Góp phần nghiên cứu cây hoàng đằng (fibraurea tinctoria lour) thuộc họ tiết dê (menispermaceae) mọc hoang ở một số vùng ở nghệ an

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng LỜI CẢM ƠN Đề tài: "Góp phần nghiên cứu Hồng đằng (Fibraurea tinctoria.Lour) thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) mọc hoang số vùng Nghệ An" đƣợc thực từ tháng 10/2003 - 4/2004 Trong suốt trình thực đề tài nhận đƣợc nhiều giúp đỡ thầy giáo, nhân dân địa phƣơng nơi nghiên cứu đề tài Trƣớc tiên xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Tiến sỹ Hồng Văn Mại, ngƣời thầy ln tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Thạc sỹ Phan Xuân Thiệu, ngƣời giúp đỡ tơi tận tình q trình nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình thầy giáo, cán phụ tá phịng thí nghiệm Sinh lý - Hố sinh - Đại học Vinh giúp đỡ bạn bè nhƣ nhân dân địa phƣơng nơi thu mẫu vật Tôi xin chân thành cảm ơn ! Sinh viên Trần Đức Lương KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng MỞ ĐẦU Từ xa xƣa, ngƣời biết tìm cho thức ăn vị thuốc từ cỏ tập phân bịêt độc Nguyên liệu làm thuốc từ thực vật phong phú đa dạng Chúng đƣợc ngƣời nghiên cứu sử dụng từ xƣa đến Trong thời kỳ tân dƣợc chƣa phát triển nguồn thuốc chữa bệnh Mặc dù tiến hoá học thời gian gần cho phép phân lập đƣợc hoạt chất dạng tinh khiết, tổng hợp hoàn toàn điều chế hoạt chất nhân tạo với số lƣợng lớn bƣớc tiến vƣợt bậc, nhƣng hoạt chất từ cỏ giữ đƣợc tầm quan trọng với nhiều lý khác Alkaloid nhóm hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên quan trọng nhiều mặt Đặc biệt lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao Do lồi ngƣời biết khai thác sử dụng chúng, phát đƣợc 6000 hợp chất alkaloid khác Sự phân bố hợp chất alkaloid giới thực vật tƣơng đối rộng rãi, với 4000 lồi có chứa loại hợp chất này[1] Trong alkaloid tồn nhiều phận khác Cây Hoàng đằng (Fibraurea tinctoria Lour) thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) lồi thực vật có chứa alkaloid đƣợc sử dụng rộng rãi Theo "Dược liệu" nhà xuất Y học - 1983 dƣợc phẩm từ Hồng đằng có cơng dụng chữa đau mắt, mụn nhọt, sốt nóng, kiết lị ngộ độc thức ăn [5] Các nghiên cứu từ trƣớc đến đối tƣợng Hồng đằng cho thấy cơng dụng mà có đƣợc hợp chất alkaloid palmatin - thành phần hoạt chất - tạo Các nghiên cứu hàm lƣợng alkaloid toàn phần theo palmatin tính trung bình ngun liệu - 3% [4] Tuy nhiên chƣa thấy nghiên cứu cụ thể biến động hàm lƣợng alkaloid phận cây, đặc biệt nghiên cứu đối tƣợng Hoàng đằng mọc hoang Nghệ An - nơi có phân bố cao [1] KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng Cây Hoàng đằng mọc hoang số vùng Nghệ An từ lâu đƣợc nhân dân địa phƣơng sử dụng làm thuốc làm nguyên liệu nhuộm Gần Nghệ An, tƣợng thu mua nguyên liệu Hoàng đằng để xuất khẩu, chế biến với số lƣợng lớn diễn phổ biến Để tìm hiểu số đặc điểm thực vật, đánh giá chất lƣợng alkaloid Hoàng đằng điều kiện sinh cảnh Nghệ An nghiên cứu đề tài: "Góp phần nghiên cứu Hồng đằng (Fibraurea tinctoria Lour) thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) mọc hoang số vùng Nghệ An" Trên sở số liệu thu đƣợc đề xuất phƣơng pháp khai thác hợp lý, góp phần bảo vệ nguồn tài nguyên Do thời gian hồn thành luận văn có hạn nên khơng tránh khỏi thiếu sót, mong có góp ý, bổ sung thầy giáo, bạn đọc để có hồn thiện nghiên cứu sau KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng Chƣơng I TỔNG QUAN 1.1 Họ Tiết dê loài Fibraurea tinctoria Lour 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố họ Tiết dê Là bụi leo hay thân quấn gỗ nhỏ mọc đứng cắt ngang thấy tuỷ rộng, rễ đắng Lá có cuống, mọc so le, khơng có kèm thƣờng