Nghiên cứu cố định đầu dò dna lên bề mặt sợi vàng làm cảm biến phát hiện m rna il 8

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN CÔNG NGHỆ NANO CAO HỮU TIẾN NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ĐẦU DÒ DNA LÊN BỀ MẶT SỢI VÀNG LÀM CẢM BIẾN PHÁT HIỆN m-RNA IL-8 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU TP Hồ Chí Minh –2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN CÔNG NGHỆ NANO CAO HỮU TIẾN NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ĐẦU DÒ DNA LÊN BỀ MẶT SỢI VÀNG LÀM CẢM BIẾN PHÁT HIỆN m-RNA IL-8 Chuyên ngành: Khoa học Vật liệu Mã số chuyên ngành: 62 44 01 22 Phản biện 1: TS Nguyễn Phạm Thanh Nhân Phản biện 2: PGS.TS Lâm Quang Vinh Phản biện 3: TS Nguyễn Hoàng Chương Phản biện độc lập 1: TS Nghiêm Thị Hà Liên Phản biện độc lập 2: TS Nguyễn Hoàng Chương NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS LÊ VĂN HIẾU TS TRẦN VĂN MẪN TP Hồ Chí Minh –2017 Cao Hữu Tiến LỜI CẢM ƠN Xin gởi đến Thầy PGS.TS Lê Văn Hiếu kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, Thầy tận tình hướng dẫn cho em hồn thành luận án tiến sĩ Xin chân thành cảm ơn TS.Trần Văn Mẫn hỗ trợ nhiều để luận án hoàn thành Chân thành cảm ơn bạn nhóm nghiên cứu từ Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Viện Công nghệ Nano giúp đỡ thực nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô hội đồng chấm luận án phản biện dành thời gian đọc góp ý nhận xét luận án hồn chỉnh Kính dâng Ba Má lịng thành kính biết ơn hết lịng thương u lo lắng cho Gia đình thân yêu điểm tựa, nguồn động viên để làm việc học tập với tất lòng yêu thương i Cao Hữu Tiến LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình mà tơi khơng tham gia Tác giả ii Cao Hữu Tiến MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN……………………………………………………………………… i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii MỞ ĐẦU .1 A TỔNG QUAN .4 Chương CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA .4 1.1 Cấu tạo chung nguyên lý phát .4 1.2 Cảm biến sinh học điện hóa DNA 1.2.1 Đặc tính điện hóa DNA 1.2.2 Cảm biến lai DNA điện hóa 10 1.2.3 Cấu tạo cảm biến E-DNA .11 1.2.4 Nguyên lý hoạt động E-DNA 11 1.2.5 Phương pháp điện hóa .11 1.2.5.1 Hệ đo điện hóa ba điện cực 12 1.2.5.2 Phương pháp quét vịng tuần hồn (CV) 14 1.2.5.3 Phương pháp qt sóng vng (SWV) 16 1.2.5.4 Phương pháp đo tổng trở (EIS) 18 1.2.5.5 Các trình diễn bình đo điện hóa 19 1.2.5.6 Các hoạt động oxy hóa khử MB Fe(CN)64-/ Fe(CN)63- bình đo điện hóa 20 1.2.6 Ưu điểm cảm biến E-DNA so với cảm biến sinh học khác .22 1.3 Đầu dị cảm biến sinh học điện hóa DNA 24 1.3.1 Phân loại đầu dò theo cấu trúc 25 1.3.1.1 Cấu trúc 1D 25 1.3.1.2 Cấu trúc 2D 26 iii Cao Hữu Tiến 1.3.1.3 Cấu trúc 3D 28 1.3.2 Phân loại đầu dị theo chế tín hiệu thay đổi .29 1.3.2.1 Signal-off 30 1.3.2.2 Signal-on 32 1.4 Điện cực vàng sử dụng cảm biến sinh học điện hóa 36 Chương CHỈ TỐ SINH HỌC UNG THƯ HỐC MIỆNG CÓ TRONG NƯỚC BỌT 38 2.1 Chỉ tố sinh học nước bọt liên quan