Nghiên cứu phương pháp biến đổi bề mặt thanh dao động hướng đến ứng dụng làm cảm biến phát hiện chỉ thị ung thư gan AFP và DKK1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH PTN CÔNG NGHỆ NANO NGUYỄN TRUNG THÀNH NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP BIẾN ĐỔI BỀ MẶT THANH DAO ĐỘNG HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM CẢM BIẾN PHÁT HIỆN CHỈ THỊ UNG THƯ GAN AFP VÀ DKK1 LUẬN VĂN THẠC SĨ Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH PTN CƠNG NGHỆ NANO NGUYỄN TRUNG THÀNH NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP BIẾN ĐỔI BỀ MẶT THANH DAO ĐỘNG HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM CẢM BIẾN PHÁT HIỆN CHỈ THỊ UNG THƯ GAN AFP VÀ DKK1 Chuyên ngành: Vật liệu Linh kiện Nanơ (Chun ngành đào tạo thí điểm) LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 i Lời cảm ơn Công sinh thành, dưỡng dục, trao trọn yêu thương không bờ bến, đời cha mẹ để có ngày hơm nay, xin tạc Cảm ơn người! Ơn dạy dỗ tận tâm thầy cô đền đáp, em xin ghi lòng Em xin cảm ơn! Xin gửi tới thầy giáo, cán hướng dẫn em đề tài luận văn này, PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng lời cảm ơn chân thành Thầy tận tâm hướng dẫn, dành thời gian quý giá để đọc sửa nội dung khoa học luận Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Đặng Mậu Chiến Một người thầy, người quản lý tận tâm phát triển nghiệp khoa học nước nhà Xin gửi tới Thạc Sỹ Phan Nhật Thanh Khoa lời cảm ơn chân thành sâu sắc Anh người thầy, người anh chưa thiếu nhiệt tình tâm huyết giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Cảm ơn Thạc sỹ Phạm Văn Bình, anh giúp hiểu sâu số vấn đề liên quan đến y sinh đề tài Cảm ơn em Phạm Văn Thọ, nghiên cứu viên, nhân viên Phịng thí Nghiệm Cơng nghệ Nano có giúp đỡ tơi q trình thực đề tài LNT Chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Hội đồng bảo vệ luận văn đọc, phản biện giúp em hiểu rõ vấn đề chưa rõ Tôi chân thành cảm ơn đề tài C2014-32-01 thực PTN Công nghệ Nano, Đai học Quốc gia Tp HCM cho hội tham gia thực nghiên cứu Xin gửi lời chúc sức khoẻ, hạnh phúc tới quý thầy cô, anh chị bạn! Tp.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2014 Học viên cao học Nguyễn Trung Thành Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Học viên thực Luận văn Nguyễn Trung Thành Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành iii MỤC LỤC Trang phụ bìa Trang Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vii Danh muc bảng viii Danh mục hình ảnh ix Mở đầu 01 Giới thiệu 01 Mục tiêu ý nghĩa đề tài 02 2.1 Mục tiêu 02 2.2 Ý nghĩa đề tài 02 Tóm tắt nội dung đề tài 03 CHƢƠNG 04 TỔNG QUAN 1.1 Cảm biến sinh học sở dao động 04 1.1.1 Cảm biến sinh học 04 1.1.1.1 Lịch sử phát triển công nghệ cảm biến sinh học 04 1.1.1.2 Cấu tạo nguyên tắc hoạt động cảm biến sinh học 05 1.1.1.3 Phân loại 06 1.1.2 Cảm biến sinh học sở dao động 08 1.1.2.1 Cấu tạo nguyên lý hoạt động cảm biến sinh học dựa nguyên lý dao động 08 1.1.2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu cảm biến sinh học sở dao động 10 1.2 Ung thƣ gan 11 1.2.1 Thực trạng bệnh nhân ung thư gan giới 14 1.2.2 Phịng tránh, chẩn đốn điều trị bệnh ung thư gan 16 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành iv 1.2.2.1 Phòng tránh bệnh ung thư gan 16 1.2.2.2 Các phương pháp chẩn đoán bệnh ung thư gan 17 1.2.2.3 Một số phương pháp điều trị bệnh ung thư gan 18 1.2.3 Hệ kháng thể-kháng nguyên 20 1.2.4 Chất thị ung thư gan 22 1.2.4.1 Chất thị AFP 22 1.2.4.2 Chất thị DKK1 23 1.3 Các phƣơng pháp biến đổi bề mặt để ứng dụng cảm biến dao động việc phát ung thƣ gan 