đơn, chét hay thuỳ có gân hình chân vịt Cụm hoa sim, chuỳ, bó nhỏ hoa mọc kẽ hay phát sinh từ chỗ già, hoa nhỏ, có màu khơng rõ rệt, đơn tính khác gốc, đều, không Hoa đực: Lá đài thành – hàng, hợp nhỏ hơn, cánh hoa thƣờng nhỏ đài, bé tý khơng có, rời liền, thƣờng có nhị khơng có, có mọc đối diện với cánh hoa rời liền nhau, bao phấn ngắn Hoa cái: Có hay khơng có nhị lép, - nỗn hay nhiều, rời nhau, khơng cuống hay có cuống, núm nhụy ngọn, nguyên hay thuỳ noãn, chẳng giảm xuống 1do bị teo dính vào đƣờng hàn bụng, nỗn hình hạch, có vết sẹo vịi gần gần gốc phát triển lệch tâm, không cuống hay có cuống, vỏ ngồi mỏng hay gần dày, vỏ ít, vỏ nhiều nhị giắn nhƣ xƣơng nháp, có u nhỏ hay có cạnh lồi; hạt nhiều cong thành hình móng ngựa có nội nhũ, phôi nhiều cong với rễ mầm nhỏ hạt dẹt mầm nửa hình trụ [16], [9] Về phân bố: Họ Tiết dê giới có khoảng 70 chi 450 loài, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới, nhiệt đới, có lồi vùng ơn đới bán cầu Bắc Nam (theo Takhtajan – 1966) Đây họ lớn phận bố rộng Ở Việt Nam họ Tiết dê có 18 chi khoảng 29 loài phân bố rộng rãi loại hình rừng nhiệt đới nhiệt đới nƣớc ta Có nhiều lồi dùng làm thuốc nên đƣợc gây trồng rộng rãi nhân dân từ đồng đến núi cao Trong loài phổ biến có nhiều lồi đặc hữu Bắc nhƣ Tinospora capillpes G., pridania petelotii G., Gần đặc hữu Việt Nam có Tinomiscium KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Trần Đức  Lƣơng tonkinensis G, Tinospora thorelli G Thành phần đặc hữu Đơng Dƣơng có: Cocculus sarmentocus D., [3] Họ Tiết dê có 70 chi có 30 chi có alkaloid với số loại alkaloid tìm đƣợc 172 chất khác [6] Nhiều loài họ đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng mặt hoá học Tập trung nhiều vào lồi có chứa alkaloid thuộc nhóm izoquinolin nhƣ bình vơi (Stephania rotunda), Vàng đắng (Coscinium fenestratum G.) Cây bình vơi đƣợc nghiên cứu nhiều nƣớc ta cho thấy củ bình vơi có chứa L - tetrahydropalmatin với hàm lƣợng từ 0,21% - 3,55% tuỳ vùng thu hái [1] Ngoài nghiên cứu gần xác định thêm nhiều hợp chất có củ bình vơi (Ngơ Thị Tâm - 1992, Phạm Thanh Kỳ - 1999, Nguyễn Thị Hoài An - 1993) nhƣ cepharanthin, stepharin, stepholidin… Các nghiên cứu khác Vàng đắng cho thấy hàm lƣợng alkaloid berberin từ 1,5 3% 1.1.2 Loài Fibraurea tintoria L Hoàng đằng cịn có tên khác Nam hồng liên, Thích hồng liên, Kham kham (Tày), Pàngpùi (Thái) … thuộc chi Fibraurea họ Tiết dê Là dây gỗ leo to, gỗ vàng Lá mọc so le có phiến xoan, đáy cắt ngang, đầu nhọn, không lông, gắn phiến Chùm tụ tán nách lá, hoa có đài, cánh hoa, hoa đực có tiểu nhị, có phù vịng dƣới bao phấn Hoa có tâm bì Quả nhân cứng - Phân bố: Hoàng đằng mọc hoang khắp vùng núi nƣớc ta từ Lạng Sơn Nam Bộ, phân bố phong phú vùng núi từ Nghệ An trở vào [1], [12] Thành phần hoá học: hoạt chất Hồng đằng alkaloid thành phần palmatin hàm lƣợng từ - 3%, cịn có jatrorizin columbamin R1O N R2O + OCH3 Palmatin: R1 = R2 = -CH3 Jatrorizin: R1 = -H, R2 = -CH3 Columbamin: R1 = -CH3, R2 = -H OCH3 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng Palmatin dạng clorid có tác dụng ức chế với tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) liên cầu khuẩn (Streptococcus), cịn lồi vi khuẩn khác (lị, thƣơng hàn …) khơng thấy có kết qủa rõ rệt [1] Do ngun liệu từ Hồng đằng dùng làm thuốc chữa đau mắt, sốt rét, lị, bệnh gan, viêm ruột, ỉa chảy dùng làm thuốc bổ đắng [5] Ta dùng palmatin để điều chế l- tetrahydropalmatin (rotundin) chất có tác dụng an thần [1] 1.2 Vài nét chung alkaloid 1.2.1 Khái niệm lược sử nghiên cứu alkaloid Đã từ lâu nhà khoa học tìm thấy hợp chất tự nhiên, hợp chất thƣờng axít chất trung tính Đến năm 1806 dƣợc