đến ung thư 38 2.1.1 Định nghĩa .38 2.1.2 Các tố sinh học nước bọt 39 2.2 Ung thư hốc miệng 39 2.2.1 Đại cương ung thư hốc miệng 39 2.2.2 Các tố sinh học nước bọt ung thư hốc miệng .40 2.2.3 Các nỗ lực nhằm phát sớm ung thư hốc miệng .43 2.2.4 Sản phẩm phiên mã nước bọt chẩn đoán ung thư hốc miệng 48 2.2.5 Interleukin-8 ung thư hốc miệng 51 2.2.5.1 Interleukin-8 (IL-8) 51 2.2.5.2 Con đường tín hiệu đáp ứng tế bào IL-8 52 2.2.5.3 Vai trò IL-8 ung thư hốc miệng .53 B THỰC NGHIỆM .55 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 55 3.1 Đối tượng phân tích cần phát 55 3.2 Điện cực sử dụng làm cảm biến .55 3.3 Hóa chất sử dụng 57 3.4 Đầu dò DNA sử dụng nghiên cứu 60 3.4.1 Đầu dị có cấu trúc stem-loop 60 3.4.2 Đầu dị có cấu trúc hairpin 62 Chương TỐI ƯU QUY TRÌNH CỐ ĐỊNH ĐẦU DÒ VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐẠC 66 iv Cao Hữu Tiến 4.1 Chuẩn bị cảm biến 67 4.2 Chuẩn bị đối tượng phân tích lai ghép 70 4.3 Đo điện hóa 71 4.4 Tối ưu hóa điều kiện gắn đầu dị 73 4.4.1 Nồng độ đầu dò .73 4.4.2 Tác nhân cố định MCH 81 Chương ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỐ ĐỊNH ĐẦU DÒ .86 5.1 Làm chip 86 5.2 Hiệu gắn đầu dò lên bề mặt điện cực 88 5.3 Hiệu cố định đầu dò MCH 90 5.4 Sự thay đổi tín hiệu điện hóa hai chế tín hiệu thay đổi 93 5.4.1 Signal-off .93 5.4.2 Signal-on 95 Chương GIỚI HẠN PHÁT HIỆN VÀ TÁI SỬ DỤNG CHIP .97 6.1 Khảo sát giới hạn phát (LOD) hai loại đầu dò 97 6.2 Giới hạn phát cảm biến signal-off 97 6.3 Giới hạn phát cảm biến signal-on 100 6.4 Tái sử dụng chip 104 6.4.1 Loại bỏ đơn lớp SAM 104 6.4.2 Khảo sát hiệu loại bỏ đơn lớp SAM .107 C KẾT LUẬN .110 HƯỚNG PHÁT TRIỂN CỦA ĐỀ TÀI 112 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ .113 TÀI LIỆU THAM KHẢO .115 PHỤ LỤC 131 v Cao Hữu Tiến DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt BLAST/NCBI Basic Local Alignment Search Công cụ BLAST/ Trung tâm Tool/ National Center for Quốc gia Thông tin Công Biotechnology Information nghệ sinh học CV Cyclic Voltammetry Đo vịng tuần hồn ds-DNA Double-stranded Deoxyribonucleic Acid DNA chuỗi đôi IL-8 Interleukin-8 Interleukin-8 E-DNA Electrochemical Deoxyribonucleic Acid DNA điện hóa EIS Electrochemical impedance spectroscopic Đo tổng trở điện hóa Fc Ferrocene Ferrocene LMB Leuno Methylene Blue Xanh methylene leuno LOD Limit of Detection Giới hạn phát MB Methylene Blue Xanh methylene MCH 6-Mecaptohexanol 6-Mecaptohexanol RT-PCR Reverse transcriptionPolymerase Chain Reaction PCR phiên mã ngược OSCC Oral squamous cell carcinoma Ung thư tế bào vảy miệng PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch đệm phosphate POC Point-of-Care Chăm sóc chỗ SAM Self-Assembled Monolayers Lớp đơn tự tập hợp ssDNA Single-stranded Deoxyribo Nucleic Acid DNA chuỗi đơn SWV Square-Wave Voltammetry Đo sóng vng TCEP Tris-(2-Carboxyethyl) Phosphine Hydrochloride Tris-(2-Carboxyethyl) Phosphine Hydrochloride vi Cao Hữu Tiến DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Các