XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘT BIẾN GEN KatG LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC I SONIAZID CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LAO TẠI VIỆT NAM .pdf

XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘT BIẾN GEN KatG LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC I SONIAZID CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LAO TẠI VIỆT NAM .pdf

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Nhiễm vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) là một trong những

nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người Hiện nay tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lao được xác định là chiếm 1/3 dân số thế giới Có khoảng 9 triệu người mắc lao mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm Tuy vậy tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính Vì vậy còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị và đang tiếp tục làm lây lan bệnh cho c ộng đồng

Hiện nay, bệnh lao đang trở nên nghiêm trọng hơn với đặc trưng là kháng đa thuốc Trong các trường hợp bệnh lao kháng đa thuốc, khó khăn không chỉ là điều trị thất bại cao , dẫn đến lan truyền nhanh chóng vi khuẩn lao kháng đa thuốc mà còn chưa tìm ra được những thuốc thay thế hiệu quả và hợp lý , trong khi các thuốc chống lao thực sự có hiệu quả chỉ tập trung có 5 thuốc

Những bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc rấ t khó điều trị Do đó việc phát hiện sớm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc sẽ góp phần đáng kể trong điều trị bệnh lao

Để ch ẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc , hiện nay các cơ sở trong nước vẫn phải dựa vào nuôi cấ y vi khuẩn và làm kháng sinh đồ Thời gian chuẩn đoán lao kháng thuốc cần ít nhất 4 – 6 tuần Với thời gian dài như vậy sẽ khó khăn cho công tác điều trị , khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh toán bệnh lao

Khắc phục nhữ ng nhược điểm đó , việc ứng dụng sinh học phân tử đang tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày , với độ nhậy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho việc kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn

Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loại kháng thuốc là do các gen tương ứng chịu trách nhiệm

Ví dụ, nếu chỉ ra được độ t biến ở gen KatG cũng có nghĩa là chủng lao

đó kháng isoniazid

Xuất phát từ những lý do trên , chúng tôi tiến hành đề tài : "Xác định

các đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng thuốc i soniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam"

2 Mục tiêu nghiên cứu

1 Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu 2 Phát hiện đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng isoniazid ở

các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu

3 Nội dung nghiên cƣ́u

- Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu

- Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn

E coli

- Tách dòng gen katG - Giải trình tự gen katG

- Phát hiện, phân tích đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng

thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình bệnh lao

1.1.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới

Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay, trên thế giới chưa bao giờ và không có một quốc gia nào, một khu vực nào, một dân tộc nào không có người mắc bệnh lao và chết do lao [1] Do sự phát minh các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn giản hơn và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng chủ quan của y giới, đã làm lãng quên căn bệnh nguy hiểm này Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển

Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc [22]

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới) Theo số liệu công bố của TCYTTG (2004), ước tính trong năm 2003 có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và 2 triệu người chết do lao Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao [1,22]

Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo

ước tính của TCYTTG, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người) [22]

Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông nam Châu Á Dưới đây là ước tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực [22]

Bảng 1.1: Ƣớc tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực

Khu vực

Số BN (nghìn) Tỷ lệ/100 000 Tử vong do lao (bao gồm cả nhiễm HIV)

Các thể AFB (+)

Các thể

tới 70% đối tượng lao động chính của xã hội, làm lực lượng sản xuất bị giảm sút, năng suất lao động giảm và mùa màng, chợ búa sẽ không tham gia được Diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ nhất diễn ra năm 2001 tại trụ sở của ngân hàng thế giới ở Washington D.C với sự có mặt của đại diện cấp Bộ trưởng từ các quốc gia có tình hình bệnh lao nặng nề đã nhận định, bệnh lao là nguyên nhân chủ yếu làm nghèo đói dai dẳng và là trở ngại đối với sự phát triển kinh tế xã hội [22]

Bệnh lao là bệnh của người nghèo, lây lan nhanh trong cộng đồng có điều kiện sống chật chội, thiếu vệ sinh, thông khí và dinh dưỡng kém Trên 95% số bệnh nhân lao, 98% số chết do lao trên toàn cầu thuộc các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số người mắc bệnh lao ở các lứa tuổi 14-55, là tuổi làm ra nhiều của cải nhất trong cuộc đời [1, 22]

Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát triển

1.1.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam

Ở nước ta, bệnh lao còn phổ biến và ở mức độ trung bình cao Việt Nam đứng thứ 13 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu (TCYTTG, 2004) Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philipinnes về số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng

như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm [1]

Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao

toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách

thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt Nam đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những Chương trình y tế quốc gia trọng điểm Cùng với sự đầu tư phát triển các Chương trình y tế quốc gia nói chung, Bộ Y tế và Chính phủ đã ưu tiên đầu tư đồng bộ lượng rất lớn cán bộ, kinh phí và trang thiết bị cho Chương trình

chống lao Ban chỉ đạo Chương trình chống lao và chính quyền địa phương các cấp đã tham gia tích cực triển khai công tác này, cùng với sự hợp tác và giúp đỡ có hiệu quả về tài chính và kỹ thuật của các tổ chức quốc tế [4]