sĩ Friedrich Wlihelm Sertiiner phân lập đƣợc chất từ nhựa thuốc phiện có tính kiềm gây ngủ mạnh ông đặt tên morphin Năm 1810 Gomes chiết đƣợc chất kết tinh từ vỏ Canhkina đặt tên cinchonin Sau P.J.Delletier J.B.Caventon chiết đƣợc hai chất có tính kiềm từ hạt loài thuộc chi Strychnos đặt tên Strychnin Brucin Đến năm 1819 dƣợc sĩ Wilhelm Messner đề nghị xếp chất có tính kiềm lấy từ thực vật thành nhóm riêng ơng đề nghị gọi tên alkaloid ngƣời ta ghi nhận Messner ngƣời đƣa khái niệm alkaloid có định nghĩa: alkaloid hợp chất hữu có chứa nitơ, có phản ứng kiềm chiết đƣợc từ thực vật Ngồi tính kiềm, alkaloid cịn có đặc tính khác nhƣ có hoạt tính sinh học mạnh, có tác dụng với số thuốc thử chung alkaloid … Sau Pôlônôski định nghĩa: “Alkaloid hợp chất hữu chứa nitơ, đa số có nhân dị vịng, có phản ứng kiềm, thường gặp thực vật động vật, thường có dược tính mạnh có phản ứng hoá học với số thuốc thử chung alkaloid ” [1] KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng Tuy nhiên số chất đƣợc xếp vào alkaloid nhƣng nitơ không dị vòng mà mạch nhánh ngƣời ta gọi alkaloid khơng có nhân dị vịng nhƣ: ephedrin, capsaicin, colchicin… Cũng cần lƣu ý số alkaloid phản ứng kiềm nhƣ colchicin lấy từ hạt tỏi độc, ricinin lấy từ hạt thân dầu, theobronin hạt cacao có alkaloid có phản ứng axit yếu nhƣ arecaidin guvacin hạt cau (Areca catechu) 1.2.2 Trạng thái tự nhiên phân bố 1.2.2.1 Phân bố alkaloid tự nhiên Trong tự nhiên alkaloid phân bố thực vật động vật nhƣng chủ yếu thực vật Trong mầm tìm thấy khoảng 500 alkaloit, hai mầm tìm thấy 3600 chất Ở thực vật hạt kín – Angiospermae phân bố alkaloid có tính nhảy vọt [7] Cromwell (1955) ƣớc tính alkaloid phân bố khoảng phần tổng số họ thực vật có hoa Một ƣớc tính khác (Hegnaner 1963) cho alkaloid có từ 12 – 20% tổng số có nhựa Cịn Willanam Schubert (1955) cho 300 họ ngành hạt kín 1/3 họ có chứa alkaloid Nhiều tổng kết cho thấy đại đa số có chứa alkaloid mầm Chỉ số mầm ngành hạt trần có chứa alkaloid Theo thống kê thân thảo bụi có nhiều alkaloid gỗ Cây năm sau có nhiều alkaloid lâu năm (Levin 1976) Alkaloid khơng có lồi sống nƣớc ngoại trừ họ Sen (Theo Mc.Nair 1943) Ngày nhà khoa học thống kê đƣợc khoảng 6000 alkaloid từ 5000 loài, hầu hết thực vật bậc cao chiếm khoảng 15 – 20% tổng số loài tập trung số họ nhƣ Graminaceae (34), Liliaecae (201), Ranunculaceae (267), Menispermaceae (172), Apocynaceae (800), Papaveraceae (383), Asteraceae (130) [1], [7] Trong số nghiên cứu ngƣời ta nhận thấy loài thực vật thuộc họ hay họ có quan hệ gần gũi thƣờng có alkaloid giống Ngay lồi nịi khác có thành KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng phần hố học khác Những năm gần có nhiều tài liệu đề cập đến vấn đề gọi nòi hố học (Chemical race) Từ “nịi hố học” để lồi nhƣng có vài đặc điểm khác so với nịi mặt hố học Hiện tƣợng thể rõ ràng số loài chứa alkaloid Sự phân bố địa dƣ nguyên nhân tạo nòi hoá học khác Các nghiên cứu tổng quan McNair (1935) Levin (1976) quan hệ alkaloid với yếu tố địa dƣ cho thấy rõ yếu tố ảnh hƣởng lớn hình thành alkaloid Cũng cần lƣu ý có trƣờng hợp loài họ thực vật mà chứa alkaloid hoàn toàn khác cấu trúc hố học Ở thực vật bậc thấp có phân bố alkaloit thƣa thớt nhiều, tìm thấy nấm cửa loả mạch (Clariceps purpurea), nấm Amanita phalloides Không thực vật mà động vật tìm thấy alkaloid với số lƣợng ngày tăng 1.2.2.2 Phân bố Alkaloid tổ chức Trong alkaloid thƣờng tập trung số phận định Alkaloid tập trung hạt nhƣ mã tiền, cà phê, tỏi độc… nhƣ ớt, hồ tiêu, thuốc phiện, nhƣ Beladon, coca, thuốc lá, chè…, hoa nhƣ cà độc dƣợc…, thân nhƣ ma hồng, lựu, hồng đằng…, củ nhƣ đầu, bình vơi, bách bộ… Nói chung