ loài D gilletii ……… Hình 3: Các hợp chất napthquinone triterpenoid phân lập từ cành loài D bipindensis ……………………………………………………… … Hình 4: Cấu trúc hai hợp chất naphthquinone có tác dụng kháng khuẩn …… Hình 5: Các hợp chất naphthalene glycoside naphthoquinone phân lập từ cành lồi D Lycioides ………………………………………….………… Hình 6: Các hợp chất phân lập từ thân cành loài D undulata ……… … 12 Hình 7: Các hợp chất phân lập từ D lotus D melanoxylon …….……… 14 Hình 8: Các hợp chất phân lập từ D decandra …………………………… 15 Hình 9: Các hợp chất naphthoquinone phân lập từ D greenwayi ………… 17 Hình 10: Cây Thị đài rộng-Diospyros fleuryana A Chev ex Lecomte … 20 Hình 11: Sắc khí mỏng chấm chạy dung mơi …………… 25 Hình 12: Sắc ký cột ………………………………………………… ……… 27 Hình 13: Các hợp chất napthoquione DS-1 DS-2 triterpenoid DS-3 DS-4 phân lập từ loài Thị Đài rộng …………………… 35 Hình 14: Cấu trúc tương tác HMBC hợp chất DS-1 ………… … 36 Hình 15: Phổ HRESI-MS (+) hợp chất DS-1 …….….…… …………… 38 Hình 16: Phổ 13C-NMR hợp chất DS-1 ……….………………………… 38 Hình 17: Phổ 1H-NMR hợp chất DS-1 …………… …………………… 39 Hình 18: Phổ HSQC hợp chất DS-1 ………………… ………………… 40 khoa luan, tieu luan10 of 102 Tai lieu, luan van97 of 102 85 [M-H2O+H]+ Phụ lục 10: Phổ ESI-MS (+) hợp chất DS-3 khoa luan, tieu luan97 of 102 Tai lieu, luan van98 of 102 86 Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR hợp chất DS-3 khoa luan, tieu luan98 of 102 Tai lieu, luan van99 of 102 87 Phụ lục 12: Phổ 13C-NMR hợp chất DS-3 khoa luan, tieu luan99 of 102 Tai lieu, luan van100 of 102 88 Phụ lục 13: Phổ HSQC hợp chất DS-3 khoa luan, tieu luan100 of 102 Tai lieu, luan van101 of 102 89 Phụ lục 14: Phổ HMBC hợp chất DS-3 khoa luan, tieu luan101 of 102 Tai lieu, luan van102 of 102 90 [M-H2O+H]+ [M+H]+ Phụ lục 15: Phổ HRESI-MS (+) hợp chất DS-4 khoa luan, tieu luan102 of 102 Tai lieu, luan van103 of 102 91 Phụ lục 16: Phổ 1H-NMR hợp chất DS-4 khoa luan, tieu luan103 of 102 Tai lieu, luan van104 of 102 92 Phụ lục 17: Phổ 13C-NMR hợp chất DS-4 khoa luan, tieu luan104 of 102 Tai lieu, luan van105 of 102 93 Phụ lục 18: Phổ HSQC hợp chất DS-4 khoa luan, tieu luan105 of 102 Tai lieu, luan van106 of 102 94 Phụ lục 19: Phổ HMBC hợp chất DS-4 khoa luan, tieu luan106 of 102 ORIGINAL ARTICLE Tai lieu, luan van107 of 102 Discovery Phytomedicine 2020, Volume 7, Number 1: 42-46 Cytotoxic naphthoquinones from Diospyros fleuryana leaves Nguyen Thi Thu Ha,1,2 Pham Van Cuong,3 Nguyen Thanh Tra,1,2 Nguyen Van Tuyen,1,2 Le Thi Tu Anh,1 Ba Thi Cham,1 Ha Huy Tung,2 Ninh The Son1,* CrossMark ABSTRACT In the search for anti-cancer plants in Vietnam, the leaves of Diospyros fleuryana were selected for chemical investigation Phytochemical analysis of the ethyl acetate (EtOAc) extract led to the isolation of two naphthoquinones isodiospyrin,1 and 8’-hydroxyisodiospyrin,2 and one isoflavone 7-O-methylbiochanin A.3 The chemical structures of isolated compounds were determined by 1D-NMR (1H, and 13C-NMR), 2D-NMR spectra (HSQC, and HMBC), and MS spectroscopy Compound was isolated from genus Diospyros for the first time Regarding the strong IC50 values of 2.27, and 8.0 µM against KB, and Hep cell lines respectively, cytotoxic examination suggested that compound is a promising agent in anti-cancer treatment Keywords: Diospyros fleuryana; naphthoquinone; isoflavone, cytotoxicity Correspondence to: Ninh The Son (Ph.D): Institute of Chemistry, Vietnam Academy of Science and Technology (VAST); 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Hanoi, Vietnam yamantson@gmail.com * Cite This Article: Ha, N.T.T., Cuong, P.V., Tra, N.T., Tuyen, N.V., Anh, L.T.T., Cham, B.T., Tung, H.H., Son, N.T 2020 Cytotoxic naphthoquinones from Diospyros fleuryana leaves Discovery Phytomedicine 7(1): 42-46 DOI:10.15562/ phytomedicine.2019.117 INTRODUCTION RESULT AND DISCUSSION Genus Diospyros belongs to the family Ebanaceae, comprising of about 500 species and widely distributed in tropical and subtropical regions.1 As a rich resource of active compositions, the plants of this genus are always seeking in both phytochemical and pharmacological aspects A diversity of isolated metabolites such as polyphenols, terpenoids, hydrocarbons, lipids, benzopyrones, especially naphthoquinones has been reported.2 In the meantime, in-vitro, in-vivo, and clinical studies dealt with the uses of Diospyros extracts, as well as their isolated compounds in treating anti-oxidant, anti-diabetic, anti-bacterial, anti-oxidant, anti-hypertensive, anti-inflammatory, cosmeceutical, enzyme-inhibitory, cardioprotective and neuroprotective activities.2 In Vietnam, D fleuryana species, also known as Thi Dai La Rong, is now available from Thanhhoa to Nhatrang, and Tayninh.3 To the best of our knowledge, there have not been studies on chemical composition and biological activity for D fleuryana species With the deepest aim to search for potentially bioactive compounds from Vietnamese plants,4-12 we herein reported the chromatographic isolation, and structural elucidation of two naphthoquinones 1-2, and one isoflavone 3, together with their cytotoxic assay on four cancer lines KB, Hep, Lu, and MCF7 From EtOAc extract of leaves, two naphthoquinones 1-2, and one isoflavone were isolated from D fleuryana species for the first time, and their chemical structures are discussed in detail Compound was isolated as a yellow amorphous powder The molecular formula of was determined to be C22H14O6, based on the quasi-molecular ion peak observed at m/z 375.0 [M+H]+ in the positive ESI-MS spectrum The 1HNMR spectrum of compound showed characteristics of a dimeric naphthoquinones (Table 1), in which each monomeric part included proton signals [2  doublet protons H-2 (dH 6.94, 10.5 Hz) and H-3 (dH 6.92, 10.5 Hz), and singlet proton H-8 (dH 7.61); doublet protons H-2’ (dH 6.72, 10.5 Hz) and H-3’ (dH 6.94, 10.5 Hz), and singlet proton H-6’ (dH 7.30)] The 1HNMR spectrum in CDCl3 was also composed of methyl groups [7-CH3 (dH  2.01, s) and 7’-CH3 (dH 2.03, s)] in upfield, and hydroxy groups [5-OH (dH 12.05, s) and 5’-OH (dH 12.43, s)] in downfield The 13CNMR spectrum of compound featured 22 carbon signals assignable to methyl carbons (dC  20.4 and 20.6 ppm) methine carbons (dC 121.4-140.1), 10 aromatic quaternary carbons (dC 113.2-162.0), and carbonyl carbons (dC 184.4-190.3) The chemical structure of compound was further confirmed by 2D-NMR spectroscopies (HSQC and HMBC) As shown in Institute of Chemistry, Vietnam Academy of Science and Technology (VAST), 18 Hoang Quoc Viet, Caugiay, Hanoi, Vietnam