24 1.3.1 Biến đổi xuất phát từ bề mặt Au 24 1.3.2 Biến đổi xuất phát từ bề mặt SiNx 25 1.3.2.1 Phương pháp biến đổi vấn đề SiNx 25 1.3.2.2 Vai trò xử lý bề mặt SiNx plasma O2 26 1.3.2.2.1 Giới thiệu plasma O2 26 1.3.2.2.2 Một số kỹ thuật tạo plasma 26 1.3.2.2.3 Vai trò plasma bề mặt SiNx 29 1.4 Các phƣơng pháp đánh giá hiệu cảm biến sinh học dựa sở dao động 29 1.4.1 Đánh giá bước biến đổi bề mặt 29 1.4.1.1 Phương pháp chụp ảnh huỳnh quang 29 1.4.1.2 Phương pháp đo góc tiếp xúc 30 1.4.1.3 Phương pháp phản ứng đổi màu nhờ enzyme HRP 33 1.4.2 Phương pháp đo độ lệch dao động để phát chất đánh dấu sinh học 33 CHƢƠNG 36 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Quy trình biến đổi bề mặt dao động 36 2.1.1 Quy trình xuất phát từ Au 36 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành v 2.1.1.1 Khảo sát wafer 36 2.1.1.2 Thử nghiệm chíp dao động để dị tìm AFP 37 2.1.2 Qui trình xuất phát từ bề mặt SiNx/SiO2 39 2.1.2.1 Khảo sát silane hóa bề mặt SiNx SiO2 vấn đề SiNx 39 2.1.2.2 Xử lý bề mặt SiNx plasma O2 43 2.1.2.3 Tối ưu hóa quy trình xử lý plasma oxy 44 2.1.2.4 Áp dụng quy trình tối ưu hóa để biến đổi bề mặt SiNx với GOPTS 44 2.1.2.5 Áp dụng quy trình tối ưu hóa để biến đổi bề mặt SiNx với APTES +GAD 44 2.1.2.6 Ứng dụng dao động động để dị tìm DKK1 45 2.2 Các phƣơng pháp, thiết bị khảo sát hoá chất sử dụng đề tài 47 2.2.1 F-LCA kính hiển vi huỳnh quang 47 2.2.2 Máy đo góc tiếp xúc 48 2.2.3 Khảo sát enzim HRP 48 2.2.4 Đo độ lệch 49 2.2.5 Các hoá chất sử dụng đề tài 49 CHƢƠNG 51 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát qui trình biến đổi xuất phát từ bề mặt Au 51 3.1.1 Khảo sát thời gian ngâm GAD 51 3.1.2 Khảo sát nồng độ GAD 54 3.1.3 Đánh giá hiệu quy trình tối ưu thơng qua góc tiếp xúc 55 3.1.4 Kết thử nghiệm dao động để phát AFP 56 3.2 Qui trình xuất phát từ bề mặt SiN/SiO2 57 3.2.1 Kết biến đổi bề mặt SiNx chưa qua xử lý plasma O2 bề mặt SiO2 57 3.2.2 Cải tiến quy trình xuất phát từ bề mặt SiNx phương pháp xử lý plasma oxy 58 3.2.3 Tối ưu hóa quy trình xử lý plasma oxy 59 3.2.3.1 Thời gian xử lý plasma 59 3.2.3.2 Ảnh hưởng lưu lượng khí oxy 61 3.2.3.3 Ảnh hưởng công suất plasma 64 3.2.3.4 Các thông số xử lý plasma tối ưu 65 3.2.4 Áp dụng quy trình xử lý plasma vào quy trình APTES +GAD tối ưu 66 3.2.5 Áp dụng quy trình xử lý plasma oxy +APTES+GAD tối ưu để biến đổi bề mặt SiNx dao động để dị tìm DKK1 68 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành vi CHƢƠNG 70 KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG PHÁT TRIỂN ĐỀ TÀI 4.1 Kết luận 70 4.2 Hướng phát triển đề tài 70 Tài liệu tham khảo 71 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Stt 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Chữ viết tắt AFP Anti-AFP Anti-DKK1 APTES BSA CAT CCP CT DKK1 DNA ELISA FITC F-LCA GAD GOPTS GP73 HCC HCV HRP ICP IgA IgD IgE IgG IgM LCA LNT MRI PBS RNA SPR UV-Vis Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Diễn giải Alpha-fetoprotein Anti-Alpha-fetoprotein Anti-Dickkopf-1 3-Aminopropyl triethoxysilane Bovine serum albumin Computerized Axial Tomography Capacitively coupled plasma Computerized Tomography Dickkopf-1 Deoxyribonucleic acid Enzyme-linked immunosorbent assay Fluorescein isothiocyanate Fluorescein isothiocyanate-Lens culinaris agglutinin Glutaraldehyde 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Golgi Protein 73 Hepatocellular carcinoma Hepatitis C Horseradish peroxidase Inductively Coupled Plasma Immunoglobulin A Immunoglobulin D Immunoglobulin E Immunoglobulin G Immunoglobulin M Lens culinaris agglutinin Laboratory for