alkaloid tập trung chủ yếu tổ chức sinh trƣởng hoạt động nhất, tổ chức nội bì ngoại bì túi nhựa mủ Mặc dù alkaloid tập trung chủ yếu tổ chức sinh trƣởng hoạt động mạnh nhƣng nồng độ alkaloid cao tế bào non tổ chức mà tế bào hố khơng bào, tế bào già mà khơng bào có nhiều alkaloid Hàm lƣợng alkaloid thƣờng thấp, từ số trƣờng hợp nhƣ canhkina hàm lƣợng alkaloid đạt – 10%, nhựa thuốc phiện có 20 – 30% Bình thƣờng dƣợc liệu chứa 1- 3% alkaloid đƣợc coi hàm lƣợng cao KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng Trong cây, alkaloid có trạng thái tự (alkaloid bazơ) mà thƣờng tồn dạng muối với axit hữu nhƣ malat, oxalat, acetat… đơi có dạng muối axit vô cơ, chúng tan dịch tế bào Ở số alkaloid kết hợp với tanin với acid hay với đƣờng [1] Điều đáng ý hàm lƣợng alkaloid phụ thuộc nhiều vào yếu tố khí hậu, ánh sáng, chất đất, phân bón, giống thời kỳ sinh trƣởng [13] Sự biến đổi hàm lƣợng alkaloid tổ chức q trình sinh trƣởng đáng kể Nói chung hàm lƣợng alkaloid tăng nhanh giai đoạn phát triển tế bào hố khơng bào, giảm dần giai đoạn già cỗi (Sinden ea al, 1973), tƣợng thể rõ ràng Điều cuối đáng lƣu ý thay đổi có tính chu kỳ số loài chứa alkaloid, chu kỳ vài tuần, vài tháng Trƣờng hợp dừa cạn (Catharanthus roseus L.) thí dụ [13] Tóm lại hàm lƣợng phân bố alkaloid biến động lớn Điều cho thấy cần thiết phải xác định thời điểm thu hái nguyên liệu hiệu cao 1.2.3 Cấu tạo hoá học phân loại alkaloid Xét mặt hoá học alkaloid amino bậc 1, bậc hay bậc amoni hydrat bậc Hầu hết alkaloid có nitơ tham gia vào nhân dị vịng, nhƣng có alkaloid mà nitơ ngồi vịng Ngày ngƣời ta thƣờng diễn tả alkaloid đƣợc tạo nên từ acid amin nitơ nằm nhân dị vòng “alkaloid thật” gọi chất tạo từ acid anim, nitơ mạch thẳng “Protoalkaloid” còn“Pseudoalkaloid” chất đƣợc tạo ngƣng tụ amoniac với hợp chất khơng có nitơ ví dụ nhƣ isoprenoid Alkaloid thƣờng đƣợc phân loại thuỳ theo cấu trúc nhân: 1.2.3.1 Alkaloid khơng có nhân dị vịng Những alkaloid thuộc nhóm có nitơ nẳm vạch thẳng, cịn gọi “protoalkaloid” ví dụ nhƣ hordenin (C10H15NO) mầm Mạch nha, mescalin (C11H17NO3) Lophophora williamsii, ephedrin (C10H15NO) Ma hoàng, conchicin (C22H23NO6) hạt tỏi độc, Capsaicin ớt KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng 1.2.3.2 Alkaloid có nhân dị vịng Các alkaloid loại có vịng hay nhiều vịng, ngƣời ta chia làm nhiều nhóm, ta nêu nhóm chính: Những alkaloid dẫn xuất nhân pyrol pyrolidin Những alkaloid dẫn xuất nhân piridin piperidin Những alkaloid dẫn xuất nhân tropan Những alkaloid dẫn xuất nhân quinolin Những alkaloid dẫn xuất nhân izoquinolin Nhóm có nhiều alkaloid đƣợc sử dụng điều trị Có thể chia làm phân nhóm: - Cấu trúc Tetralydvoisoquinolin - Cấu trúc Benzoquinolin - Cấu trúc Protoberberin - Cấu trúc Aporphin - Cấu trúc Morphinan - Cấu trúc Benzophenanthridin - Cấu trúc Emetin Những alkaloid dẫn xuất quinolizidin Những alkaloid dẫn xuất nhân Indol Đây nhóm quan trọng Alkaloid nhóm có giá trị sử dụng cao Có thể chia thành phân nhóm - Cấu trúc Indolalkylamin - Cấu trúc Physostigmin - Cấu trúc Eergolin - Cấu trúc Strychnin - Các alkaloid chi Catharanthus Những alkaloid dẫn xuất nhân imidazol Những alkaloid dẫn xuất nhân Purin 10 Những alkaloid dẫn xuất nhân quinazolin 11 Những alkaloid dẫn xuất Acridin 12 Những alkaloid dẫn xuất nhân Pirolizidin KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng 3.1.2.3 Giải phẫu 3.1.2.3.1 Cấu tạo cuống gân Cuống gân phân biệt mặt mặt dƣới rõ ràng, mặt phẳng lõm, mặt dƣới lồi Xét từ ngồi vào cuống hay gân gồm số phần nhƣ sau: Ngồi biểu bì (gồm có biểu bì biểu bì dƣới): gồm lớp tế bào hình chữ nhật xếp sít màng dày màng màng bên, chúng