Graduate University of Sciences and Technology, VAST Institute of Marine Biochemistry, Vietnam Academy of Science and Technology (VAST), 18 Hoang Quoc Viet, Caugiay, Hanoi, Vietnam khoa luan, tieu luan107 of 102 42  Discovery Phytomedicine 2020; 7(1): 42-46 doi: 10.15562/phytomedicine.2020.117 www.phytomedicine.ejournals.ca Cytotoxic naphthoquinones from Diospyros  Tai lieu, luan van108 of 102 Nguyen Thi Thu Ha, et al Table 1  1 H (500 MHz) and 13C-NMR (125 MHz) data of compounds 1-2 in CDCl3 Compound Position dC dH (J in Hz) Compound dH (J in Hz) dC 184.4 184.9 1’ 184.9 186.6 139.6 6.94 (d, 10.5) 139.7 2’ 140.1 6.72 (d, 10.5) 147.3 137.7 6.92 (d, 10.5) 138.0 3’ 138.8 6.94 (d, 10.5) 143.0 190.1 190.1 4’ 190.3 186.1 158.6 162.1 5’ 162.0 158.9 135.1 6’ 125.7 145.5 7’ 148.2 121.4 8’ 130.3 158.8 128.6 129.2 9’ 128.8 112.2 10 113.2 114.0 10’ 114.2 112.1 7-CH3 20.4 7’-CH3 20.6 7.30 (s) 6.77 (d, 10.0) 6.94 (d, 10.0) 125.7 7.30 (overlap) 129.7 7.28 (overlap) 146.8 129.7 7.61 (s) 7.28 (overlap) 127.1 2.01 (s) 20.6 2.03 (s) 13.4 2.19 (s) 1.86 (s) 5-OH 12.05 (s) 12.34 (s) 5’-OH 12.43 (s) 12.31 (s) 8’-OH 12.66 (s) Table 2  1 H (500 MHz) and 13C-NMR (125 MHz) data of compound in CD3OD Compound Position δc dH (J in Hz) 155.0 8.11 (s) 124.5 182.2 161.3 100.2 166.0 7-OCH3 56.1 3.91 (s) 94.8 6.37 (d, 2.0 Hz) 156.7 10 105.6 1’ 124.6 2’, 6’ luan, tieu luan108 of 131.3 khoa 102 www.phytomedicine.ejournals.ca 6.24 (d, 2.0 Hz) 7.50 (d, 9.0 Hz) Figure 1, naphtholquinone nuclei were established due to the key HMBC correlations H-3/C-1, C-2, C-4, and C-10, H-6/C-8, and C-10; H-2’/C-4’, C-9’, and C-10’, and H-3’/C-1’, and C-3’, H-6’/C-8’, and C-10’ Hydroxy groups located at carbons C-5 and C-5’ because of HMBC correlations 5-OH/C-5, C-6, and C-10; 5’-OH/C-5’, C-6’, and C-10’ HMBC correlations 7-CH3/C-7, and 7’-CH3/C-7’ allowed to determine the position of methyl groups at carbons C-7, and C-7’, respectively Finally, the key HMBC cross peak between 7’-CH3/C-6 indicated that two monomeric units connected through C-6–C-8’ bridge From the above findings and comparison with literature, compound was to be a dimeric naphtholquinone, named isodiospyrin.13 Compound was obtained as a red amorphous powder Its molecular formula was found to be C22H14O7 from the positive ESIMS quasi-molecular ion peak at m/z 391.0 [M+H]+ The 1HNMR spectrum of compound (in CDCl3) revealed the similar pattern of compound 1, with remarkable resonance signals of naphthoquinone nuclei at [H-2 (dH 6.77, d, 10.0 Hz), H-3 (dH 6.94, d, 10.0 Hz), and H-6 (dH 7.30, overlap); H-6’ and H-7’ (dH 7.28, overlap)], hydroxyl singlet signals at 5-OH (dH 12.34), 5’-OH (dH 12.31), and 8’-OH (dH 12.66), methyl singlet signals at 7-CH3 (dH 2.19), and 2’-CH3 (dH 1.86) The 13CNMR spectrum of compound contained 22 carbon signals, including methyl carbons, methine carbons, 11 aromatic quaternary carbons, and carbonyl carbons (Table  1) The chemical structure of compound was also determined by 2D-NMR spectra (HSQC and HMBC) Naphthoquinone nuclei have associated with the key HMBC correlations H-2/C-3, and C-4, H-3/C-1, and C-2, H-6/C-8, and C-10, H-6’/C-8’, and H-7’/C-5’; three hydroxy groups substituted at carbons C-5, C-5’, and C-8’ with the important HMBC cross peaks H-5/C-5, C-6, and