Năm 1996, Chương trình chống lao quốc gia (CTCLQG) với sự hỗ trợ về kỹ thuật và tài chính của Chính phủ Hà Lan, hiệp hội chống lao hoàng gia Hà Lan, uỷ ban hợp tác y tế Hà Lan - Việt Nam, CTCLQG đã hình thành và xây dựng kế hoạch phòng chống lao giai đoạn 1996-2000 Đến năm 1999, chiến lược DOTS (điều trị bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp) đã được bao phủ 100% số huyện trên cả nước [4]

Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của TCYTTG là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB (+) với tỷ lệ khỏi là 92% [3]

Năm 2002, khu vực Tây Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới Trong đó, số bệnh nhân do CTCLQG Việt Nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới [1]

Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh nhân, năm 1996, Việt Nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu của TCYTTG Việt Nam đã được TCYTTG và ngân hàng thế giới đánh giá cao thành tích đạt được trong mọi hoạt động chống lao Từ năm 1997, TCYTTG và hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế cùng phối hợp với CTCLQG Việt Nam tổ chức 8 khoá học về quản lý Chương trình chống lao cho các học viên quốc tế tại Việt Nam Mô hình hoạt động chống lao ở Việt Nam được xem là mô hình để học viên các nước học tập [4]

Vì là một trong số ít nước sớm nhất đạt được các mục tiêu phòng chống lao do TCYTTG đề ra, những kết quả đạt được có tính bền vững, nên tháng 10

năm 2003 vừa qua CTCLQG Việt Nam đã nhận được giải thưởng của hội chống lao hoàng gia Hà Lan (KNCV) nhân lễ kỷ niệm 100 năm ngày thành lập tổ chức này

Nhân ngày thế giới chống lao, 24/3/2004, tại diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ 2 do TCYTTG tổ chức tại New Dehli, CTCLQG Việt Nam là một trong 6 nước trên thế giới (bao gồm: Việt Nam, Peru, Madives, Cuba, Tunisia và Morocco) và là nước duy nhất trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao được nhận giải thưởng của TCYTTG về thành tích đã đạt được mục tiêu của TCYTTG và kết quả có tính bền vững trên 4 năm [4]

Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía nam là 2%, ở các tỉnh phía bắc là 1%)

Ước tính với dân số 70-80 triệu, hàng năm ở nước ta có một s ố lượng lớn người bị mắc lao mới Số lư ợng người mắc lao mới được thể h iện qua bảng 1.2

Bảng 1.2: Bảng ƣớc tính số bệnh nhân mắc lao mới qua mỗi năm ở Việt Nam

Nước ta thuộc loại trung bình về dịch tễ lao so với các nước vùng Tây Thái Bình Dương, vùng dịch tễ lao vào loại trung bình trên thế giới

Trên thực tế có thể chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5% như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơn Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác chống lao không những trong những năm tới mà có thể còn trong thời gian khá dài, ngay cả khi đã bước sang thiên niên kỷ mới

1.1.3 Tình hình lao kháng thuốc

Theo báo cáo dựa trên thăm dò lớn về lao kháng thuốc toàn cầu của TCYTTG công bố ngày 26/2/2008, tỷ lệ nhiễm lao kháng nhiều thuốc hiện nay ở mức cao chưa từng có Mỗi năm có khoảng nửa triệu ca lao kháng đa thuốc, theo ước tính của TCYTTG, chiếm khoảng 5% trong số 9 triệu ca nhiễm lao hàng năm Cũng trong báo cáo này, lần đầu tiên lao kháng thuốc cực mạnh được đề cập, đây là một dạng gần như không chữa lành được [5]

Theo TCYTTG, hiện nay bệnh lao kháng thuốc là một vấn đề toàn cầu, đặc biệt nghiêm trọng là tình hình kháng đa thuốc Bệnh lao kháng thuốc xuất hiện khi có vi khuẩn lao kháng với một hoặc nhiều loại thuốc chống lao, nguyên nhân là do bệnh nhân không hợp tác, không tuân thủ đúng nguyên tắc điều trị được quy định của chương trình chống lao , một nguyên nhân khác hay gặp là do thầy thuốc kê đơn không đúng do không phối hợp đầy đủ các thuốc chống lao, liều lượng thuốc không đủ, hướng dẫn bệnh nhân không đúng cách, điều trị không đủ thời gian

Kết quả điều trị với bệnh nhân kháng thuốc thường không cao, nhất là đối với bệnh nhân kháng đa thuốc Chi phí điều trị bệnh nhân lao kháng đa thuốc tăng lên 100 lần so với bệnh nhân lao không kháng thuốc và thậm chí không điều trị được ở một số trường hợp

Tỷ lệ kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới ở khu vực Tây Thái Bình Dương dao động trong khoảng 1% đến 10,8% (theo một số nghiên cứu trong khu vực) [4]