nhuộm màu xanh với thuốc nhuộm Bên ngồi biểu bì phủ lớp cutin Biểu bì phía dƣới tầng cutin mỏng có nhiều tế bào lỗ khí Nằm dƣới lớp biểu bì tế bào mơ cứng xếp sít từ 3-5 tế bào làm thành cụm, cụm cách bắt màu xanh với thuốc nhuộm Mặt dƣới cuống có số lƣợng mơ cứng nhiều Tiếp theo tế bào mô mềm nhuộm màu đỏ nhạt với cacmin tế bào tròn hay đa giác nhiều cạnh xếp sát chừa lại khoảng gian bào nhỏ Trong có bó mạch dẫn xếp theo hình vịng cung Chính bó to nhất, hai bên bó nhỏ Trong bó mạch dẫn phần gỗ nằm phía nhuộm màu xanh, phần libe nằm phía dƣới nhuộm màu đỏ nhạt Bao quanh bó mạch dẫn vịng mơ cứng gồm 4-5 lớp tế bào có vách dày nhuộm màu xanh đậm Rải rác tế bào mô cứng tinh thể canxi oxalat hình lập phƣơng Hình 4: Ảnh chụp vi phẫu gân F.tinctoria L 20 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng 3.1.2.3.2 Cấu tạo phiến Trên tiêu hiển vi ta thấy phiến lớp biểu bì gồm lớp tế bào, phía có tầng cutin Biểu bì dƣới tầng cutin hơn, lỗ khí có số lƣợng nhiều Tiếp theo lớp biểu bì tế bào mơ cứng nhộm màu xanh làm nhiệm vụ nâng đỡ Mặt phiến chúng tạo thành tia ăn sâu vào thịt lá, rải rác có tinh thể canxi oxalat hình lập phƣơng Phía phần thịt tế bào mô mềm nhuộm màu đỏ nhạt, chúng đƣợc đồng hoá trở thành hai dạng tế bào khác nhau: Mặt phía tế bào mơ dậu có dạng hình chữ nhật, chứa nhiều lục lạp, bao gồm 4-5 lớp tế xếp vng góc với tế bào biểu bì Tiếp theo tế bào mơ xốp, tế bào trịn hay nhiều cạnh, không đều, chúng xếp thƣa để hở nhiều khoảng trống chứa khí Tế bào mơ xốp chứa lục lạp tế bào mô dậu Phía dƣới sát với biểu bì có 1-2 lớp tế bào hình chữ nhật xếp ngang, sát mô dậu dƣới Trong phần mô mềm piến rải rác có tế bào chứa tinh thể canxi oxalat Hình 5: Ảnh chụp vi phẫu phiến F tinctoria L 21 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Trần Đức  Lƣơng Nhƣ xét mặt giải phẫu thực vật cấu tạo rễ, thân, Hoàng đằng - Fibraurea tinctoria L mọc hoang Nghệ An tuân theo thể thức cấu tạo chung rễ, thân, hai mầm sống điều kiện nhiệt đới Tuy nhiên với đặc điểm gỗ leo có kích thƣớc lớn mà có số đặc điểm sai khác chi tiết Chẳng hạn rễ, thân, Hồng đằng có phát triển mạnh mẽ cƣơng mô tạo thành vòng tròn liên tục rễ, vòng uốn lƣợn thân khe ăn sâu Có lẽ đặc điểm thích nghi điều kiện leo quấn Một đặc điểm bật hạn chế tế bào mơ mềm cấu tạo thân 3.2 Nghiên cứu alkaloid 3.2.1 Kết định tính 3.2.1.1 Soi tia UV Quan sát cắt ngang rễ,thân phơi khô dƣới ánh sáng đèn tử ngoại bƣớc sóng 365 nm thấy có tƣợng phát quang màu vàng tƣơi 3.2.1.2 Phản ứng tạo màu với thuốc thử H2SO4 đặc nƣớc clor (TT) Kết xuất vòng màu đỏ hai lớp dung dịch: thuốc thử mẫu thử Tiến hành phản ứng định tính với thuốc thử tạo màu phận khác ta thu đƣợc kết bảng Bảng 1: Phản ứng tạo màu với H2SO4 đ (TT) phận Hồng đằng Bộ phận định tính Đoạn Đoạn rễ gốc Mẫu Đoạn thân 1m Đoạn thân 2m Đoạn Đoạn Đoạn Đoạn thân thân thân 3m 5m 8m KI (l =5m) + + + + Mờ nhạt - KII (l = 12m) + + + + + + KIII (l=8m) + + + + Mờ nhạt - 22 - Lá - - - - - - KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Trần Đức  Lƣơng Qua bảng cho thấy phản ứng cho kết dƣơng tính phận rễ, gốc, thân 1m, thân 2m (KI, KII, KIII) Đối với mẫu KI, KIII đoạn thân 3m cho kết màu đỏ nhạt, đến đoạn thân 5m cho kết âm tính Với mẫu KII đoạn thân 3m đến 5m cho kết dƣơng tính, đoạn thân 8m khơng thấy vịng màu đỏ xuất Ở phản ứng âm tính mẫu nghiên cứu K I, KII, KIII Điều chứng tỏ thân non, hàm lƣợng alkaloid bé 3.2.1.3 Phản ứng tạo tủa với axit HNO3 32% cồn Khi đem dịch chiết nguyên liệu mẫu nghiên cứu phản ứng với thuốc thử HNO3 32%, dƣới kính hiển vi ta thấy xuất tinh thể hình kim màu vàng tƣơi Tiến hành nghiên cứu phận khác mẫu KI, KII, KIII ta