tố sinh học nước bọt ung thư hốc miệng .41 Bảng 2.2: Các kỹ thuật hỗ trợ phát chẩn đoán tiền ung thư hốc miệng carcinoma sớm 43 Bảng 2.3: Các nghiên cứu đề xuất việc dùng mức cytokine nước bọt để chẩn đoán OSCC 47 Bảng 2.4: Sự thay đổi tố sinh học mRNA bệnh nhân ung thư hốc miệng 49 Bảng 2.5: Các mRNA nước bọt điều hòa tăng (> lần, P < 0,01) bệnh nhân ung thư hốc miệng nhận biết kỹ thuật microarray 50 Bảng 3.1: Danh mục dụng cụ, hóa chất tác dụng dùng thí nghiệm 58 Bảng 3.2: Qui trình pha hóa chất ………………………………………………….59 Bảng 4.1: Qui trình xử lý làm chip ……………………………………….68 Bảng 4.2: Qui trình chuẩn bị cố định đầu dò lên chip …………………………69 Bảng 4.3: Qui trình lai đầu dị với đối tượng phân tích ………………………… 70 Bảng 6.1: Cường độ dòng anod peak oxy hóa thu từ q trình lai 99 Bảng 6.2: Cường độ dịng anod peak oxy hóa thu từ trình lai 102 vii Cao Hữu Tiến DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Các thành phần cảm biến sinh học nguyên lý hoạt động Hình 1.2: Phân loại cảm biến theo loại đầu dị sinh học .6 Hình 1.3: Sơ đồ lai DNA ………………………………………………………… 10 Hình 1.4: Cấu tạo nguyên lý phát cảm biến E-DNA ……………… 11 Hình 1.5: Hệ đo điện hóa ba điện cực …………………………………………… 13 Hình 1.6: Biểu đồ quét CV…………………………………………………………14 Hình 1.7: Đồ thị đặc trưng sóng vng q trình thuận nghịch ………17 Hình 1.8: Mạch điện tương đương bình điện phân ……………………………19 Hình 1.9: Phản ứng oxy hóa khử MB pH lớn ………………………20 Hình 1.10: Các q trình điện hóa diễn hệ đo điện hóa ………………… 21 Hình 1.11: Sự phát triển cấu trúc đầu dò từ cấu trúc 1D-2D-3D .25 Hình 1.12: Một vài đầu dị có cấu trúc 1D điển hình 26 Hình 1.13: Một vài đầu dị có cấu trúc 2D điển hình 27 Hình 1.14: Cấu tạo đầu dị có cấu trúc 3D 28 Hình 1.15: Một vài ví dụ điển hình cho đầu dị có cấu trúc dạng 3D .29 Hình 1.16: Hai chế tín hiệu thay đổi cảm biến E-DNA .30 Hình 1.17: Đầu dị stem-loop báo cáo 31 Hình 1.18: Đầu dị stem-loop Immoos .31 Hình 1.19: Cấu trúc đầu dò linear báo cáo 32 Hình 1.20: Đầu dị signal-on Immoos thiết kế (2004) 33 Hình 1.21: Đầu dị signal-on Xiao thiết kế (2006) .33 Hình 1.22: Đầu dò Lubin thiết kế (2007) .34 Hình 1.23: Cấu trúc đầu dò Xiao thiết kế (2009) 34 Hình 1.24: Đầu dị signal-on Yu thiết kế (2012) 35 Hình 1.25: Đầu dị cấu trúc hairpin Rowe thiết kế (2012) 35 viii ... loại c? ?m biến enzyme, c? ?m biến kháng thể, c? ?m biến protein, c? ?m biến DNA/ RNA, c? ?m biến kết hợp (Hình 1.2) - C? ?m biến enzyme: Có đầu dị sinh học enzyme, dạng đầu dị phổ biến Các enzyme enzyme urease,... TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN CÔNG NGHỆ NANO CAO HỮU TIẾN NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ĐẦU DÒ DNA LÊN BỀ M? ??T SỢI VÀNG L? ?M C? ?M BIẾN PHÁT HIỆN m- RNA IL- 8 Chuyên ngành: Khoa học Vật liệu M? ? số... signal-on cố định lên bề m? ??t điện cực sợi vàng nh? ?m phát tồn tố sinh học interleukin -8 mRNA dung dịch Khảo sát điều kiện tối ưu cho việc cố định đầu dò lên bề m? ??t điện cực sợi vàng đánh giá hiệu cố định