Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen lipl21 mã hóa lipoprotein từ leptospira interrogans trong escherichia coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Đặng Thị Quỳnh NGHIÊN CỨU NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN LipL21 MÃ HÓA LIPOPROTEIN TỪ Leptospira interrogans TRONG Escherichia coli LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM BỘ GIÁO DỤC Hà Nội – tháng 04 năm 2021 VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Đặng Thị Quỳnh NGHIÊN CỨU NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN LipL21 MÃ HÓA LIPOPROTEIN TỪ Leptospira interrogans TRONG Escherichia coli Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 19811017 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Nghiêm Ngọc Minh Hà Nội - 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học riêng Các số liệu sử dụng phân tích luận văn có nguồn gốc rõ ràng, công bố theo quy định Các kết luận văn chưa công bố nghiên cứu khác Hà Nội, ngàytháng Học viên Đặng Thị Quỳnh LỜI CẢM ƠN Hoàn thành đề tài nghiên cứu này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nghiêm Ngọc Minh – Viện Nghiên cứu hệ gen – Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình bảo, hướng dẫn, giúp đỡ động viên suốt q trình học tập nghiên cứu Đồng thời, tơi xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen thầy cô Học viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Võ Thị Bích Thủy – trưởng phịng Hệ gen học vi sinh cán bộ, học viên, sinh viên thuộc phòng Hệ gen học vi sinh, người giúp đỡ tơi nhiều để tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè động viên, khuyến khích tơi suốt q trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Đặng Thị Quỳnh DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Amp APS bp BSA CBB DNA E coli EDTA IPTG kb kDa L interroga L Batavia L Canicol L Grippotyph L Icterohaemorrh L Pomona LB LPS OD PBS PCR RNA SDS TBST TEMED DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Ưu loại vector pET 15 Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi LipL21 Fw/Rv 27 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 29 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector nhân dòng 31 Bảng 2.4 Thành phẩn phản ứng gắn .35 Bảng 2.5 Công thức pha gel tách 37 Bảng 2.6 Công thức pha gel cô 37 Bảng 2.7 Định lượng protein phương pháp Bradford 40 Bảng 3.1 Các vị trí nucleotide khác biệt năm chủng Leptospira 45 Bảng 3.2 Trình tự vùng epitope dự đốn gen Lipl21 .46 Bảng 3.3 Kết đo độ hấp thụ BSA bước sóng 595nm 63 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Tỷ lệ mắc bệnh Leptospirosis người hàng năm tồn cầu Hình 1.2 Hình dạng Leptospira interrogans kính hiển vi (KHV) điện tử quét Hình 1.3 Cấu trúc màng xoắn khuẩn Leptospira interrogans [2] 11 Hình 1.4 Bản đồ gen vector nhân dòng pJET 1.2 (Thermo Scientific) 14 Hình 1.5 Bản đồ gen vector biểu pET (Novagen) 18 Hình 1.6 Bản đồ gen vector biểu pGEX-6P-3 (Merch) 19 Hình 1.7 Đánh giá khả gây miễn dịch số chủng Leptospira sử dụng kháng huyết LipL32 tinh chế từ thỏ 22 Hình 1.8 Đánh giá tiêu chuẩn hóa nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp LipL32 pha loãng huyết với tỉ lệ 1:1000 .24 Hình 3.1 Trình tự nucleotit gen LipL21 tương đồng đối chiếu từ chủng vi khuẩn L interrogans Tên chủng vi khuẩn ký hiệu: 44 Hình 3.2 Trình tự axit amin gen LipL21 45 Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen LipL21 48 Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen LipL21 từ plasmid khuẩn lạc 1, 2, 3, 4, 49 Hình 3.5 Kết so sánh trình tự gen LipL21 chủng L Bataviae trình tự gen LipL21 vector nhân dịng pJET-LipL21 50 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm vector pJET- LipL21 51 Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm plasmid pET 32a 52 Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm cắt vector pJET-LipL21 enzyme giới hạn EcoRV XhoI 53 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm cắt vector pET32a enzyme giới hạn EcoRV XhoI 53 Hình 3.10 Điện di đồ kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi T7 promoter Fw/ T7 terminater Rv 54 Hình 3.11 Điện di đồ kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi LipL21 Fw/Rv 55 Hình 3.12 Điện di đồ kiểm tra biểu protein LipL21 E coli BL21 57 Hình 3.13 Điện di đồ kiểm tra biểu LipL21 E coli BL21 điều kiện nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác .58 Hình 3.14 Điện di đồ kiểm tra biểu LipL21 E coli BL21 điều kiện nồng độ cảm ứng IPTG khác 60 Hình 3.15 Điện di đồ kiểm tra biểu LipL21 E coli BL21 điều kiện thời gian cảm ứng IPTG khác 61 Hình 3.16 Đồ thị đường chuẩn BSA 63 Hình 3.17 Nồng độ protein phân đoạn tinh thu định lượng Bradford 64 Hình 3.18 Điện di đồ kiểm tra biểu pET32a-LipL21 E coli BL2 tinh 65 Hình 3.19 Phản ứng Western Blot kháng nguyên tái tổ hợp LipL21 với kháng thể thu từ huyết chuột 66 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH LETOSPIROSIS 1.1.1 Tổng quan tình hình giới 1.1.2 Tổng quan tình hình nước 1.2 VI KHUẨN LEPTOSPIRA 1.2.1 Giới thiệu chung vi khuẩn Leptospira 1.2.2 Đặc điểm cấu trúc hệ gen vi khuẩn Leptospira 1.2.3 Gen LipL21, protein LipL21 liên quan đến độc lực vi khuẩn Leptospira tính ứng dụng 1.3 NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI 1.3.1 Biểu protein ngoại lai E coli 1.3.2 Nhân dòng biểu gen vi khuẩn Leptospira interrogans CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU27 2.1 NGUYÊN LIỆU, MÁY MÓC 2.1.1 Nguyên liệu hóa chất 2.1.2 Máy móc, dụng cụ thí nghiệm 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp nhân dòng gen LipL21 vào vector pJET1.2 2.2.2 Phương pháp biểu gen LipL21 E coli BL21 2.2.3 Phương pháp thu, tinh sạch, đánh giá khả đáp ứng miễn dịch protein LipL21 tái tổ hợp CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 TẠO VECTOR MANG GEN LIPL21 APDV.000676 8(1).2020 impart resistance to colonization and reduce the tissue damage[23] To the best of our knowledge, this is the first research of rLipL21 lipoproteins LipL32 and LipL21 of Leptospira interrogans Clin Vaccine Immunol 17(5): 778-783 production as a vaccine candidate against Leptospirosis in Vietnam 10 Seenichamy A, Bahaman AR, Mutalib AR, Bejo KS (2014) Production and characterization of a polyclonal antibody of anti-rLipL21-IgG against Leptospira for early detection of acute leptospirosis BioMed Res Int 2014 However, further studies are needed to evaluate the effectiveness of this recombinant protein before it can be produced as a complete vaccine used in livestock production Conclusion 11 Cruz LS, Vargas R, Lopes AAJE (2009) Leptospirosis: A worldwide resurgent zoonosis and important cause of acute renal failure and death in developing nations Ethn Dis 19(1 Suppl 1): S137-S141 Thisstudy showed that the potential of rLipL21 as a multi- epitope antigen against five common strains in Vietnam 12 Samina I, Brenner J, Moalem U, Berenstein M, Cohen A, et al (1997) Enhanced antibody response in cattle against Leptospira hardjo by intradermal vaccination Vaccine 15(12-13): 1434-1436 Immunized mice showed a strongLeptospiraantigen-specific immune response, a reduction in tissue damage and colonization 13 Bharti AR, Nally JE, Ricaldi JN, Matthias MA, Diaz MM, et al (2003) Leptospirosis: A zoonotic disease of global importance Lancet Infect Dis 3(12): 757-771 and an increasing survival rate in challenge experiments Thus, the rLipL21 may be recommended as promising vaccine candidate 14 Yu K, Liu C, Kim BG, Lee D-YJ (2015) Synthetic fusion protein design and