thu đƣợc kết bảng Bảng – Phản ứng tạo tủa với HNO3 32% phận F.tinctoria L Bộ phận định Đoạn Đoạn tính rễ gốc Mẫu Đoạn Đoạn Đoạn Đoạn Đoạn Đoạn thân thân thân thân thân 1m 2m 3m 5m 8m KI l =5m + + + + - KII l = 12m + + + + + + KIII l=8m + + + + - Lá - - - - - - Bảng cho thấy phản ứng tạo tủa xảy với mẫu K I, KII, KIII đoạn rễ, gốc, thân 1m, thân m 23 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Trần Đức  Lƣơng Đối với KI đoạn thân 3m có tủa đến thân m khơng tìm thấy tủa Mẫu KIII thân 3m 5m xuất Với mẫu KII phản ứng tạo tủa xảy với tất mẫu thử thu từ rễ đến thân 5m, đoạn thân 8m khơng tìm thấy tủa Tuy nhiên phần phần lá, ba mẫu KI, KII, KIII không tìm thấy tủa So sánh kết hai bảng số liệu ta nhận thấy ăn khớp phản ứng tạo màu tạo tủa định tính alkaloid Kết cho thấy phần khơng tìm thấy alkaloid, phần thân non ít, cịn phần thân già rễ có phản ứng dƣơng tính Từ kết định tính cho phép ta xác định đƣợc nên định lƣợng phần phần không định lƣợng đƣợc phƣơng pháp cân 3.2.1.4 Sắc ký lớp mỏng Tiến hành sắc ký lớp mỏng với Silicagen G, màu thuốc thử Dragendorff Trên sắc ký đồ ta phát đƣợc vết màu vàng da cam đậm (Rf = 0,172) a1, a2: Dịch chiết alkaloid Hồng đằng a1 a2 Hình Sắc ký đồ phát alkaloid dịch chiết Hồng đằng 24 KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Trần Đức  Lƣơng So sánh với vết Palmatin sắc ký đồ dung dịch đối chiếu cho thấy vết có màu Rf với vết thử 3.2.2 Kết định lượng - Đối với mẫu nguyên liệu để nguyên lớp vỏ, phận rửa sạch, tán nhỏ, tiến hành định lƣợng thu đƣợc kết nhƣ bảng Bảng Hàm lượng alkaloid phận khác Hoàng đằng Bộ phận định lƣợng Mẫu Đoạn rễ nhánh (%) Đoạn rễ tận gốc (%) Đoạn gốc (%) Đoạn Đoạn Đoạn thân 1m thân 3m thân 5m (%) (%) (%) KI (l = 5m) 1,57 2,31 1,93 0,50 0,28 - KII (l = 12m) 2,24 2,70 2,33 1,87 1,25 0,92 KIII (l = 8m) 1,96 2,45 2,05 1,40 O,91 - - Đối với mẫu nguyên liệu cạo lớp bần sót lại ngồi lớp biểu bì, sau tán bột định lƣợng cho ta hàm lƣợng alkaloid phận theo bảng sau: Bảng Hàm lượng alkaloid phận khác Hoàng đằng Bộ phận định lƣợng Mẫu Đoạn rễ nhánh (%) Đoạn rễ tận gốc (%) Đoạn gốc (%) KI (l = 5m) 1,69 2,54 2,15 0,53 0,28 - KII (l = 12m) 2,55 3,15 3,02 2,31 1,47 1,32 KIII (l = 8m) 2,13 2,68 2,40 1,55 0,96 - 25 Đoạn Đoạn Đoạn thân 1m thân 3m thân 5m (%) (%) (%) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng So sánh kết hai bảng số liệu ta nhận thấy cạo bỏ lớp bần hàm lƣợng alkaloid nguyên liệu tăng lên đáng kể Điều chứng tỏ lớp bần phía ngồi chứa alkaloid Tỷ lệ tăng lớn thuộc đoạn gốc (tăng 1,11 lần mẫu KI, 1,29 lần mẫu KII 1,17 lần mẫu KIII) Phần rễ tăng hơn, chẳng hạn đoạn rễ nhánh mẫu KI tăng 1,08 lần, mẫu KII tăng 1,14 lần, mẫu KIII tăng 1,08 lần Càng lên phía thân non tỷ lệ tăng hàm lƣợng alkaloid giảm, chẳng hạn đoạn thân m mẫu KI gần nhƣ không tăng, mẫu KII tăng 1,12 lần, mẫu KIII tăng 1,05 lần Hàm lƣợng alkaloid tăng nhiều hay tỷ lệ thuận với chiều dày lớp bần phận Ở đoạn gốc có lớp bần dày nên loại bỏ lớp bần hàm lƣợng alkaloid tăng nhiều Ngƣợc lại phần thân 3m khả hoá thụ bì cịn nên chiều dày lớp bần mỏng dẫn đến hàm lƣợng alkaloid tăng không đáng kể trƣớc cạo lớp bần Hàm lượng (%) 3.5 2.5 KI(L=5m) KII(L = 12m) KIII(L =8m) 1.5 0.5 Đoạn rễ nhành Đoạn rễ tận gốc Đoạn gốc B phn nh lng Đoạn thân 1m Đoạn thân 3m Đoạn th©n 5m Biểu đồ 1: Hàm lượng alkaloid phận Hồng đằng 26 KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng Khi so sánh hàm lƣợng alkaloid phận ba mẫu K I, KII, KIII ta thấy hàm lƣợng alkaloid mẫu KII lớn nhất, sau đến KIII cuối KI Ta biểu diễn thay đổi hàm lƣợng alkaloid ba mẫu K I, KII, KIII theo biểu đồ Nếu tính chung hàm lƣợng alkaloid trung bình tồn K II