Dự án nghiên cứu kháng t huốc lao trên cơ sở toàn c ầu được thực hiện từ năm 1995 với mục tiêu là xác định được tổng số bệnh nhân lao kháng thuốc trên thế giới bằng những phương pháp thống nhất thử độ nhạy với thuốc lao của vi khuẩn Năm 1998, TCYTTG đã công bố kết quả khảo sát tình hình vi khuẩn lao kháng thuốc ở 35 nước và khu vực trên thế giới [6]

Theo công bố này, tỷ lệ kháng thuốc tiê n phát trung bình với riêng từ ng loại thuốc có khác nhau , cụ thể là : kháng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%,

ethambutol 0,3%, steptomycin 2,5% % , trong đó kháng steptomycin ở vùng Ivanovo (Nga) là nơi kháng đơn thuốc cao nhất Tỷ lệ kh áng thuốc tiên phát trung bình là 9,9 % trong đó kháng 1 thuốc chiếm 6,6 %, kháng 2 thuốc chiếm 2,5 %, kháng 3 thuốc chiếm 0,6 %, kháng bốn thuốc chiếm 0,2 %, kháng đa thuốc trung bình là 1,4 % Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát cao n hất 40,6 % ở cộng hòa Dominica , thấp nhất là 2% ở cộng hòa Séc [6]

Tình hình kháng thuốc mắc phải với từng loại thuốc cũng khác nhau : kháng isoniazid trung bình 6,3 %, rifampicin 0,7 %, ethambutol 0,4 %, steptomycin 2,6 % Kháng thuốc mắc phải với steptomycin ở Cuba có tỷ lệ cao nhất 57 % Tỷ lệ kháng thuốc mắc phải trung bình trên toàn thế giới là 36 %, trong đó kháng 1 loại thuốc 12,2 %, 2 loại thuốc 9,7 %, 3 loại thuốc 5,4 %, 4 loại thuốc 4,4 % Lao kháng đa thuốc mắc phải có tỷ lệ trung bình là 13 % Kháng đa thuốc mắc phải cao nhất ở Latvia , có tỷ lệ 54 % [6]

Vi khuẩn lao kháng đa thuốc là một thách thức lớn , đe dọa công cuộc phòng chống lao trên toàn cầu , vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay đang bị vi khuẩn lao kháng lại nhất là kháng đa thuốc Trong khi các thuốc chống lao hàng đầu chỉ có năm thuốc thì các thuốc chống lao loại hai lại

thường có độc tính cao và giá thành đắt [5]

Việc nghiên cứu lao kháng thuốc ở Việt Nam được tiến hành khá sớm Năm 1958 Phạm Ngọc Thạc h và cộng sự đã công bố t ỷ lệ kháng thuốc mắc phải v ới isoniazid là 53 %, với paraminosalicylic acid là 26 %, với steptomycin là 59 % [6]

Báo cáo của CTCLQG năm 1998 cho thấy tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao ở Việt Nam là một vấn đề đáng lo ngại Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát là 32,5 % đứng thứ tư trong khảo sát của TCYTTG sau Latvia (34%), Thái Lan (36,6%), và Cộng hòa Dominica (40,6%) Qua các nghiên cứu đã cho thấy Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ bệnh lao kháng thuốc cao trên thế giới [6]

Nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc là nguyên nhân dẫn đến thấ t bại trong điều trị Những bệnh nhân lao mới có thể chữa khỏi 95 – 100% Nhưng bệnh nhân lao kháng thuốc mắc phải , tỷ lệ chữa khỏi chỉ 20 – 30% [22] Kết quả còn thấp hơn nữa ở những trường hợp kháng đa thuốc mắc phải, thậm chí không chữa được Nguy hiểm hơn là các bệnh nhân này có thể tiếp tục truyền bệnh cho người khác Vì vậy việc phát hiện và ngăn chặn sự lan tràn của các chủng lao kháng đa thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong chiến lược điều trị lao hiện nay

1.2 Vi khuẩn lao

1.2.1 Đặc điểm phân loại

Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria , ngành Actinobacteria , bộ Actinomycetales , phân bộ, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium [18]

Tên khoa học của vi khuẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis

Các chủng vi khuẩn lao được chia làm 2 nhóm : Mycobacterium tuberculosis gồm bốn loài có khả năng gây bệnh ở người , và nhóm Mycobacteria other than tuberculosis gồm nhiều loài không gây bệnh ở

người [6,7]

1.2.2 Đặc điểm hình thể

Vi khuẩn lao có hình trực khuẩn , kích thước 2 – 4 μm, rộng 0,3 – 1,5 μm Trực khuẩn thanh mảnh , đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hình chữ N , Y, V hoặc thành dãy phân nhánh như cành cây

Vi khuẩn lao không di động , không sinh bào tử, khó bắt màu các thuốc nhuộm thông thường do có lớp sáp ở thành tế bào [7]

1.2.3 Khả năng gây bệnh

Các bệnh lý nhiễm trùng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới Không chỉ có những bệnh nhiễm trùng mới phát sinh mà những bệnh nhiễm trùng cũ gây chết người đã biết từ lâu cũng tái xuất hiện Hơn nữa tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh đề kháng kháng sinh ngày càng tăng cao là nguy cơ lớn cho sức khỏe cộng đồng Những bằng chứng gần đây cho thấy các tác nhân gây bệnh mặc dù rất khác nhau đều sử dụng những phương thức chung để

phát động quá trình nhiễm trùng và gây bệnh Những cơ chế này tạo nên độc lực của vi khuẩn Tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý nghĩa quan trọng trong cuộc chiến chống lại các tác nhân bé nhỏ này [7]

Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến “Cord factor” (trehalose – 6,6’ – dimycolate ) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu , gây nên những u hạt mãn tính Miễn dịch trong bệ nh lao ngày nay được xác định là đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Đáp ứng miễn dịch làm chậm sự nhân lên của vi khuẩn lao , gây hạn chế sự lan tràn của vi khuẩn lao , dẫn tới phá hủy tế bào vi khuẩn Đáp ứng miễn d ịch trong bệnh lao phát sinh một phản ứng quá muộn Một số trường hợp vi khuẩn lao có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt trở lại bạch cầu người và tồn tại dưới dạng ngủ trong các u hạt nên cơ thể không tiêu diệt được Đặc biệt trong các trường hợp lao kháng thuốc cơ thể không tiêu diệt được vi khuẩn và các thuốc cũng không tác động được Đó là một vấn đề nan giả i trong điều trị bệnh lao [8]

Vi khuẩn lao có thể vào cơ thể qua nhiều đường , thường là qua đường hô hấp, bên cạnh đó là các đường tiêu hóa , da, kết mạc mắt Sau khi gây tổn thương tiên phát , vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu tới cơ quan khác gây tổn thương thứ phát

Nhiều cơ quan : phổi, thận, màng não , xương, hạch, da đều có thể bị vi khuẩn lao xâm nhập , nhưng thường bị hơn cả là phổi và vị trí gặp nhiều nhất là đỉnh phổi , nơi có phân áp oxy 120 mmHg [6]

1.2.4 Hệ gen của vi khuẩn lao

Hệ gen của v i khuẩn lao đã được đọc trình tự , có chiều dài 4.411.522 cặp base trong đó có 3.924 trình tự được dự đoán là có mã hóa protein , tỷ lệ G + C chiếm đến 65,6% Genome của vi khuẩn lao có chứa tới 90,8 % trình tự mã hóa protein và chỉ có 6 gen giả [28]

1.3 Gen KatG và tính kháng thuốc isoniazid ở vi khuẩn lao

Gen katG là một đoạn DNA có kích thước 2223 bp, nằm trên nhiễm sắc

thể của vi khuẩn lao và chịu trách nhiệm mã hóa cho enzyme catalase peroxidase Người ta nhận thấy có khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid có đột biến trên gen này [28]

-Gen katG mã hóa cho enzyme catalase-peroxidase Enzyme này hoạt

hóa isoniazid bằng cách kết hợp axyl isonicotinic với NADH để tạo thành phức hệ axyl isonicotinic-NADH Phức hệ này liên kết chặt chẽ với enzyme

ketoenoylreductase (mã hóa bởi gen InhA), theo đó làm ngăn cản cơ chất

enoyl-AcpM Quá trình này làm ức chế sự tổng hợp axit mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao Cơ chế phân tử của tính kháng isoniazid chủ yếu có liên quan tới đột biến thêm đoạn/mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/vô

nghĩa, trong đó chủ yếu diễn ra tại codon 315 và 463 (S315T) của gen katG

mã hóa catalase-peroxidase Nếu có sự biến dạng hay đột biến ở base thứ 2 tại

codon 315 của gen katG (AGC biến thành ACC hay ACA) sẽ dẫn đến làm giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme catalase-peroxidase do đó M

tuberculosis sẽ trở thành kháng thuốc isoniazid [51] Do đó phát hiện sự thay

đổi di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng M tuberculosis kháng

isoniazid

1.4 Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng Isoniazid

Vi khuẩn lao kháng isoniazid được xác định theo phương pháp chẩn đoán kiểu gen Các phương pháp chẩn đoán kiểu gen đều dựa trên cơ sở xác định đột biến ở các gen có liên quan kháng thuốc tương ứng

Để xác định đột biến trên gen katG hiện có nhiều phương pháp , song

giải trình gen vẫn là phương phá p cơ bản, chính xác , rõ ràng nhất Tuy nhiên đây là phương pháp không phải nơi nào cũng làm được vì đòi hỏi máy móc thiết bị đắt tiền và nhân lực có trình độ để vận hành khai thác [28]

Giải trình tự (DNA squencing ) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotide trong phân tử DNA Nguyên lý của phương pháp này là : Tổng hợp các mạch đơn DNA mới có độ dài ngắn hơn mạch khu ôn, nhờ kỹ thuật đánh dấu và ngắt đoạn trong quá trình tổng h ợp mạch DNA , thu được các mạch đơn hơn kém nhau một base từ đó có được sơ đồ trật tự mạch DNA khuôn mẫu So sánh trật tự của mẫu thí nghiệm với trật tự DNA ch uẩn ta biết được vị trí các sai lệch (đột biến) [33]

Ứng dụ ng các kỹ thuật sinh học phân tử đã xác định các chủng vi

khuẩn lao kháng isoniazid là do có đột biến ở gen katG Codon xảy ra đột

biến là codon 315 [34]

Sự đột biến xảy ra là do thay thế nucleotid e ở codon 315 (AGC  ACC hoặc AGC  ACA) [34]

Để giải trình tự gen katG, hiện nay người ta có thể thực hiện trực tiếp

từ sản phẩm PCR Khi sản phẩm PCR là đơn nhất và có độ dài thích hợp cho việc phân tích kết quả thì có thể thực hiện giải trình tự trực tiếp Cũng có thể

giải trình tự thông qua tách dòng , gắn đoạn gen katG cần nghiên cứu vào vector Đoạn gen cùng với vector tái tổ hợp được nhân lên trong tế bào E.coli Khi giải trình tự gen , cả đoạn gen katG và 1 phần vector đều được xác định

trình tự Giải trình tự thông qua tách dòng được ứng dụng khi sản phẩm PCR không được tốt , đặc biệt là trong các trường hợp gây đột biến nhân tạo kiểm chứng kháng thuốc và trong nghiên cứu biểu h iện gen [6]

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn lao M tuberculosis được cung cấp bởi Học viện

Quân y

Bảng 2.1: Đặc điểm kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn lao

2.2 Vật liệu thiết bị và dụng cụ nghiê n cƣ́u

2.2.1 Các sinh phẩm hóa chất chính

Bảng 2.2: Các sinh phẩm hóa chất chính

1 H/c dùng trong PCR

Tris base Lysozyme Proteinase K Agarose

Thang chuẩn DNA EDTA

Taq-DNA-polymerase

2 H/c sinh phẩm dùng trong tách dòng

Pepton

Yeast Extract Nacl

Agar Ampicilin X-gal IPTG

Accuprep plasmid Mini Extraction Kit

EcoRI

pBT

3 H/c phục vụ giải trình tƣ̣ gen e

Big Dye Terminator V3.1 HiDi Formamid

Ethanol tuyệ đối

Applied BioSciences (Mỹ) Fermentas (Mỹ)

Sigma (Mỹ) Sigma (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ)

Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ)

Applied BioSciences (Mỹ) Applied BioSciences (Mỹ) Fermentas (Mỹ)

2.2.2 Các máy và thiết bị chính

Bảng 2.3: Các máy và thiết bị chính

Tủ ấm ổn nhiệt

Máy PCR (GenAmp PCR System 9700) Máy PCR (Thermo cycle)

Máy ly tâm (Biofuge Primo R)

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Máy chụp ảnh Gel-Doc

Tủ lạnh -200

C, -800C Lò vi sóng

Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire Bể ổn nhiệt

Máy lắc Gyromax 737R

Máy quang phổ tử ngoại khả biến Nano Drop Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100-

Avant

Sanyo (Nhật Bản)

Applied BioSciences (Mỹ) Bio-rad (Pháp)

Heraeus (Mỹ)

Thommas Scientific (Mỹ) Dolphin (Mỹ)

Nuaire (Mỹ) Sanyo (Nhật Bản) Nuaire (Mỹ) Memmert (Đức)

Amerex Instrument (Đức) Analitika (Đức)

Applied BioSciences (Mỹ)

2.2.3 Các mồi dùng trong nghiên cứu

Các mồi đặc hiệu cho phát hiện trực khuẩn lao và lao kháng thuốc được sử dụng cho phản ứng PCR n hân các đoạn gen đích có trình tự tương ứng là :

- Cặp mồi dùng cho nhân trình tự gen katG:

KatG F: 5'-GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG-3' KatG R: 5'-ACA AGC TGA TCC ACC GAG AC-3'

- Cặp mồi dùng cho giải trình tự gen katG:

M13 F: 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' M13 R: 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'

Các trình tự này được gửi tổng hợp ở công ty Invitrogen , Hồng Kông

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Tiến hành nghiên cứu theo phương pháp :

- Dịch tễ học mô tả, điều tra cắt ngang, có đối chứng - Thực nghiệm labo có đối chứng

Sơ đồ nghiên cứu DNA (Tách từ vi khuẩn

lao đã được xác định tính kháng thuốc)

Nhân bản đoạn gen katG sử dụng mồi đặc hiệu

Sản phẩm gen KatG

Tách dòng gen KatG

Sản phẩm vector có đoạn gen KatG

Giải trình tự gen KatG

Xác định đột biến liên quan đến tính kháng INH

2.3.2 Các kỹ thuật cụ thể

2.3.2.1 Kỹ thuật nhân bản đoạn gen katG sử dụng mồi đặc hiệu

Sơ đồ qui trình nhân bản đoạn gen KatG

Cụ thể:

1 Sau khi đo nồng độ DNA khuô n, tính và tạo các nồng độ DNA của các mẫu như nha u để khi đưa vào hỗn hợp sản phẩm cùng một thể tích DNA khuôn, và đạt khoảng 100 ng/thể tích 25µl phản ứng

2 Tính các giá trị của các thành phần khác

Đo nồng độ DNA của mẫu nghiên cứu

Tính toán giá trị các thành phần phản ứng PCR

Tạo hỗn hợp phản ứng

Nhân gen theo chu trình nhiệt đã được tối ưu hóa

Điện di kiểm tra vạch đặc hiệu

Sử dụng sản phẩm PCR làm DNA chèn vào plasmid

Bảng 2.4: Tính toán các thành phần cho phản ứng PCR

Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl) Nồng độ

3 Chu trình nhiệt như sau :

4 Điện di sản phẩm PCR trên a garose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide và đọc kết quả trên máy Gel - Doc

950C 5 phút

950C 1 phút

560C 45 giây

720C 1 phút

720C 4 phút

40C 60 phút 35 chu kỳ

2.3.2.2 Kỹ thuật tách dòng (cloning), tạo sản phẩm phục vụ giải trình tự gen katG

Sơ đồ qui trình tách dòng

Sau khi nhân bản thành công đoạn gen katG, chúng tôi tiến hành làm

sạch (thôi gel) bằng bộ kit QIAquick Gel Extraction Trong quá trình thao tác trên đèn tím rất có thể bị đứt gẫy các nucleotide sẽ gây ảnh hưởng k hông tốt tới sản phẩm kết nối , vì vậy trước k hi thực hiện phản ứng kết nối chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng nối đầu A Thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.5

Tinh sạch và gắn đoạn gen vào vector tách dòng pBT tạo vector tái tổ hợp

Đƣa vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến

Nuôi cấy tế bào có vector

Lƣ̣a chọn tế bào mang vector tái tổ hợp theo nguyên tắc chọn lọc khuẩn lạc xanh trắng

Kiểm tra và tách plasmid

Thu plasmid, kiểm tra đoạn gen

Bảng 2.5: Tính toán các thành phần cho phản ứng nối đầu A

Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl) Nồng độ

- Hút hết sản phẩm trên sang các Eppendorf có bổ sung cột lọc

- Ly tâm 13000 vòng/phút/40C Đổ dịch lỏng, thu cặn bám trên cột lọc - Thêm 500 µl Washing buffer vào Eppendorf Ly tâm 13000 vòng/phút/40

C Đổ dịch, thu cặn bám trên cột lọc - Lặp lại bước trên

- Làm khô bằng cách ly tâm thêm 1 lần nữa

- Thêm 15 µl nước deion vào Đợi trong vòng 1 phút - Thu dịch, loại bỏ cột lọc

Sau đó thực hiện các bước sau: 1 Tạo sản phẩm kết nối

Kết nối đoạn gen katG cần nghiên cứ u với vector pBT theo qui trình

của nhà sản xuất

Qui trình:

- 2X Papid Ligation Buffer 1 µl - T4 DNA Ligase 1 µl

- pBT Vector 1 - PCR product 5 µl

- Nước cất khử ion vừa đủ 10 µl

Sau đó sản phẩm được tiến hành trên máy PCR ở 220C trong vòng 60 phút 2 Biến nạp và nuôi cấy tế bào có vector tái tổ hợp

Biến nạp sản phẩm kết nối trên vào tế bào khả biến E.coli DH5α theo

phương pháp sốc nhiệt [15] Nuôi cấy tế bào và kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp trong tế bào theo qui trình sau :

- Lấy tế bào khả biến ra khỏi tủ âm , để trong nước đá (40C) trong vòng 10-15 phút

- Hút 5 µl sản phẩm kết nối cho vào các ống tế bào khả biến (có đảo nhẹ) - Để ống tế bào khả biến trong nước đá (40C) 30 phút, sốc nhiệt ở 420C trong vòng 90 giây

- Tiếp tục giữ ở 40C trong vòng 1-2 phút

- Thêm 100 µl LB lỏng vào các ống tế bào khả biến trên (có đảo nhẹ ), cho ngay các ống tế bào khả b iến này vào tủ nuôi cấy lắc , để ở 370C và 220 vòng/phút trong 1 giờ

- Hút 150 µl dịch khuẩn đã nuôi lắc cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có carbenicillin, X-gal, IPTG

- Giữ sản phẩm ở tủ ổn nhiệt 370C qua đêm (18-24 giờ)

- Khi trên bề mặt đĩa thạch xuất hiện các tế bào xanh trắng , lựa chọn các khuẩn lạc trắng chấm vào 3 ml LB lỏng có kháng sinh carbenicillin với nồng độ 100 µg/ml

- Lấy 1 µl dịch khuẩn làm phản ứng PCR k iểm tra đoạn gen vớ i 2 mồi

KatG F và KatG R (chu trình nhiệt như với PCR nhân đoạn gen katG)

- Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm PCR , nếu mẫu nào có vạch

tương ứng với đoạn gen KatG thì sử dụng mẫu đó để tách plasmid

3 Tách chiết plasmid (Sử dụng các hóa chất có tại phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện CNSH)

Sử dụng kit QIAprep spin Miniprep (của hãng QIAGEN ) và quy trình của nhà sản xuất để tách chiết plasmid Đây là phương pháp tách chiết

plasmid lượng nhỏ từ 1-1,5 ml khuẩn lạc E coli

- Hút 2 ml dịch khuẩn cho vào Eppendorf 2 ml - Ly tâm 8000 vòng/2 phút ở 40C thu khuẩn - Thêm 100 µl sol I, vortex nhẹ cho tan cặn - Thêm 200 µl sol II, đảo nhẹ Eppendorf

- Thêm 150 µl sol III, đảo nhẹ Eppendorf cho dịch chuyển sang màu trắng (Đảo ngay khi thêm hóa chất vào Eppendorf, tránh kết tủa cục bộ)

- Ly tâm 13000 vòng/10 phút/40C Hút 300 µl dịch, bỏ cặn

- Thêm 1 lượng tương đương P CI 24:1 (24 phenolchloroform isoamylalchohol) Lắc mạnh, ly tâm 13000 vòng/10 phút/40C Thu pha trên

Thêm 1 lượng tương tương isopropanol Lắc đều - Ly tâm 13000 vòng/10 phút/40C Thu cặn

- Rửa cồn Ly tâm 13000 vòng/5 phút/40C - Đợi khô

- Thêm 50 µl nước deion

4 Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chèn vào plasmid

Sử dụng enzym cắt giới hạn BamHI để cắt plasmid Theo như sơ đồ

vector pBT thì chỉ cần một enzym này là có thể cắt ở cả hai đầu phía trước vị trí của đoạn gen chè n vào Kết quả sau khi thực hiện phản ứng cắt sẽ thu được

hai phần: tạo một vạch trên hình ảnh điện di có kích thước khoảng 684 bp và một vạch là phần còn lại của plasmid khoảng 2705 bp

Qui trình dùng BamHI:

- Nước deion vừa đủ 20µl

Sản phẩm được tiến hành ở bể ổn nhiệt 370C trong vòng 90 phút Sau đó điện di trong agarose 1% kiểm tra vạch đặc hiệu Những mẫu nào có vạch tương ứng với vị trí 684 bp thì có thể sử dụng để đọc trình tự

Sau khi xác định được mẫu plasmid đi đọc trình tự , pha loãng plasmid 50 lần rồi hút 10µl mẫu đó cho vào Eppendorf, bổ xung thêm 5µl RNAase Sản phẩm được tiến hành ở bể ổn nhiệt 370

C trong vòng 90 phút để khử RNA

2.3.2.3 Phương pháp đọc trình tự DNA theo Sanger trên máy đọc trình tự tự động phân tích kết quả bằng các phần mềm chuyên dụng

Plasmid được gửi đọc trình tự tại phòng Công nghệ gen t rọng điểm - Viện Công nghệ Sinh học

* Phân tích kết quả :

- Kiểm tra kết quả thu được bằng phần mềm máy tính ABI 3130

- Khai thác dữ liệu từ ngân hàng gen , thiết lập chủn g chuẩn wild type để so sánh

- Xử lý, phân tích các trình tự đoạn gen katG có kích thước khoảng 684

bp của các chủng vi khuẩn lao bằng chương trình phân tích chuỗi BioEdit So sánh đối chiếu với các dữ liệu ở ngân hàng gen để có kết quả các vị trí đột biến của từng chủng nghiên cứu

Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê , sử dụng chương trình phân tích sinh học Star View v5.0 để xác định các mối liên quan kháng thuốc

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả nhân bản gen katG các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu

Sử dụng cặp mồi katG F và katG R nhân bản đoạn gen katG bằng kỹ

thuật PCR Sau khi có được sản phẩm PCR , chúng tôi tiến hành kiểm tra đoạn gen được nhân lên bằng phương pháp điện di trên agarose 1% Kết quả được thể hiện như trong ảnh 3.1 và 3.2

Kết quả điện di kiểm tra sau khi PCR nhân gen katG cho thấy cả 14

chủng vi khuẩn lao đều có kết quả dương tính với đoạn gen katG có chiều dài

684bp Các vạch DNA đặc hiệ u rõ ràng, không có vạch phụ kèm theo Chứng

tỏ đoạn gen katG đã được nhân lên đặc hiệu

Zenteno-cuevas và cộng sự (2009), từ 80 mẫu bệnh phẩm lâm sàng có kết quả PCR chẩn đoán dương tín h với vi khuẩn lao thì có hơn 95% số chủng

có đoạn gen katG

Nhiều tá c giả khác khi nhân đoạn gen katG để giải trình tự , thường có kết quả tỷ lệ dương tính với gen katG là 100% Như vậy kết quả của chúng tôi