applications Biotechnol Adv 33(1): 155-164 against Leptospirosis Acknowledgement Thisresearchwasfunded VETVACO Join Stock Company, Vietnam References by 15 Rollauer SE, Sooreshjani MA, Noinaj N, Buchanan SK (2015) Outer membrane protein biogenesis in gram-negative bacteria Philos Trans R Soc B 370(1679): 20150023 the 16 Xiao G, Luo D, Kong L, Chen X, Sun D, et al (2016) Chimeric epitope vaccine against Dutta TK, Christopher M (2005) Leptospirosis-An overview J Assoc immunity in guineaLeptospirapigs.BMCinterrogansMicrobiol 16(1): 1-9 Physicians India 53: 545-551 17 Kumari A, Premlatha MM, Raja V, Mercy CSA, Sumathi K, et al (2018) Protective Loan HK, Van Cuong N, Takhampunya R, Kiet BT, Campbell J,ofet al (2015) immunity recombinant LipL21 and I-LipL21 against How important are rats as vectors of leptospirosis in the Mekong Delta CtriesLeptospira12(1):interrogans22-30 serovar Autumnalis N2 infection J Infect Dev of Vietnam? Vector Borne Zoonotic Dis 15(1): 56-64 18 Srikram A, Zhang K, Bartpho T, Lo M, Hoke DE, et al (2011) CrossLee HS, Khong NV, Xuan HN, Nghia VB, Nguyen VH, et al.immunity (2017) Seroprotective against leptospirosis elicited by a live, attenuated prevalence of specific leptospira serovars in lipopolysaccharide fattening pigs from mutant J Infect Dis 203(6): 870-879 provinces in Vietnam BMC Vet Res 13(1):19 125 Vilaysane A, Chun J, Seamone ME, Wang W, Chin R, et al (2010) The inflammasome promotes renal inflammation and contributes to Langston CE, Heuter KJ (2003) Leptospirosis:NLRP3 A re-emerging zoonotic CKD J Am Soc Nephrol 21(10): 1732-1744 disease Vet Clin North Am Small Anim Pract 33(4): 791-807 20 Xiang M, Shi X, Li Y, Xu J, Yin L, et al (2011) Hemorrhagic shock Cullen PA, Haake DA, Adler BJF (2004) Outer membrane proteins of activation of NLRP3 inflammasome in lung endothelial cells J Immunol pathogenic spirochetes FEMS Microbiol Rev 28(3): 291-318 187(9): 4809-4817 Gebriel A, Subramaniam G, Sekaran SJTB 21 (2006) The M, detection and Matsui Rouleau V, Ostells BL, Goarant C (2011) Gene expression characterization of pathogenic leptospira and the useofofimmune OMPs asmediators and histopathological findings in animal profiles models23(2): of leptospirosis: potential antigens and immunogens Trop Biomed 194-207 comparison between susceptible hamsters and resistant mice Infect Immun 79(11): 4480-4492 Cullen PA, Cordwell SJ, Bulach DM, Haake DA, Adler BJI, et al (2002) 22 Verma A, Stevenson B (2012) Leptospiral uveitis-there is more to it Global analysis of outer membrane proteins from than meets the eye! Zoonoses Public Health 59 (Suppl 2): 132-141 23 Zuerner RL (2015) Host response to leptospira infection Curr Top se rova r La i Infe ct Immun 70(5): 2311-2318 Cullen PA, Xu X, Matsunaga J, Sanchez Y, Ko AI, et al (2005) Surfaceome of Microbiol Immunol 387: 223-250 Li n Xa , Z o J, Qia n J, Ma o Y, Pa n J, Li L, e t a l (2010) Ide nti fica tion of immunodominant B-and T-cell combined epitopes in outer membrane Leptospira spp For possible submissions Click below: Submit Article Appro Poult Dairy & Vet Sci Copyright © : Vo Thi Bich Thuy ... KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Đặng Thị Quỳnh NGHIÊN CỨU NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN LipL21 MÃ HÓA LIPOPROTEIN TỪ Leptospira interrogans TRONG Escherichia. .. Leptospira interrogans Việt Nam Chính lý trên, tiếp tục thực đề tài: ? ?Nghiên cứu nhân dòng biểu gen LipL21 mã hóa cho Lipoprotein từ Leptospira interrogans Escherichia coli? ?? với mục tiêu: + Nhân. .. dụng 1.3 NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI 1.3.1 Biểu protein ngoại lai E coli 1.3.2 Nhân dòng biểu gen vi khuẩn Leptospira interrogans CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU27