Nghiên cứu chất màu chlorophyll và tối ưu hóa các điều kiện để tách chiết chất màu chlorophyll trong lá chè xanh

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC ===  === ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU CHẤT MÀU CHLOROPHYLL VÀ TỐI ƢU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN ĐỂ TÁCH CHIẾT CHẤT MÀU CHLOROPHYLL TRONG LÁ CHÈ XANH GV hướng dẫn : Ths Lê Thế Tâm SV thực : Hồ Thị Thanh Hoa Mã số sinh viên : 1152043891 Lớp : 52K3 - Công nghệ Thực phẩm Vinh, 05/2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Hồ Thị Thanh Hoa Mã số sinh viên Lớp: : 152043891 52K3 – Công nghệ thực phẩm Tên đề tài: “Nghiên cứu chất màu chlorophyll tối ƣu hóa điều kiện để tách chiết chất màu chlorophyll chè xanh” Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: -Nghiên cứu tổng quan chất màu, giá trị thành phần, cấu tạo chất màu chlorophyll -Nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll -Tách chiết chất màu với dung môi tương ứng : methanol,ethanol, axeton lựa chọn dung mơi thích hợp để tách chiết -Xác định yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết chất màu chlorophyll - Tối ưu điều kiện trình tách chiết phương pháp quy hoạch thực nghiệm để thu chất màu chlorophyll lớn chè xanh -Họ tên cán hƣớng dẫn: ThS Lê Thế Tâm Ngày năm 2016 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) Chủ nhiệm môn (Ký, ghi rõ họ, tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án tốt nghiệp tháng ngày tháng năm 2015 Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Hồ Thị Thanh Hoa Mã số sinh viên Khóa: : 1152043891 52K Ngành: Cơng nghệ thực phẩm Cán hướng dẫn: ThS Lê Thế Tâm Nội dung nghiên cứu, thiết kế: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… ………………………………………………… Nhận xét cán hƣớng dẫn: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2016 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Hồ Thị Thanh Hoa Mã số sinh viên : 1152043891 Khóa : 52K Ngành : Cơng nghệ thực phẩm Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… Nhận xét cán duyệt: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2015 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Nhiệm vụ đồ án CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chè 1.1.1 Giới thiệu chè 1.1.2 Đặc điểm sinh vật học chè 1.1.3 Các sắc tố có chè xanh 1.1.3.1 Chlorophyll 1.1.3.2 Anthocyanidins 1.1.3.3 Carotenoids 1.2.Tổng quan chất màu 1.2.1 Tổng quan chất màu thực phẩm sản xuất 1.2.2 Phân loại chất màu 1.2.2.1 Chất màu tự nhiên 1.2.2.2 Chất màu nhân tạo 1.2.3Nguyên tắc sử dụng chất màu thực phẩm 1.3 Chất màu chlorophyll 1.3.1 Giới thiệu chung 1.3.2 Cấu trúc chlorophyll 10 1.3.3 Phân loại 12 1.3.3.1 Chlorophyll a (C55H72O5N4Mg) 12 1.3.3.2 Chlorophyll (C55H70O6N4Mg) 13 1.3.3.3 Chlorophyll c 13 1.3.3.4 Chlorophyll d 14 1.3.4 Hàm lượng thành phần chlorophyll rau 14 1.3.5 Tính chất yếu tố ảnh hưởng đến ổn định chlorophyll 14 1.3.5.1 Tính chất vật lí 14 1.3.5.2 Tính chất hóa học 15 1.3.