Nghiên cứu tinh sạch pullulan và tạo nano bạc pu AgNPs có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Mai Linh “NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PULLULAN VÀ TẠO NANO BẠC Pu-AgNPs CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH” LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Hà Nội – 2021 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Mai Linh “NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PULLULAN VÀ TẠO NANO BẠC Pu-AgNPs CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH” Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: Hƣớng dẫn 1: TS Đỗ Hữu Nghị Hƣớng dẫn 2: PGS.TS Ngô Kim Chi Hà Nội - 2021 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi dƣới hƣớng dẫn PGS.TS Ngô Kim Chi TS Đỗ Hữu Nghị khơng trùng lặp với cơng trình khoa học khác Các số liệu kết nghiên cứu nêu luận án trung thực, chƣa đƣợc sử dụng để bảo vệ học vị nào, chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả Nguyễn Mai Linh Lời cảm ơn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Ngô Kim Chi TS Đỗ Hữu Nghị công tác làm việc Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình bảo, động viên tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin cảm ơn Học Viện Khoa Học Cơng nghệ, phịng Đào tạo, thầy giáo, cô giáo cán thuộc Khoa Công nghệ Sinh học Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ tơi q trình học tập học viện Tơi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể anh chị nhân viên phịng thí nghiệm giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi q trình nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn tới ngƣời thân gia đình ln điểm tựa tinh thần vững chắc, chăm lo, động viên tơi, tồn thể bạn bè cộng tác giúp đỡ thời gian thực luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Nguyễn Mai Linh Danh mục ký hiệu chữ viết tắt AgNPs: Các hạt nano bạc Pu-AgNPs: Các hạt nano bạc sử dụng pullulan làm chất khử/chất ổn định Danh mục bảng Bảng 1.1: Tính chất điển hình pullulan Bảng 2.1: Tỷ lệ pha loãng đƣờng glucose………………………………… 39 Bảng 2.2: Pha dung dịch Pullulan nồng độ khác 41 Bảng 3.1: So sánh trình thu hồi sản phẩm rắn bằng…………………….52 Bảng 3.2: Khả thu hồi pullulan dung môi khác 53 Bảng 3.3: Kết đo độ nhớt dung dịch pullulan 10% 54 Bảng 3.4: Kết đo độ hấp thụ quang 55 Bảng 3.5: So sánh phổ FT-IR mẫu thử nghiệm mẫu chuẩn 57 Bảng 3.6: So sánh phổ FT-IR mẫu thử nghiệm với mẫu chuẩn nghiên cứu khác 62 Bảng 3.7: Kết đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật nano bạc PuAgNPs 64 Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.1: Sản phẩm pullulan dạng bột Hình 1.2: Cấu trúc hóa học đơn giản pullulan Hình 1.3: Các sản phẩm thực phẩm có sử dụng pullulan 10 Hình 1.4: Vỏ bao thuốc sử dụng pullulan 11 Hình 1.5: Nấm Aureobasidium pullulans đĩa thạch (ảnh phải) hình ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) khuẩn ty bào tử nấm (ảnh trái) 14 Hình 1.6: Cơ chế sinh tổng hợp pullulan giả định từ nghiên cứu 15 Hình 1.7: Sơ đồ khối quy trình tinh thu nhận pullulan 18 Hình 1.8: Cơ chế kháng khuẩn vật liệu nano bạc 21 Hình 2.1: Giới hạn định luật Beer hấp thụ quang…………………36 Hình 2.2: Đƣờng chuẩn pullulan 42 Hình 2.3: Hệ đo độ nhớt nhớt kế 43 Hình 2.4:Mơ tả thí nghiệm 45 Hình 3.1: Sản phẩm thu đƣợc sau trình lên men……………………… 49 Hình 3.2: Ảnh hƣởng nhiệt độ pH trình tẩy màu 50 Hình 3.3: Ảnh hƣởng nồng độ H2O2 trình tẩy màu 51 Hình 3.4: Hiệu suất thu nhận pullulan sử dụng dung mơi khác 53 Hình 3.5: Mẫu giấy chạy sắc ký 54 Hình 3.6: Phổ hồng ngoại FT-IR pulluulan tinh 56 Hình 3.7: Phổ hồng ngoại FT-IR pullulan tiêu chuẩn 56 Hình 3.8: Sự thay đổi màu sắc dung dịch sau phản ứng 58 Hình 3.9: Ảnh hƣởng nồng độ pullulan tới trình tổng hợp Pu-AgNP58 Hình 3.10: Sự thay đổi màu sắc dung dịch sau phản ứng 59 Hình 3.11: Ảnh hƣởng nồng độ AgNO3 tới trình tổng hợp Pu-AgNP 59 Hình 3.12: Sự thay đổi màu sắc dung dịch sau phản ứng 60 Hình 3.13: Ảnh hƣởng thời gian tới trình tổng hợp Pu-AgNP 60 Hình 3.14: Kích thƣớc hạt nano Pu-AgNPs 61 Hình 3.15: Kết phân tích phổ FT-IR nano bạc Pu-AgNPs 62 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ PULLULAN 1.1.1 Cấu trúc hóa học pullulan 1.1.2 Tính chất pullulan 1.1.3 Ứng dụng pullulan 10 1.1.3.1 Ứng dụng ngành công nghiệp thực phẩm 10 1.1.3.2 Ứng dụng ngành công nghiệp dược phẩm, y học 11 1.1.3.3 Ứng dụng số ngành công nghiệp khác 12 1.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PULLULAN TRÊN THẾ GIỚI 13 1.2.1 Tình hình sản xuất pullulan giới 13 1.2.2 Giới thiệu chủng giống Aureobasidium pullulans 13 1.2.3 Cơ chế lên men sinh tổng hợp pullulan 15 1.2.4 Phƣơng pháp tinh thu hồi pullulan 17 1.3 TỔNG QUAN VỀ NANO BẠC 19 1.3.1 Tính chất nano bạc 19 1.3.2 Nano bạc sức khỏe ngƣời 22 1.3.3 Ứng dụng nano bạc 23 1.3.3.1 Ứng dụng công nghiệp thực phẩm 24 1.3.3.2 Ứng dụng đồ gia dụng, sản xuất hàng tiêu dùng 24 1.3.3.3 Ứng dụng y tế 24 1.4 GIỚI THIỆU VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP TẠO NANO 25 1.4.1 Các phƣơng pháp tạo hạt nano từ polysaccharide 25 1.4.1.1 Tổng hợp hạt nano từ hóa keo giọt nhũ tương 25 1.4.1.2 Tổng hợp hạt nano nhờ liên kết cộng hóa trị 26 1.4.1.3 Tổng hợp hạt nano nhờ liên kết ion 27 1.4.2 Các phƣơng pháp chế tạo nano bạc 27 1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ LỰA CHỌN PHƢƠNG PHÁP CỦA ĐỀ TÀI 28 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 VẬT LIỆU 32 2.1.1 Nguyên liệu sử dụng 32 2.1.2 Hóa chất 32 2.1.3 Trang thiết bị sử dụng 32 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.2.1 Phƣơng pháp tinh pullulan 33 2.2.2 Phƣơng pháp tẩy màu sản phẩm trình lên men 34 2.2.3 Phƣơng pháp kết tủa thu hồi sản phẩm 37 2.2.4 Phƣơng pháp xác định đƣờng sót DNS 38 2.2.5 Phƣơng pháp xác định kiểm tra chất lƣợng pullulan 40 2.2.5.1 Xác định pullulan theo phương pháp enzyme đặc hiệu pullulanase 40 2.2.5.2 Định lượng pullulan theo phương pháp phenol sulfuric axit 41 2.2.5.3 Xác định độ nhớt nhớt kế 42 2.2.5.4 Định lượng đường Mono-, di-, oligosaccharide theo phương pháp anthrone-sulfuric axit 43 2.2.5.5 Xác định khối lượng pullulan phương pháp sấy 44 2.2.6 Phƣơng pháp tạo nano bạc Pu-AgNPs 45 2.2.7 Phƣơng pháp xác định sản phẩm 46 62 kích thƣớc hạt chƣa đồng có hạt có kích thƣớc lớn quy trình tổng hợp cịn đơn giản, chƣa đƣợc cơng nghiệp hóa 3.2.5 Kết xác định cấu trúc hạt nano bạc Pu-AgNPs Hình 3.15: Kết phân tích phổ FT-IR nano bạc Pu-AgNPs Bảng 3.6: So sánh phổ FT-IR mẫu thử nghiệm với mẫu chuẩn nghiên cứu khác ( cm-1) P.Kanmani, 2013 [47] V.S.Rama Krish Ganduri, 2016 [48] Mẫu nghiên cứu O-H 3200-3645 3345 3259.92-3371.29 3471.18 C-H 2700-3100 2914 2928.14 C=O 1000-1900 1649 1635.62-1638.48 1635.21 C-O-C 1000-1300 1015 1020.95-1154.26 1027.04 C=C 2040-2260 2088.08-2164.66 2056.65 Nhóm chức Mẫu chuẩn 63 Phổ FT-IR Pu-AgNPs tạo thành đƣợc so sánh với phổ FT-IR pullulan tiêu chuẩn để phân tích nhóm chức có Trong ta thấy, đỉnh hấp thụ bƣớc sóng 3471.18cm-1 cho thấy xuất nhóm –OH Một đỉnh hấp thụ khác bƣớc sóng 1635.21cm-1 cho thấy diện nhóm carbonyl C=O đặc trƣng Các đỉnh hấp thụ đặc trƣng cho nhóm chức khác so với mẫu chuẩn xuất lần lƣợt đỉnh hấp thụ bƣớc sóng 2928.14cm-1 đặc trƣng cho nhóm C-H, đỉnh hấp thụ bƣớc sóng 1027.04cm-1 đặc trƣng cho nhóm C-O-C, đỉnh hấp thụ khác bƣớc sóng 2056.65cm-1 đặc trƣng cho liên kết nhóm C=C Một đỉnh hấp thụ bổ sung bƣớc sóng 1383.89cm-1 cho thấy việc bị ảnh hƣởng diện AgNPs 3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA NANO BẠC Pu-AgNPs Pha loãng mẫu thử DMSO 10% phiến 96 giếng (template plate) theo nồng độ giảm dần (log2 cho thang nồng độ) Nhỏ mẫu từ phiến template lên phiến 96 giếng (phiến test) bổ sung dịch vi sinh vật để đƣợc dải nồng độ mẫu từ 200-100-50-25,5-12,5 µg/ml (lặp lại lần nồng độ) Để tủ ấm 37oC 24 vi khuẩn 30oC/48h nấm Quan sát mắt thƣờng để xác định giá trị ức chế tối thiểu (MIC) mẫu thử Kết đƣợc thể bảng 3.7 64 Bảng 3.7: Kết đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật nano bạc Pu-AgNPs Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, g/ml) STT Ký hiệu mẫu Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men E coli P aeruginosa B subtillis S aureus A niger F oxysporum S cerevisiae C albicans M1 - - - - - - - - M2 - - - - - - - - M3 - - - 200 - - 200 - M4 - - - - - - - - (-): không xác định (không biểu hoạt tính nồng độ thử nghiệm) Ghi chú: M1: Mẫu Pullulan; M2: Mẫu AgNO3 M3: Mẫu Pu-AgNPs dạng rắn M4: Mẫu Pu-AgNPs sau phản ứng dạng dung dịch Kết luận: Các mẫu M1 M2 không biểu hoạt tính kháng vi sinh vật, nhiên kết hợp với dạng nano (mẫu M3) biểu hoạt tính ức chế chủng vi khuẩn S aureus nấm men S cerevisiae với giá trị MIC = 200µg/ml, nhiên kích thƣớc nano tổng hợp đƣợc lớn nên chƣa biểu hoạt tính kháng khuẩn mạnh Mẫu M4 sản phẩm sau phản ứng tổng hợp nano bạc dạng dung dịch, thử nghiệm không cho thấy biểu ức chế vi sinh vật nồng độ nano bạc Pu-AgNPs dung dịch thấp, không đủ để ức chế vi sinh vật 65 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Luận