C-10, H-5’/ C-5’, C-6’, and C-10’, and H-8’/C-7’, C-8’, and C-9’ Moreover, HMBC evidence H-7/C-6, C-7, and C-8, and H-2’/C-1’, C-2’, and C-3’ implied that methyl groups located at carbons C-7, and C-2’ From these results and a comparison with a previous report,14 the structure of compound was assigned to be 8’-hydroxyisodiospyrin Compound was precipitated out of EtOAc extract of D fleuryana leaves as a yellow amorphous powder The 1H-NMR was the characteristics of isoflavone, in which methine proton H-2 was found to be associated with a singlet signal at δH 8.11, two double signals resonating at δH 6.24, and δH 6.37 were assigned to aromatic methine protons H-6, and H-8, respectively Two methoxy group 7-OCH3, and 4’-OCH3 gave singlet signals at 3.91, and 3.85 ppm, respectively Symmetric phenyl unit (ring B of flavone) was found to appear at δH 7.50 (2H, d, Discovery Phytomedicine 2020; 7(1): 42-46 doi: 10.15562/phytomedicine.2020.117  43 Cytotoxic naphthoquinones from Diospyros  Tai lieu, luan van109 of 102 Nguyen Thi Thu Ha, et al Table 2  Continued Compound Position δc dH (J in Hz) 3’, 5’ 114.9 7.01 (d, 9.0 Hz) 4’ 159.7 4’-OCH3 55.8 3.85 (s) Table 3  The results in cytotoxic assay Inhibitory percentage No Concentration KB Hep Lu MCF7 128 (µg/mL) 90 86 85 86 32 77 53 40 35 37 21 26 11 13 7 IC50 (µM) 15.8 29.75 53.33 60.23 128 (µg/mL) 88 85 88 79 32 62 50 30 34 37 20 23 29 20 16 15 19 IC50 (µM) 20.48 32.0 65.1 66.13 128 (µg/mL) 88 90 92 84 32 82 81 77 50 79 50 33 34 EtoAc extract Compound Compound 2 46 43 14 24 IC50 (µM) 2.27 8.0 17.27 32.0 128 (µg/mL) 98 99 98 92 32 19 24 20 32 14 12 11 18 Compound Ellipticine khoa luan, tieu 11 IC50 (µM) 69.67 64.84 68.92 57.79 IC50 0.31 ± 0.02 0.38±0.02 0.41±0.03 0.54±0.05 9.0 Hz, H-2’, H-6’), and δH 7.01 (2H, d, 9.0 Hz, H-3’, H-5’) Based on the 13C-NMR/DEPT data [seven aromatic methines at δC 94.8-155.0 ppm, seven quaternary carbons at δC 105.6-166.0, and δC 182.2 (CO), together with two methoxy groups at δC 55.1 (7-OCH3), and 55.8 (4’-OCH3)], and compared with literature compound,15 isolated compound was unambiguously determined to be a isoflavone, which trivially named 7-O-methylbiochanin A. Despite the fact that this compound is now available in nature but this is the first time to found in genus Diospyros, to date Naphthoquinones derived Diospyros plants are recognized as useful agents in cytotoxic treatments For instance, plumbagin and 3,3’-biplumbagin from D shimbaensis exerted the IC50 values of 130.8, and 82.1 µM, respectively, against the growth luan109 102 of of MDA-MB-231 breast cancer cell.16 Our current 44  Discovery Phytomedicine 2020; 7(1): 42-46 doi: 10.15562/phytomedicine.2020.117 assay emphasized on using constituents from Vietnamese plant D fleuryana species for cytotoxic activities As resulted in Table 3, EtOAc extract has generated the moderate IC50 values of 15.8 and 29.75 µM repellent the growth of KB and Hep cell lines, and the weak IC50 of values of 53.33 and 60.23 µM with regards to Lu and MCF7 cell lines, respectively Similarly, isodiospyrin1 was found to inhibit KB and Hep cell lines with the moderate IC50 values of 20.48 and 32.0 µM, respectively, but suppress Lu and MCF7 cell lines with the weak IC50 values of 65.1 and 66.13 