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến ổn định chlorophyll 17 1.3.7 Vai trò chlorophyll 21 1.3.8 Một số ứng dụng chlorophyll vào thực phẩm 22 1.3.8.1 Trong công nghiệp thực phẩm 22 1.3.8.2 Một số ứng dụng khác 23 1.4 Các phương pháp xác định chlorophyll từ thực vật 24 1.4.1 Phương pháp huỳnh quang 24 1.4.1.1 Phương pháp đo trực tiếp 24 1.4.1.2 Phương pháp ngâm chiết (gián tiếp) 25 1.4.2 Phương pháp trắc quang 25 1.4.3 Một số loại dung môi tách chiết 27 1.4.3.1 Acetone 27 1.4.3.2 Methanol 27 1.4.3.3 DMSO( dimethyl sunfoxide) 27 1.4.3.4 Ethanol 28 2.1 Thiết bị 29 2.2 Dụng cụ 29 2.3 Kỹ thuật thực nghiệm 29 2.3.1 Các dung môi dùng để tách chiết 29 2.3.2 Cở sở lý thuyết phương pháp tách chiết 29 2.3.3 Khảo sát yếu tố : thời gian, nồng độ dung môi thể tích dung mơi 30 2.3.4 Quy trình tách chiết chlorophyll 30 2.3.5 Thiết kế thí nghiệm để tối ưu hóa điều kiện tách chiết chlorophyll 31 3.1.Ảnh hưởng loại môi đến nồng độ chlorophyll thu nhận sau trình tách chiết 34 3.1.1 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến dịch chiết chlorophyll (Chl-ab) 35 3.1.2 Ảnh hưởng dung môi đến tỉ lệ chlorophyll a dịch chiết 36 3.1.3 Sự khác nồng độ chl-a chl-b dung môi 36 3.1.4 Lựa chọn dung môi tách chiết 37 3.2 Ảnh hưởng thời gian ủ dịch chiết dung môi tỉ lệ chlorophyll thu sau trình tách chiết 38 3.3 Xác định điều kiện tối ưu trình tách chiết chlorophyll dung môi ethanol 38 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị 45 PHỤ LỤC 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sự hấp thụ màu dung dịch màu 26 Bảng 2.1 Các mức yếu tố ảnh hưởng .32 Bảng 2.2 : Ma trận quy hoạch với biến ảo TYT 23 .32 Bảng 3.1 Nồng độ chlorophyll dung môi nồng độ khác 34 Bảng 3.2 Nồng độ chlorophyll qua khoảng thời gian khác 38 Bảng 3.3 Nồng độ chlorophyll trình tối ưu 38 Bảng 3.4 Kết phân tích ANOVA tối ưu trình tổng hợp yếu tố 39 Bảng 3.5 : Kết phân tích phù hợp mơ hình với thực nghiệm .39 Bảng 3.6 Các giá trị tối ưu yếu tố ảnh hưởng đến dịch chiết 43 Bảng PL1 Mật độ quang chlorophyll dung môi axetone .46 Bảng PL2 Nồng độ chlorophyll dung môi ethanol .46 Bảng PL3 Nồng độ Chlorophyll dung môi methanol 47 Bảng PL4 Giá trị trung bình độ lệch chuẩn dung môi methanol 47 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh chè xanh .3 Hình 1.2.Cấu tạo chlorophyll haemoglobin .10 Hình 1.3.Cấu tạo chlorohyll a 12 Hình1 Cấu tạo chlorophyll b 13 Hình 1.5 Quang phổ hấp thu chlorophyll 15 Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến dịch chiết chrophyll(Chl-ab) 35 Hình 3.2 Ảnh hưởng dung mơi đến tỉ lệ chl-a .36 Hình 3.3 Sự khác nồng độ chl-a chl-b dung môi nồng độ 70% 36 Hình 3.4 Sự tương thích mơ hình với thực nghiệm .40 Hình 3.5.Mơ hình đáp ứng bề mặt yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết chlorophyll .41 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ dungmôi thời gian đến nồng độ Chl-ab 42 Hình 3.7.