văn đƣợc thực dựa việc tiếp nối kết dự án SXTN “Hoàn thiện công nghệ sản xuất pullulan ứng dụng sản xuất số sản phẩm thực phẩm” Kết dự án trình lên men sinh tổng hợp pullulan thu đƣợc hàm lƣợng sinh khối khô 20g/l Đề tài tếp tục tiến hành nghiên cứu tinh sạch, thu nhận pullulan từ trình lên men sinh tổng hợp chủng nấm Aureobasididum pullulans tổng hợp hạt nano bạc có sử dụng pullulan làm chất khử/chất ổn định, từ đánh giá đƣợc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hạt nano bạc tạo thành Kết đạt đƣợc nhƣ sau: - Sử dụng H2O2 nồng độ 12% để tiến hành tẩy màu sản phẩm lên men nhiệt độ 80-90oC pH=11-13, hiệu suất đạt > 95% sử dụng dung môi isopropanol với tỷ lệ 1:2,5 để kết tủa thu hồi sản phẩm Mẫu pullulan sau tinh có độ nhớt 146,75cP (nằm khoảng 100 – 180cP) độ tinh đạt khoảng 83% Đã chứng minh hình ảnh phổ FT-IR cho thấy nhóm chức đặc trƣng pullulan - Tổng hợp thành công hạt nano bạc Pu-AgNPs với dung dịch pullulan 5%, dung dịch AgNO3 9mmol/l điều kiện khuấy từ có gia nhiệt kết hợp siêu âm vi sóng thời gian 30-35 phút Kết đạt đƣợc dung dịch nano bạc tạo thành có màu sắc đặc trƣng từ vàng đến nâu vàng, hấp thụ bƣớc sóng cực đại khoảng 400-460nm, kích thƣớc hạt đo đƣợc 500nm, nhiên chƣa đồng thể nhóm chức đặc trƣng thông qua phổ FT-IR - Tiến hành đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định nano bạc Pu-AgNPs tổng hợp đƣợc cho kết mẫu có biểu hoạt tính ức chế chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus nấm men Saccharomyces cerevisiae với giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC = 200µg/ml 66 4.2 KIẾN NGHỊ Do khuôn khổ nghiên cứu luận văn có hạn, nghiên cứu luận văn có tính chất nghiên cứu Để áp dụng rộng rãi kết nghiên cứu luận văn vào thực tế cần phải có nghiên cứu toàn diện chuyên sâu nhằm mục đích nâng cao ứng dụng Từ kết nghiên cứu đạt đƣợc trên, số nội dung nghiên cứu cần đƣợc thực tốt bao gồm: - Nghiên cứu sâu yếu tố ảnh hƣởng khác đến trình tổng hợp hạt nano bạc Pu-AgNPs Sử dụng phƣơng pháp chuyên sâu để đánh giá kỹ hạt nano tạo thành - Nghiên cứu phƣơng pháp sinh học khác tạo nano bạc PuAgNPs để tạo hạt có kích thƣớc nhỏ hơn, biểu hoạt tính ức chế nhiều chủng vi sinh vật kiểm định khác - Đánh giá thêm hoạt tính sinh học khác nano bạc Pu-AgNPs để ứng dụng cho lĩnh vực khác 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Mishra.B and Vuppu.S, 2013, A study on Downstream Processing for the production of Pullulan by Aureobasidium pullulans–SB–01 from the Fermentation borth, (ISC – 2012), pp 16-19 [2] He.J.H, Kunitake.T, and Nakao.A, 2003, Facile insitu synthesis of noble metal nanoparticles in porous cellulose fibers, Chem.Master, 15, pp 44014406 [3] Raveendran.P, Fu.J, and Wallen.S.L, 2003, Completely "green" synthesis and stabilization of metal nanoparticles, J.Am.Chem.Soc,125(46), pp 1394013941 [4] Catley.B.J, Whelan.W.J, 1971, Observation on the structure of pullulan, Arch.Biochem.Biophys, (143), pp 138-142 [5] Leathers.T.D, 2003, Biotechnological production and applications of pullulan, Applied Microbiology and Biotechnology, 62, pp 468-473 [6] Yuen.S, 1974, Pullulan and its applications, Process Biochem, 22, pp 7-9 [7] Mishra.B, Vuppu.S, and Rath.K, 2011, The role of microbial pullulan, a biopolymer in pharmaceutical approaches: A review, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 01(06), pp 45-50 [8] Dumitrui.S, 1996, Polysaccharides in medicinal aplications CRC Press, Part I, 3:59-87 [9] Nguyễn Hà Bích Huyền, 2016, Nghiên cứu, tách chiết tinh enzyme acetyl esterase từ nấm Aureobasidium pullulans var namibiae, Khóa luận tốt nghiệp khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội, Hà Nội [10] Cheng.K, Demirci.A & Catchmark.J.M, 2011, Pullulan: biosynthesis, production, and applications, Appl Microbiol Biotechnol, 92, pp 29–44 [11] Phạm Thị Hằng, 2010, Nghiên cứu điều kiện tối ưu sinh tổng hợp pullulan khảo sát điều kiện thu hồi pullulan từ Aureobasidium pullulans IFO 4594, Luận văn thạc sĩ khoa học công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội, Hà Nội 68 [12] Dumitrui.S, 1996, Polysaccharides in medicinal aplications, CRC Press, Part I, 3:59-87 [13] Duong T.T, Le T.S, Tran T.T.H, Nguyen T.K, Ho T.C, Dao T.H, Le T.P.Q, Nguyen H.C, Dang D.K, Le T.T.H, Ha P.T, 2016, Inhibition effect of engineered silver nanoparticles to bloom forming cyanobacteria, Advances in Natutral Sciences: Nanoscience and Nanotechnology, 7(3) [14] Kim.J.S, Kuk.E, Yu.K.N, Kim.J.H et al, 2007, Antimicrobial effects of silver nanoparticles, Nannomedicine 3(1), pp 95-101 [15] Li.P, et al, 2005, Synergistic antibacterial effects of β-lactam antibiotic combined with silver nanoparticles, Nanotechnology, 16(9) [16] Morones.J.R, et al, 2005, The bactericidal effect of silver nanoparticles, Nanotechnology, 16(10), pp 2346-2353 [17] Oğuzhan.P and Yangılar.F, 2013 Pullulan: Production and usage in food ındustry, 4(3) pp 57-63 [18] Trần Thị Thu Hƣơng, Dƣơng Thị Thủy, Đặng Đình Kim, Hà Phƣơng Thƣ cs, 2015, Ảnh hƣởng số vật liệu nano kim loại Đến sinh trƣởng chủng VKL Microcystis aeruginosa KG, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 53 (3A), pp 65-79 [19] Trần Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Trung Kiên, Dƣơng Thị Thủy cs, 2016, Ảnh hƣởng vật liệu nano bạc lên sinh trƣởng bèo Lemma sp, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 14(2), pp 1-8 [20] Moghaddam.MG, Eslahi.H, 2014, Synthesis, characterization and antibacterial properties of a novel nanocomposite based on polyaniline/polyvinylalcohol/Ag, Arabian Journal of Chemistry, 7(5), pp 846-855 [21] Prabhu.S, Poulose.E.K, 2012, Silver nanoparticles: mechanism of antimicrobial action, synthesis, medical applications and toxicity effects, Int Nano Lett, 2, pp 1-10 69 [22] Nguyễn Thị Ngoan, 2016, Nghiên cứu, tổng hợp, đặc trưng vật liệu lai vô (Ag, Fe3O4) - hữu (chitosan) cấu trúc nano định hướng ứng dụng y sinh, Luận án tiến sỹ hóa học, Học viện Khoa học Công nghệ, Hà Nội [23] Trần Thị Ngọc Dung, Nguyễn Hoài Châu, Đào Trọng Hiền, Nguyễn Thúy Phƣợng, Ngô Quốc Bƣu, Nguyễn Gia Tiến, 2011, Nghiên cứu tác dụng băng nano bạc lên trình điều trị vết thƣơng bỏng, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 49(3) [24] U.S U.S.Environmental Protection, 1996, Silver; CASRN 7440-22-4 [25] Nguyễn Thị Thanh Bình cs, 2016, Nghiên cứu điều chế tiểu phân nano chứa bạc để ứng dụng dƣợc phẩm, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, 32(2), pp 32-47 [26] Kumar.A, Vemula.P.K, Ajayan.P.M, John.G, 2008, Sliver-nanoparticleembedded antimicrobial paints based on vegetable oil, Nat Mater, 7(3), pp 236-41 [27] Zhang.X-F, Liu.Z-G, Shen.W, Gurunathan.S, 2016, Sliver Nanoparticles: Synthesis, Characterization, Properties, Applications, and Therapeutic, Apporoaches, Int J Mol Sci, 17(9), p 1534 [28] Neu.H.C, 1992, "The crisis in antibiotic resistance", Science, 257(5073), pp 1064-1073 [29] Ventola.C.L, 2015, The Antibiotic Resistance Crisis Part1: Cause sand Threats, P&T, 40(4), pp 277–83 [30] Ventola.C.L, 2015, The Antibiotic Resistance Crisis Part 2: Management Strategies and New Agents, P&T, 40(4), pp.344–352 [31] Ruben.J, Morones-ramirez.J.Z, Winkler.J.A et al, 2013, Silver Enhances Antibiotic Activity Against Gram-Negative Bacteria Sci.Transl.Med, 5(190), pp.1–11 70 [32] Isok.H, Hwang.J.H, Choi.H, et al, 2012, Synergistic effects between silver nanoparticles and antibiotics and the mechanisms involved, J.Med Microbiol, 61(Pt12), pp.1719–1726 [33] Li.P, et al, 2005, "Synergistic antibacterial effects of β-lactam antibiotic combined with silver nanoparticles", Nanotechnology, 16(9) [34] Li.R, Chen.J, et al, 2016, Synergistic reaction of silver nitrate, silver nanoparticles, and methylene blue against bacteria, Proc Natl Acad Sci USA, 113(48), pp.13612–13617 [35] Venugopal.K, et al, 2017, Synthesis of silver nanoparticles (AgNPs) for anticancer activities (MCF7 breast and A549 lung celllines) of the crude extract of Syzygium aromaticum, J Photochem Photobiol B Biol, 167, pp 282–289 [36] Gurunathan.S, Lee.K.J, et al, 2009, Antiangiogenic properties of silver nanoparticles, Biomaterials, 30(31), pp 6341–6350 [37] A Martínez, A Fernández, E Pérez, M Benito, J.M.Teijón and M.D.Blanco, 2012, Polysaccharide-Based Nanoparticles for Controlled Release Formulations, The Delivery of Nanoparticles, pp.185-222 [38] Abid.J.P, Wark.A.W, et al, 2002, Preparation of silver nanoparticles in solution from a silver salt by laser irradiation, Chemical Communications, (7), pp 792-793 [39] Choy.K.S, Ren.C.Y, 2000, Synthesis of nanosized silver particles by chemical reduction method, Materials Chemistry and Physics, 64(3), pp 241246 [40] Đoàn Thị Kim Bông, 2012, Nghiên cứu điều chế dung dịch nano bạc kỹ thuật điện hóa siêu âm, Luận văn Thạc sĩ Cơng nghệ Hóa học, Đại Học Bách Khoa TP.HCM, TP.Hồ Chí Minh [41] Vigneshwaran.N, Ashtapure.N.M, et al, 2007, Biologycal synthesis of silver nanoparticles using the fungus Aspergillus flavus, Materials Letters, 61(6), pp 1413-1418 71 [42] Cho.K.H, Park.J.E, Osaka.T, Park.S.G, 2005, The study of antimicrobial activity and preservative effects of nanosilver ingredient, Electrochim Acta, 51(5), pp.956-960 [43] Taleb.A, Petit.C, Pileni.M, 1997, Synthesis of highly monodisperse silver nanoparticles from AOT reverse micelles: a way to 2D and 3D selforganization, Chem Mater., 9(4), pp.950-959 [44] Zhang.Z, et al, 2000, Stable silver clusters and nanoparticles prepared in polyacrylate and inverse micellar solutions, J Phys Chem B, 104(6), pp.1176-1182 [45] Lee.G.J, Shin.S.I, Kim.Y.C, Oh.S.G, 2004, Preparation of silver nanorods through the control of temperature and pH of reaction medium, Materials Chemistry and Physics, 84(2-3), pp.197-204 [46] Nabikhan.A, Kandasamy.K, Raj.A, Alikunhi.N.M, 2010, Synthesis of antimicrobial silver nanoparticles by callus and leaf extracts from saltmarsh plant, Sesuvium portulacastrum, Colloid Surf B Biointerfaces, 79(2), pp.488493 [47] Rajan.R, Chandran.K, et al, 2015, Plant extract synthesized silver nanoparticles: an ongoing source of novel biocompatible materials, Industrial Crops and Products, 70, pp.356-373 [48] Kulkarni.N and Muddapur.U, 2014, Biosynthesis of Metal Nanoparticles: A Review, Journal of Nanotechnology, pp 1-8 [49] Kanmani.P and Lim.S.T, 2013, Synthesis and characterization of pullulan-mediated silver nanoparticles and its antimicrobial activities, Carbohydrate Polymers, 97(2), pp 421-428 [50] Ganduri.V.S.R.K, et al, 2016, Pullulan-Stabilized Silver Nanoparticles Their Synthesis, Characterization and Application as Bactericidal Agents, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 6(7), pp 27-37 [51] Zhang.K, et al, 2017, Comparison of direct synthesis of silver nanoparticles colloid using pullulan under conventional heating and 72 microwave irradiation, Inorganic and Nano-Metal Chemistry, 47(6), pp 938945 [52] Nallusamy.S and Bahry.S.A, 2019, Synthesis of Pullulan-Mediated Silver Nanoparticles (AgNPs) and their Antimicrobial Activities, SQU Journal for Science, 24(2), pp 88-94 [53] Trần Vĩnh Hoàng, Nguyễn Xuân Mạnh, Vƣơng Thị Kim Oanh, Lê Thị Mai Hoa, Trần Đại Lâm, 2011, Nghiên cứu chế tạo thử hoạt tính kháng khuẩn dung dịch nano bạc sử dụng chitosan làm chất khử/chất ổn định, Tạp chí khoa học cơng nghệ, 49(6), 102-106 [54] Nguyễn Thanh Vũ, Huỳnh Quyền, Dƣơng Hoa Xô, Lê Quang Luân, 2017, Nghiên cứu chế tạo chế phẩm oligochitosan-bạc nano ứng dụng làm phân bón kháng bệnh héo vàng nấm fusarium oxysporum gây cà chua, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 15(1): 141-149 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Tiêu chuẩn chất lƣợng pullulan sau trình lên men, tinh thu hồi sản phẩm TT Tên tiêu Đơn vị pH (dung dịch 10%) Phương pháp thử Chỉ tiêu theo JECFA Chỉ tiêu công bố Đo máy Titrando 907 4,5-6,5 4,5-6,5 Độ ẩm % QCVN 421:2011/BYT