µM Of particular interest, respecting to the inhibition of KB and Hep cell lines, 8’-hydroxyisodiospyrin (2) has shown to consist of the strong IC50 values of 2.27 and 8.0 µM, respectively Compound also revealed the significant IC50 values of 17.27 and 32.0 µM towards Lu and MCF7 cell lines Isoflavone mostly controlled the growth of four tested cancer cell lines at a high concentration of 128.0 µg/mL, and induced a range of IC50 values of 57.79-69.67 µM The currently cytotoxic record from D fleuryana species is the first time, thereby expecting that the extensive evidence on mechanisms is willing EXPERIMENTAL General experimental procedures ESI-MS spectrum was obtained with Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL spectrometer (USA) NMR spectra were recorded on a Bruker 500.13 MHz spectrometer, operating at 125.76 MHz for 13C NMR and at 500.13 MHz for 1H NMR Silica gel (40-63 µm), Sephadex LH-20 (25-100 μm), and RP-18 (Cosmosil C18-Prep, Kyoto-Japan) were used for column chromatography (CC) TLC silica gel 60 F254 (Merck) was used for thin-layer chromatography (TLC) Compounds were visualized under UV radiation (254, and 365 nm), and by spraying plates with 10% H2SO4 followed by heating with a heat gun Plant materials Leaves of D fleuryana was collected in Ngoclac Thanhhoa province in January 2018 A voucher specimen VN-310 was identified by taxonomist Dr Nguyen Quoc Binh, Institute of Ecology and Biological Resources The plant sample was deposited in Laboratory of Application Biochemistry, Institute of Chemistry Extraction and isolation The dried ground leaves powder of D fleuryana (1.16 kg) was ultrasonically extracted times with EtOAc (10 L × 3) for 45 at 45 °C, and the combined extract was then concentrated under vacuum (20~30 mbar) at 50°C to give a EtOAc www.phytomedicine.ejournals.ca Cytotoxic naphthoquinones from Diospyros  Tai lieu, luan van110 of 102 Nguyen Thi Thu Ha, et al Figure 1 Chemical structures 1-3 and their key correlations in HMBC spectroscopy residue (155.0 g) This residue was subjected to silica gel (10 × 50 cm, 300.0 g) column chromatography, eluting with a gradient of n-hexane-acetone (9:1→ 0:10, v/v) and acetone-methanol (9:1→0:10, v/v), to yield 15 fractions (Fr.1-Fr.15) The fraction Fr.3 (1.5 g) was then diluted by dichloromethane to afford the soluble part (Fr.31), and the insoluble residue (Fr.32) The fraction Fr.31 (0.15 g) was chromatographed on Sephadex LH-20, eluting with methanol-dichloromethane (9:1, v/v), to yield fractions Fr.311-Fr.313 Compounds (5.0 mg), and 2  (6.0 mg) were isolated from the fraction Fr.312 (20 mg) by preparative TCL (n-hexane-acetone, 8:2, v/v) Similarly, the fraction Fr.7 (3.2 g) was subjected to silica gel column chromatography, eluting with dichloromethane-methanol (6:1, v/v), to yield fractions (Fr.71-Fr.76) Utilizing the reverse RP-18 column [methanol-water (1:1, v/v)] for the fraction Fr 713 (50 mg), compound (3.1 mg) was isolated as a pure compound Isodiospyrin (1): Yellow amorphous powder; ESI-MS (+): 375.0 [M+H]+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) and 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): see Table 1 8’-Hydroxyisodiospyrin (2): Red amorphous powder; ESI-MS (+): 391.0 [M+H]+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) and 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): see Table 7-O-Methylbiochanin A (3): Yellow amorphous powder; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) and 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): see Table khoa luan, tieu luan110 of 102 www.phytomedicine.ejournals.ca Cytotoxic activity assay MTT assay was used to determine the cytotoxic activity of EtoAc extract and isolated compounds 1-3 with human cancer cell lines (KB, LU-1, Hep-G2 and MCF-7) acquired from the American Type Culture Collection (ATCC).17 Cells were cultured in medium DMEM supplemented with 10% Fetal bovine serum (FBS), 1% Penicillin and Streptomycin and 1% L-glutamine, under a humidified atmosphere of 5% CO2 at 37°C Compounds were dissolved in DMSO at 20 mg/mL and a series of dilutions for each compound was prepared to final concentrations of 128, 32, 8, and 0.5 µg/mL Cells were separated with trypsin and seeded in each well with x104 cells per ml and were treated with sample different concentrations on 96-well plates Untreated cells represented the controls After 72h of treatment, an MTT solution (10 µl, 5 mg/mL) of phosphate buffer was added to each well for 4  hrs until intracellular purple formazan crystals are visible Remove MTT and add DMSO solution (100 µL) The optical density of the solution was determined by a plate reader BIOTEK at 540 nm The inhibition ratio was calculated based on the optical densities from the three replicate tests ACKNOWLEDGMENT This research was supported by the Vietnam National Foundation for Science and Technology Development (NAFOSTED) under grant number 104.01-2017.28 Discovery Phytomedicine 2020; 7(1): 42-46 doi: 10.15562/phytomedicine.2020.117  45 Cytotoxic naphthoquinones from Diospyros  Tai lieu, luan van111 of 102 DISCLOSURE STATEMENT No potential conflict of interest was reported by the authors REFERENCES Ganapaty S, Thomas PS, Karagianis G, Waterman  PG, Brun R Antiprotozoal and cytotoxic naphthalene derivatives from Diospyris assimilis Phytochemistry 2006; 67:19501956 https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2006.05.039 Abdur R, Uddin G, Patel S, Khan A, Halim SA, Bawazeer S, Ahmad K, Muhammad N, Mubarak MS Diospyros, an under-utilized, multi-purpose plant genus: A review Biomed Pharmacother 2017;91:714-730 http://dx.doi org/10.1016/j.biopha.2017.05.012 Hang PTT, Viet CTB, Son NT The proliferation and differentiation of pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells from Vietnamese drug formulations Discovery Phytomedicine 2019;6:172-173 http://dx.doi org/10.15562/phytomedicine.2019.96 Son NT, Suenaga M, Matsunaga Y, Chinh LV, Kubo M, Harada K, Cuong NM, Fukuyama Y Serine protease inhibitors and activators from Dalbergia tonkinensis species J Nat Med 2019 http://dx.doi.org/10.1007/s1141 8-019-01347-y Huong TT, Ha VT, Cuong TD, Son NT, Toan TQ, Anh HTN, Tram NTT, Woo SH, Kim YH, Cuong NM New constituents from the roots and stems of Paramignya trimera Nat Prod Commun 2019:1-5 http://dx.doi org/10.1177/1934578X19861015 Son NT, Oda M, Hayashi N, Yamaguchi D, Kawagishi  Y, Takahashi F, Harada K, Cuong NM, Fukuyama Y Antimicrobial activity of the constituents of Dalbergia tonkinensis and