Ảnh hưởng thời gian thể tích dung mơi đến nồng độ Chl-ab 42 Hinh 3.8.Ảnh hưởng thời gian nồng độ dung môi đến nồng độ Chl-ab 43 Hình 3.9 Độ hấp thụ quang bước sóng 652 nm (V/C=50 /70) 16h 44 Hình 3.10 Độ hấp thụ quang bước sóng 665 nm (V/C=50 /70) 16h .44 LỜI CẢM ƠN Trong năm học trường Đại học Vinh, giảng dạy, giúp đỡ tận tình thầy giáo mơn hóa thực phẩm Khoa hóa thầy cô giáo trường, em hồn thành chương trình học tập trang bị kiến thức để sẵn sàng vào hoạt động thực tế Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cơ! Đồ án thực phịng thí nghiệm Hóa Thực Phẩm, Trường Đại học Vinh Để hồn thành tốt đồ án trước tiên tơi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo ThS Lê Thế Tâm người trực tiếp giao đề tài, hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian làm đề tài Nhân tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo giảng dạy Trường Đại học Vinh nói chung, thầy giáo khoa Hóa Học, mơn Cơng Nghệ Thực Phẩm nói riêng tận tình giảng dạy, truyền đạt cho kiến thức từ bước chân vào trường Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình bè bạn ln quan tâm, giúp đỡ, động viên suốt thời gian qua Vinh, ngày tháng năm 2016 - Mật độ quang dung mơi ( Bảng PL1,PL2,PL3) - Giá trị trung bình độ lệch chuẩn ( Bảng PL4) 3.1.1 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến dịch chiết chlorophyll (Chl-ab) nồng độ chl-ab (µg/l) 25 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến dịch chiết Chlab 20 15 70 10 80 90 axetone ethanol methanol dung mơi Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến dịch chiết chrophyll(Chl-ab) Qua biểu đồ kết tính tốn ta thấy : - Nồng độ chlorophyll( Chl-ab) khác qua dung môi khác nhau.Nồng độ chlorophyll(Chl-ab) dung môi axetone lớn nhất, ethanol dung mơi methanol có nồng độ chlorophyll(Chl-ab) thấp Dung mơi axetone nồng độ chlorophyll (Chl-ab) thu lớn Ở nồng độ 90% tổng nồng độ chlorophyll thu 23,30 (µg/l) - Đối với dung mơi methanol axeton nồng độ dung mơi lớn nồng độ Chl-ab tăng - Đối với dung mơi ethanol ta thấy nồng độ chlorophyll (Ch-ab) lớn nồng độ 80% sau nồng độ 90% nồng độ chlorophyll giảm dần SVTH: Hồ Thị Thanh Hoa 35 Lớp: 52K3 - CNTP 3.1.2 Ảnh hưởng dung môi đến tỉ lệ chlorophyll a dịch chiết 80 tỉ lệ chl-a (%) 70 60 50 40 axetone 30 ethanol 20 methanol 10 70 80 90 nồng độ dung mơi Hình 3.2 Ảnh hưởng dung môi đến tỉ lệ chl-a Qua biểu đồ kết tính tốn ta thấy: Tỉ lệ chlorophyll a khác qua dung môi Qua biểu đồ ta nhận thấy tỉ lệ chl-a lớn dung môi ethanol Cịn tỉ lệ chl-a hai dung mơi axeton methanol mức thấp gần 3.1.3 Sự khác nồng độ chl-a chl-b dung mơi Hình 3.3 Sự khác nồng độ chl-a chl-b dung môi nồng độ 70% Qua biểu đồ ta thấy khác rõ rệt nồng độ chl-a chl-b dung môi khác nồng độ 70% Ta thấy dung môi axetone methanol SVTH: Hồ Thị Thanh Hoa 36 Lớp: 52K3 - CNTP nồng độ chl-b lớn nồng độ chl-a Ngược lại dung mơi ethanol nồng độ chl-a lớn nhiều so với nồng độ chl-b gần tỉ lệ 3:1 Theo số nghiên cứu trước (Barrett & Jeffrey 1964), ezyme chlorophyllase giữ phần hoạt tính nồng độ dung mơi khác làm cho chlorophyll bị chuyển sang dạng đồng phân khác Mặt khác, hoạt động chlorophyll b reductase tạo phản ứng chuyển chlorophyll b thành chlorophyll a Có thể hoạt động hai enzyme trình tách chiết( giai đoạn ngâm, nghiền mẫu, lưu trữ loại dung môi nồng độ khác nhau) dẫn đến khác biệt lượng tỉ lệ chlorophyll thu nhận Các nghiên cứu cấu tạo chlorophyll cho thấy khác chlorophyll a chlorophyll b vị trí C7 chlorophyll a nhóm methyl(CH3) cịn chlorophyll b nhóm formyl (-CHO)(Woodward RB,1960) Như biết, acetone có cơng thức phân tử (CH3)2CO, methanol (CH3OH ethanol (C2H5OH hai dung mơi có chứa nhóm methyl, ethyl (CH2 nhóm hydroxyl (-OH) dễ dàng chuyển sang nhóm formyl Mặt khác, khả hịa tan chlorophyll khác dựa tỉ lệ dung môi khác dẫn đến khác biệt kết thí nghiệm 3.1.4 Lựa chọn dung mơi tách chiết Qua khảo sát nồng độ chlorophyll ba dung mơi điều kiện an tồn thực phẩm tơi chọn dung mơi ethanol để khảo sát tối ưu để tách chiết nồng độ chlorophyll Dung môi ethanol đảm bào điều kiện sau: - Nồng độ cholorophyll tách chiết dung môi ethanol mức cao - Qua khảo sát nồng độ chlorophyll trình tách chiết nồng độ 80% lớn sau đến nồng độ 90% nồng độ chlorophyll giảm nên tìm khoảng tối ưu nồng độ - Dung môi ethanol dung mơi rẻ tiền dễ kiếm, an tồn trình tách chiết SVTH: Hồ Thị Thanh Hoa 37 Lớp: 52K3 - CNTP 3.2 Ảnh hƣởng thời gian ủ dịch chiết dung môi tỉ lệ chlorophyll thu đƣợc sau trình tách chiết - Mật độ quang đo thời gian 16, 20, 24 điều kiện nhiệt độ 4-6 0C dung môi ethanol Kết tổng hợp bảng sau: Bảng 3.2 Nồng độ chlorophyll qua khoảng thời gian khác Thời gian 16 Chl-a Chl-b Chl-ab 14.43±0.12 5.10±0.06 19.53±0.08 Tỉ lệ chl-a (%) 73.88 20 16.18±0.08 5.34±0.07 21.52±0.10 75.15 24 15.34±0.10 5.12± 0.13 20.46±0.15 74.97 Chl-a,Chl-b, Chl-ab nồng độ chlorophyll (µg/l)trong 2g nhiệt độ 4-6 C nồng độ 80% dung môi ethanol Căn theo kết cho ta thấy thay đổi nồng độ chlorophyll (Ch-ab) qua thời gian ủ dịch khác Nồng độ Chl-ab lớn thời gian 20h 21.52 (µg/l) sau thời gian 24h nồng độ chl-ab lại giảm xuống cịn 20.46 (µg/l) 3.3 Xác định điều kiện tối ƣu q trình tách chiết chlorophyll dung mơi ethanol - Nồng độ chlorophyll trình tối ưu tính sau : Bảng 3.3 Nồng độ chlorophyll trình tối ưu STN 10 11 Nồng độ( C) 70 90 70 90 70 90 70 90 80 80 80 SVTH: Hồ Thị Thanh Hoa Thời gian(t) 16 16 24 24 16 16 24 24 20 20 20 Thể tích dung môi(V) 50 50 50 50 70 70 70 70 60 60 60 38 Chl-ab 12.32 11.286 16.849 17.675 10.677 10.386 8.505 12.178 18.476 18.494 18.497 Lớp: 52K3 - CNTP Bảng 3.4 Kết phân tích ANOVA tối ưu trình tổng hợp yếu tố Yếu tố Tổng bình phƣơng Bậc tự Trung bình bình phƣơng Giá trị p Giá trị F prob>F Mơ hình 220.88 31.55 2.760E+0.05