Nanotechnology Magnetic Resonance Imaging Phosphate buffered saline Ribonucleic acid Surface plasmon reconance Ultraviolet–visible spectroscopy Nguyễn Trung Thành viii DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1.1: Các thành phần cảm biến sinh học Bảng 2.2.1 Danh mục hóa chất 49 Bảng 3.1.1: Khảo sát thời gian ngâm GAD 51 Bảng 3.1.2: Khảo sát nồng độ GAD 54 Bảng 3.1.3: Kết đo góc tiếp xúc nước 56 Bảng 3.2.1: Các thông số trình xử lý plasma oxy 58 Bảng 3.2.2: Các thơng số q trình xử lý plasma oxy 60 Bảng 3.2.3: Các thơng số q trình xử lý plasma oxy 61 Bảng 3.2.4: Các thơng số q trình xử lý plasma oxy 64 Bảng 3.2.5: Các thông số tối ưu trình xử lý plasma oxy 65 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 68 0.5 Wafer SiN 0.45 Thanh SiN 0.4 Độ hấp thụ 0.35 Baseline 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 400 500 600 Bước sóng (nm) 700 800 Hình 3.2.11: Độ hấp thụ dung dịch đo máy quang phổ UV-VIS với bước sóng hấp thụ khoảng 540 nm Trong thí nghiệm này, sau chip gắn enzim HRP ngâm vào dung dịch H2O2 o-dianisidine Tất dung dịch ngâm chuyển thành màu hồng, riêng dung dịch H2O2 O-dianisidine ngâm chip SiNx chưa qua bước biến đổi bề mặt không thay đổi (ứng với đường cong baseline) Điều cho thấy, qui trình biến đổi bề mặt xảy chứng minh nhờ enzim HRP Để kiểm chứng kỹ hơn, dung dịch đem đo phổ hấp thụ máy UV-Vis, Cary100 Qua phổ UV-Vis, thấy mẫu có gắn HRP có hấp thụ tăng lên bước sóng 540 nm, đỉnh hấp thụ đặc trưng o-dianisidine dạng bị oxi hóa Riêng dung dịch mẫu SiNx khơng gắn HRP phổ UV-Vis khơng có đỉnh hấp thụ, đặc trưng odianisidine dạng khử 3.2.5 Áp dụng quy trình xử lý plasma oxy +APTES+GAD tối ƣu để biến đổi bề mặt SiNx dao động để dị tìm DKK1 Kết mà phương pháp biến đổi bề mặt SiNx dao động áp dụng vào biến đổi bề mặt dao động có phủ SiNx nhằm dị tìm DKK1 Kết đánh giá cách xác định độ lệch dao động, từ xây dựng đường chuẩn Đã xây dựng đường chuẩn độ lệch dao động ứng với nồng độ DKK1 thay đổi từ (ng/ml) đến 500 (ng/ml) đồ thị hình 3.2.12: Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 69 400 Độ lệch thực nghiệm (nm) 200 Fit Độ lệch (nm) -200 -400 -600 -800 -1,000 -1,200 -1,400 100 200 300 400 Nồng độ DKK1 (ng/ml) 500 600 Hình 3.2.12: Đường chuẩn độ lệch dao động ứng với nồng độ DKK1 khác Mặc dù thay đổi độ lệch dao động chưa thực tuyến tính ta nhận thấy độ lệch giảm tăng nồng độ DKK1 Đồ thị cho thấy, ứng với nồng độ DKK1 200 ng/ml, độ lệch dao động thay đổi gần 300 nm Sự thay đổi đủ lớn để ta khắng định khả phát DKK1 chíp dao động thơng qua phương pháp biến đổi bề mặt Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 70 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG PHÁT TRIỂN ĐỀ TÀI 4.1 Kết luận Đề tài thu số kết sau:  Xây dựng quy trình biến đổi bề mặt Au dao động cysteamine sử dụng phương pháp đánh giá hiệu quy trình phương pháp chụp ảnh huỳnh quang, phương pháp đo góc tiếp xúc nước  Xác định thời gian ngâm nồng độ GAD tối ưu cho quy trình cải biến bề mặt Au dao động  Bước đầu áp dụng dao động dò tìm AFP đạt nồng độ thấp từ ~200ng/ml  Đã xác định thông số tối ưu quy trình xử lý plasma oxy, áp dụng vào xử lý bề mặt SiNx dao động Cải biến bề mặt SiNx dao động APTES, dùng chụp ảnh huỳnh quang, phản ứng đổi màu nhờ enzim HRP để đánh giá  Bước đầu thu kết dò tìm DKK1 khoảng nồng độ từ ~200 ng/ml dao động 4.2 Hƣớng phát triển đề tài  Tiếp tục nghiên cứu điều kiện thông số trình biến đổi bề mặt để nâng cao hiệu tăng độ nhạy cảm biến dao động  Nghiên cứu phương pháp khác để nâng cao độ nhạy cảm biến giảm thời gian quy trình xuống