structural-bioactive highlights Nat Prod Commun 2018;13:157-161 https://doi org/10.1177/1934578X1801300212 Son NT, Harada K, Cuong NM, Fukuyama Y Two new carboxyethylflavanones from the heartwood of Dalbergia tonkinensis and their antimicrobial activities Nat Prod Commun 2017;12:1721-1723 https://doi org/10.1177/1934578X1701201115 Tram NCT, Son NT, Nga NT, Phuong VTT, Cuc NT, Phuong DT, Truan G, Cuong NM, Thao DT The hepatoprotective activity of a new derivative kaempferol glycoside from the leaves of Vietnamese Phyllanthus acidus (L.) Skeels Med Chem Res 2017;26:2057-2064 https://doi org/10.1007/s00044-017-1914-x Nguyen Thi Thu Ha, et al Khanh PN, Duc HV, Huong TT, Son NT, Ha VT, Van  DT, Tai BH, Kim JE, Jo AR, Kim YH, Cuong NM Alkyphloroglucinol derivatives and triterpenoids with solube epoxide hydrolase inhibitory activity from Callistermon citrinus Fitoterapia, 2016; 109:39-44 http:// dx.doi.org/10.1016/j.fifitote.2015.10.013 10 Son NT Genus Miliusa: A review of phytochemistry and pharmacology Evid Based Complement Alternat Med 2019;2019:ID 8314693 https://doi org/10.1155/2019/8314693 11 Son NT Genus Erythrophleum: Botanical description, traditional use, phytochemistry and pharmacology Phytochem Rev 2019;18:571-599 https://doi.org/10.1007/ s11101-019-09640-0 12 Son NT Secondary metabolites of genus Pandanus-an aspect of phytochemistry Mini Rev Org Chem 2019;16:689-710 https://doi.org/10.2174/15701 93X16666181206102740 13 Khan RM, Rwekika E A binaphthoquinone from Diospyros greeniwayi Phytochemistry 1998;49:2501-2503 https:// doi.org/10.1016/S0031-9422(98)00294-5 14 Amar Dev MJ, Rajarajeshwari N Phytoconstituents isolated from Diospyros oocarpa Thwatist Asian J Biomed Pharm Sci 2013;3:50-54 15 Lee SJ, Baek HJ, Lee CH, Kim HP Antiinflammatory activity of isoflavonoids from Pueraria Radix and biochanin A derivatives Arch Pharm Res 1994;17:31-35 https://doi org/10.1007/BF02978244 16 Aronsson P, Munissi JJE, Gruhonjic A, Fitzpatrick PA, Landberg G, Nyandoro SS, Erdelyi M Phytoconstituents with radical scavenging and cytotoxic activities from Diospyros shimbaensis Diseases 2016;4:3 https://doi org/10.3390/diseases4010003 17 Mosmann T Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays J Immunol Methods 1983;65:55-63 https://doi org/10.1016/0022-1759(83)90303-4 This work is licensed under a Creative Commons Attribution-Non Commercial-No Derivatives 4.0 International License To view a copy of this license, visit http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ khoa luan, tieu luan111 of 102 46  Discovery Phytomedicine 2020; 7(1): 42-46 doi: 10.15562/phytomedicine.2020.117 www.phytomedicine.ejournals.ca ... đích tìm dược liệu có hoạt chất chống ung thư điều trị bệnh tiểu đường tơi lựa chọn lồi Diospyros fleuryana làm đối tượng nghiên cứu với tên đề tài: ‘? ?Nghiên cứu phân lập thử hoạt tính sinh học hợp... nhằm mục đích nghiên cứu sơ chưa biết rõ thành phần hóa học dược liệu, dùng phương pháp cổ điển sử dụng dãy dung môi từ không phân cực đến phân cực mạnh để phân đoạn hợp chất khỏi dược liệu [53]... Tiến hành phân lập sắc ký phân đoạn F2 (3.0 g) cột silica gel với hệ dung môi rửa giải nhexan-diclometan (9:1, v/v), thu phân đoạn nhỏ kí hiệu F21-F27 Phân đoạn F23 (113.0 mg) tiếp tục phân lập