có hàm lƣợng lớn (2,03%) tiếp đến KIII (1,94%) bé KI(1,43%) Kết tỷ lệ với kích thƣớc ba nghiên cứu: KI (dgốc = 3cm), KII (dgốc = 6,5cm), KIII (dgốc = 3,5cm) Nếu xét hàm lƣợng alkaloid phận ta thấy chúng thay đổi có tính quy luật Hàm lƣợng alkaloid đạt giá trị lớn đoạn rễ tận gốc: mẫu KI (2,54%), mẫu KII (3,15%), mẫu KIII (2,68%), sau có giảm dần hai phía rễ thân Càng phía thân non, hàm lƣợng alkaloid giảm nhanh, điều đƣợc thể độ dốc biểu đồ Điều đáng ý giảm đột ngột hàm lƣợng alkaloid từ đoạn gốc đến đoạn thân 1m KI (từ 2,15% xuống 0,53%), biểu đồ xuất đƣờng dốc đứng Kết đƣợc giải thích đặc điểm KI KI tái sinh sau bị cắt ngang phần gốc, thân phía phần nhánh tái sinh 27 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Trần Đức  Lƣơng Ta biểu diễn tỷ lệ phân bố alkaloid tổ chức theo biểu đồ dƣới đây: 2c 2a Chú thích 9,55% 2a: Mẫu KI 18,45% 10,64% 2b: Mẫu KII 2c: Mẫu KIII 16,71% 22,79% Đoạn rễ nhánh Đoạn rễ tận gốc Đoạn gốc Đoạn thân m Đoạn thân m Đoạn thân 5m 21,85% 2b Biểu đồ 2a, b, c Tỷ lệ phân bố alkaloid tổ chức ba mẫu nghiên cứu KI, KII, KIII (tính theo hàm lượng %) Biểu đồ cho thấy alkaloid chủ yếu tập trung phần rễ phần thân già Đối với KI alkaloid rễ chiếm 58,83%,phần gốc chiếm 29,9% phần thân 1m trở có 11,26% Cây KII phần rễ chiếm 41,25%, phần thân già chiếm 38,56%, phần thân đoạn 3m 5m chiếm 20,19% Cây KIII phần rễ chiếm 49,49%, phần thân già chiếm 40,64%, phần thân đoạn 3m trở có 9,87% Nhƣ già, kích thƣớc lớn tỷ lệ alkaloid phần thân so với phần rễ đƣợc tăng lên Kết phù hợp với số nghiên cứu trƣớc phân bố alkaloid Hoàng đằng cho alkaloid tập trung nhiều rễ thân già [1], [4], [5] 28 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng 3.2.3 Chiết xuất Trong trình nghiên cứu chúng tơi đề quy trình chiết xuất alkaloid phịng thí nghiệm đƣợc trình bày theo sơ đồ Thực quy trình chiết chúng tơi thu đƣợc 9,454g alkaloid tồn phần tính theo Palmatin Hàm lƣợng alkaloid nguyên liệu 1,950% (độ ẩm nguyên liệu 3.04%) Đem định lƣợng nguyên liệu chiết ta thu đƣợc hàm lƣợng alkaloid tồn phần tính theo Palmatin 2,67% Nhƣ hiệu suất quy trình chiết 73,03% Hiệu suất cao so với phƣơng pháp chiết suất Palmatin từ Hoàng đằng nƣớc giấm ăn Trịnh Gia Ân Phạm Đình Sửu KYCTNCDL - 1971 0,82% [6] 29 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Trần Đức  Lƣơng 500g bột Hồng đằng tán nhỏ lít cồn 900 Lặp lại -5 lần Bình lít Ép bã, thu lấy dịch Bã Cất thu hồi Dịch ép dung môi Cắn sau 4- lần chiết 700ml nước cất Bình 2000ml Để tủ lạnh 18 Lọc lấy dịch qua phễu lọc Thêm HCl 10% đến pH = - Để tủ lạnh 24 Gạn bỏ Cắn alkaloid Hoà tan 150 ml dịch Sơ đồ 1: Quy trình chiết xuất alkaloid tồn phần từ Hồng đằng 30 phía Thu lấy tủa bám xung quanh bình KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết thu đƣợc trình nghiên cứu chúng tơi có số kết luận nhƣ sau: - Cả mẫu Hoàng đằng thu đƣợc huyện Con Cuông, Anh Sơn, Yên Thành Nghệ An thuộc loài Fibraurea tinctoria Lour - Về cấu tạo giải phấu rễ, thân, loài F tinctoria L số vùng Nghệ An nói chung tuân theo thể thức cấu tạo mầm thân gỗ leo Ngồi có số sai khác chi tiết đặc biệt vòng mô cứng phát triển mạnh - Kết định tính cho thấy Hồng đằng thu Nghệ An chứa alkaloid mà thành phần palmatin - Hàm lƣợng alkaloid tồn phần tính theo palmatin Hoàng đằng Nghệ an cao Theo quy định dƣợc điển Việt Nam nguyên liệu đủ tiêu chuẩn để làm thuốc [4] - Kích thƣớc lớn hàm lƣợng alkaloid nguyên liệu cao Ở mẫu nghiên cứu KI(1,43%), KII (2,30%), KIII(1,94%) Do thu hái cần chọn có kích thƣớc phù hợp (đƣờng kính gốc lớn 3cm) - Ở phận khác hàm lƣợng alkaloid khác Hàm lƣợng cao rễ gìa gốc sau giảm dần hai phía rễ thân Ở phần khơng phát thấy