thấp Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 71 Tài liệu tham khảo [1] Nardo Ramírez Frómeta, “Cantilever Biosensors”, Ave 25 esq 158, Cubanacán, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba [2] Gennady Evtugyn, “Biosensors: Essentials”, Department of Analytical Chemistry, Kazan Federal University, Kazan, Russia [3] Dr Javed H Niazi KM, “Overview, history & types of biosensors”, Faculty of Engineering & Natural Sciences, Sabanci University [4] Janos, Tomaso, “Optical Biosensors”, Laboratory of Biosensors and Bioelectronics, Institute for Biomedical Engineering [5] K Kivirand, M Kagan, T Rinken, “Calibrating Biosensors in Flow-Through SetUps: Studies with Glucose Optrodes”, Intech, DOI: 10.5772/54127 [6] D Then, C Ziegler, “Cantilever – based sensors”, University of Kaiserslautern, Kaiserslautern, Germany [7] Josep M Llovet, Michel Beaugrand, “Hepatocellular carcinoma: present status and future prospects”, Journal of Hepatology 38 (2003) S136–S149 [8] Helen Reeves, Derek M Manas and Rajiv Lochan, “Liver Tumors - Epidemiology, Diagnosis, Prevention and Treatment", April 10, 2013 under CC BY 3.0 license, Intech [9] Ahmet Gurakar, James P Hamilton, Ayman Koteish, Zhiping Li, Esteban Mezey, “Hepatocellular Carcinoma”, 600 North Wolfe Street, Baltimore, Maryland [10] Thomas B Tomasi, “STRUCTURE AND FUNCTION FETOPROTEIN”, Ann Rev Med 1977 28:453-65 OF ALPHA- [11] Pietro Pucci, Rosa Siciliano, Antonio Malorni, Gennaro Marino, Mario F Tecce, Costante Ceccarini, Benedetto Terraria, “Human a-Fetoprotein Primary Structure: A Mass Spectrometric Study”, Biochemistry 1991, 30, 5061-5066 [12] Bin Yu, Xinrong Yang, Yang Xu, Genfu Yao, Huiqun Shu, Biaoyang Lin, Leroy Hood, Hongyang Wang, Shengli Yang, Jianren Gu, Jia Fan, Wenxin Qin, “Elevated expression of DKK1 is associated with cytoplasmic/nuclear b-catenin accumulation and poor prognosis in hepatocellular carcinomas”, Elsevier, Journal of Hepatology 50 (2009) 948–957 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 72 [13] Michel Rosso, “Modification of Silicon Nitride and Silicon Carbide Surfaces for Food and Biosensor Applications”, PhD thesis, Wageningen University, Dutch [14] Míriam Gironès i Nogué, “Inorganic and Polymeric Microsieves ”, PhD Thesis, University of Twente, The Netherlands [15] Manoj Joshi, Sunil Singh, BibhuSwain, Samadhan Patil, Rajiv Dusane, Ramgopal Rao, Soumyo Mukheji, “Anhydrous Silanization and Antibody Immobilization on Hotwire CVD Deposited Silicon Oxynitride Films”, IEEE India Annual conference 2004 Indicon 2004 [16] Shun'ko, Evgeny V, Stevenson, David E, Belkin, Veniamin S, "Inductively Coupling PlasmaReactor With Plasma Electron Energy Controllable in the Range From ~6 to ~100 eV" IEEE Transactions on Plasma Science 42 (3): 774–785 [17] Octmvien Buiu, Gray PKennedy et.al, “Structural Analysis of Silicon Dioxide and Silicon Oxynitride Films Produced using an Oxygen Plasma”, IEEE Transactions on Plasma Science,VOL.26, N0.6, Dec.1998 [18] Buiu, Gartner, Mariuca, Taylor, “Structural analysis of silicon dioxide and silicon oxynitride films produced using an oxygen plasma”, Plasma Science, IEEE Transactions on (Volume:26 , Issue: ) [19] C Jime´nez, J Perrie`re, I Vickridge, J.P Enard, J.M Albella, “Transformation of silicon nitride in oxygen plasma”, Surface and Coatings Technology, Volume 45, Issues 1–3, 15 May 1991, Pages 147–154 [20] S Weichela, R de Reusa, S Bouaidata, P.A Rasmussena, O Hansena, K Birkelundb, H Dirac, “Low-temperature anodic bonding to silicon nitride”, Sensors and Actuators A: Physical, Volume 82, Issues 1–3, 15 May 