thống nhất với các công bố khác trong và ngoài nước

Theo nhiều tác giả trên thế giới , cần thiết phải tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tạo sản phẩm kết nối Chúng tôi tiến hành tinh sạch theo phương pháp thôi gel bằng kit của hãng QIAGEN , song song với các mẫu đó chúng tôi tiến hành các mẫu không tinh sạch Kết quả qua lựa chọn các dòng tế bào

dương tính có chứa đoạn gen katG của 2 nhóm này thấy rằng , chọn 10 dòng

thì ở nhóm tinh sạ ch có tới 9 dòng dương tính , còn ở nhóm không tinh sạch đạt từ 6-7 dòng dương tính Hơn nữa ở nhóm có tinh sạch khi điện di kiểm tra trên agarose 0,8% cho các vạch rõ ràng , sắc nét Vì vậy các mẫu sau này chúng tôi đều tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tạo sản phẩm kết nối Kết quả này cũng chứng tỏ sản phẩm PCR đoạn gen katG có chiều dài

684 bp đã tách dòng được

3.2 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α

Bước đầu tiên của quá trình tách dòng là thực hiện ph ản ứng gh ép nối

gen katG và vector tách dòng pBT , đây là vector có nhiều ưu điểm như : kích

thước nhỏ , có nhiều điểm cắt giới hạn của các enzym hạn chế Đồng t hời, vector này còn chứa hai gen kháng kháng sinh ampicillin và ca rbenicillin giúp cho quá trình chọn lọc đơn giản hơn Đặc biệt vector này rất thuận lợi cho

thao tác ghép nối các đoạn DNA ngoại lai do chúng được thiết kế dưới dạng mở vòng mạch thẳng với hai đầu 3' của mỗi sợi gắn thê m nucleotide T

Ảnh 3.3: Sơ đồ vector pBT

Đầu 5' của đoạn gen katG có mang nucleotid e loại A Vì vậy khi thực hiện phản ứng kết nối , gen katG sẽ dễ dàng được gắn vào vector theo nguyên

tắc bổ sung Phản ứng nối được xú c tác bởi T 4 DNA ligase Bước tiếp theo

chúng tôi tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn khả biến E

coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt Sau đó, sản phẩm biến nạp được cấy

trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicillin , gal và IPTG Sự có mặt của X -gal sẽ giúp cho việc chọn lọc các dòng tế bào

X-E coli mang vector tái tổ hợp dễ dàng Kết quả được trình bày ở hình 3.2

Ảnh 3.4: Chọn dòng khuẩn mang plasmid tái tổ hợp trên môi trường LB có bổ sung carbenicillin, X-gal và IPTG

Trên môi trường có chứa kháng sinh carbenicillin, X-gal và IPTG , phát triển hai loại khuẩn lạc : khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đã đượ c biến nạp plasmid chứa gen kháng kháng sinh carbenicillin, nhưng chỉ có khuẩn lạc màu trắng mới mang

plasmid tái tổ hợp Vì những vi khuẩn E coli chứa plasmid pBT nguyên vẹn sẽ có gen lacZ hoàn chỉnh sản xuất ra β-galactosidase Enzym này phân hủy

cơ chất X-gal có trong môi trường tạo nên dẫn xuất indol , dẫn xuất này ngoài môi trường sẽ bị oxy hóa tạo thành màu xanh Nếu đoạn DN A ngoại lai xen

vào giữ a gen lacZ thì gen này sẽ bị phá hỏng , enzym β-galactosidase không

được tạo ra , vì thế mặc dù có X -gal trong môi trường nhưng cơ chất này không bị thủy phân , không tạo nên dẫn xuất indol và khuẩn lạc có màu trắng

3.3 Kết quả tách dòng gen katG

Để kiểm tra chính xác các khuẩn lạc mang plasmi d tái tổ hợp chứa

đoạn gen katG quan tâm, chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng kỹ thuật c

olony-PCR Vì số lượng khuẩn lạc sau khi biến nạp là rất nhiều nên chúng tôi chọn ngẫu nhiên 28 khuẩn lạc trắng để thực hiện phả n ứng colony -PCR sử dụng

cặp mồi katG F và katG R Sản phẩm colony -PCR được kiểm tra bằng

phương pháp điện di trên gel agarose 1% Nếu khuẩn có plasmid mang gen

katG thì sản phẩm PCR sẽ xuất h iện một băng có kích thước mong muốn khoảng 684 bp Đồng thời nuôi những khuẩn lạc này vào 3 ml LB lỏng có bổ sung carbenicillin, để tách plasmid phục vụ cho việc xác định trình tự

Sau khi nuôi khuẩn lạ c trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh carbenicillin, chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid theo quy trình của nhà sản xuất Để khẳng định chắc chắn rằng plasmid mới tách chiết có mang

đoạn gen katG quan tâm, chúng tôi tiến hành phản ứng cắt plasmid Sản phẩm

cắt plasmid được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% Kết quả được thể hiện qua ảnh 3.5, 3.6, 3.7 và 3.8