alkaloid Do thu hái ta nên lấy phận già để có chất lƣợng nguyên liệu tốt Kiến nghị Do thời gian thực đề tài tƣơng đối ngắn nên đề tài giới hạn số vấn đề liên quan đến Hoàng đằng mọc hoang Nghệ An Xung quanh đối tƣợng nhiều vấn đề đòi hỏi thời gian nghiên cƣu dài đặc biệt vấn đề tái sinh cây, biến động hàm lƣợng alkaloid theo mùa, ảnh hƣởng đất đai khí hậu đến hàm lƣợng alkaloid … Vì cần có nghiên cứu để làm rõ nội dung 31 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ môn dƣợc liệu - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà nội (2002): Bài giảng dược liệu (tập 2) - NXB Y học Võ Văn Chi (1997): Từ điển thuốc - NXB Y học Vũ Văn Chuyên, Lê Trần Chánh, Trần Hợp (1987): Địa lý họ Việt Nam - NXB Khoa học kỹ thuật Dƣợc điển Việt Nam III (1996) NXB Y học, Hà Nội Dƣợc liệu (1983) NXB Y học Nguyễn Văn Dƣớng - Trần Hợp (1971): Kỹ thuật thu hái mẫu vật, làm tiêu cỏ NXB Nông nghiệp Nguyễn Văn Đàn - Nguyễn Viết Trực (1985): Phương pháp nghiên cứu hoá học thuốc NXB Y học TP Hồ Chí Minh Phạm Hoàng Hộ (1991 - 1993): Cây cỏ Việt Nam NXB KHKT Hà Nội J Hutchinson (1975): Những họ thực vật có hoa NXB KHKT Hà Nội 10 Trần Cơng Khánh (1981) : Thực tập hình thái giải phẫu thực vật NXB Đại học THCN Hà Nội 11 Trần Công Khánh (1980): Kỹ thuật hiển vi dùng nghiên cứu thực vật dược liệu NXB Y học Hà Nội 12 Đỗ Tất Lợi (1992): Những thuốc vị thuốc Việt Nam - NXB KHKT 13 R R Paris H.Moyse (1977) : Giản yếu dược liệu học (phần đại cương) -Vũ Ngọc Lộ dịch NXB Y học 14 Hoàng Thị Sản, Phan Nguyên Hồng, Nguyễn Tề Chỉnh (1980): Hình thái giải phẫu thực vật NXB Giáo dục 15 E Stahl (1969): Thin layer chromatography Springer N Y 16 Nguyễn Nghĩa Thìn (1997) : Cẩm nang nghiên cứu đa dạng sinh vật NXB Nơng nghiệp 32 KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP  Trần Đức Lƣơng MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Họ Tiết dê loài Fibraurea tinctoria Lour 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố họ Tiết dê 1.1.2 Loài Fibraurea tinctoria Lour 1.2 Vài nét chung alkaloid 1.2.1 Khái niệm lƣợc sử nghiên cứu alkaloid 1.2.2 Trạng thái tự nhiên phân bố 1.2.3 Cấu tạo hoá học phân loại alkaloid 1.2.4 Tính chất chung alkaloid 1.2.5 Chiết xuất 1.2.6 Định tính alkaloid nguyên liệu chế phẩm 1.2.7 Định lƣợng alkaloid 1.2.8 Sinh tổng hợp alkaloid 1.2.9 Vai trò alkaloid đời sống thực vật 1.2.10 Công dụng, tầm quan trọng alkaloid nguyên liệu chứa alkaloi CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp thu mẫu 2.2.2 Định loại thực vật 2.2.3 Giai phẩu hình thái thực vật 2.2.4 Phƣơng pháp định tính, định lƣợng alkaloid CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hình thái giải phẫu 3.1.1 Mơ tả hình thái ngồi tự nhiên phân loại thực vật 3.1.2 Giải phẫu thực vật 3.2 Nghiên cứu alkaloid 3.2.1 Kết định tính 3.2.2 Kết định lƣợng 3.2.3 Chiết xuất KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ * Tài liệu tham khảo 33 3 5 10 11 12 12 12 12 13 15 15 15 15 15 15 15 16 16 16 17 22 22 25 29 31 32 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP  Lƣơng 34 Trần Đức ... hiểu số đặc điểm thực vật, đánh giá chất lƣợng alkaloid Hoàng đằng điều kiện sinh cảnh Nghệ An chúng tơi nghiên cứu đề tài: "Góp phần nghiên cứu Hoàng đằng (Fibraurea tinctoria Lour) thuộc họ Tiết. .. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu Hoàng đằng – Fibraurea tinctoria Lour mọc hoang số vùng Nghệ An 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu... Cây Hoàng đằng mọc hoang số vùng Nghệ An từ lâu đƣợc nhân dân địa phƣơng sử dụng làm thuốc làm nguyên liệu nhuộm Gần Nghệ An, tƣợng thu mua nguyên liệu Hoàng đằng để xuất khẩu, chế biến với số