2000, Pages 249–253 [21] Greg T Hermanson, “BIOCONJUGATE TECHNIQUES ”, 525 B Street, Suite 1800, San Diego, CA 92101-4495, USA, Third edition 2013, chapter 10 [22] N F Martínez, P M Kosaka, J Tamayo, J Ramírez, O Ahumada, J Mertens, T D Hien, C V Rijn, and M Calleja, “High throughput optical readout of dense arrays of nanomechanical systems for sensing applications ”, Review of Scientific Instruments 81, 125109 (2010) [23] Michel Godin, Vincent Tabard-Cossa, Peter Gruătter and Peter Williams, “Quantitative surface stress measurements using a microcantilever”, Applied Physics Letters, Volome 79, Number 4, 2001 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 73 [24] Yuehua Yuan, “Surface Science Techniques”, Springer Berlin Heidelberg (2013), chapter trang [25] Sung-Hoon Kim, Sun-Kyung Han, Jae-Ho Kim, Myung-Bock Lee, Kwang-Nak Kohd, Shin-Won Kang, “A self-assembled squarylium dye monolayer for the detection of metal ions by surface plasmon resonances”, Elsevier, Dyes and Pigments 44 (2000) 55-61 [26] http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx [27].http://benhvienk.com/pcut/tim-hieu-benh-ung-thu/1059-cac-phuong-phap-chandoan-ung-thu [28] http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/srp3258?lang=en®ion=VN [29] http://www.cancer.net [30] http://en.wikipedia.org/wiki/Contact_angle Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 74 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI stt 01 Tên báo Investigation of the surface conditioning of silicon-based substrate to improve silanization efficiency of biosensor Tên tác giả Thanh Trung Nguyen, Tho Van Pham, Tuyen Thi Thanh Le, Hien Duy Tong, Khoa Thanh Nhat Phan Nơi công bố The 7th International Workshop on Advanced Materials Science and Thời gian công bố 06/11/2014 Nanotechnology, Halog city, Vietnam Investigation of the surface conditioning of silicon-based substrate to improve silanization efficiency of biosensor Thanh Trung Nguyen, Tho Van Pham, Tuyen Thi Thanh Le, Hien Duy Tong, Khoa Thanh Nhat Phan Laboratory for Nanotechnology, Vietnam National University-Ho Chi Minh City, Community 6, Linh Trung Ward, Thu Duc District, Ho Chi Minh City,Vietnam Email: ptnkhoa@vnuhcm.edu.vn ; nguyentrungthanh5@gmail.com Abstract: In order to increase sensitivity of an immunoassay biosensor, it is mandatory to improve the efficiency of binding antibody on the biosensor surface For silicon substrate or silicon nitride substrate, the best method to modify these surfaces is silanization, in which a silane coupling reagent is used to convert silicon or silicon nitride surface into a functional surface which can react with amine group on antibody Our research showed that the silanol groups on the surface play an essential role in this method We suggested the method of oxygen plasma treatment to increase the silanol group Plasma parameters such as oxygen flow, power and time were investigated The result showed that the efficiency of binding antibody increased significantly This result is of high value to be applied into biosensor modification Keywords: Silicon nitride, biosensor, oxygen plasma, immunoassay biosensor Classification numbers: 6.09 Introduction Si and SixNy materials have been widely used in semiconductor industry SixNy is often used as an insulating thin film as a surface passivating layer in the semiconductor industry The Young modulus and stress of SixNy thin film can be tuned during deposition process In order to be able to resist HF etching and have low internal stress, SixNy can be deposited with high ratio of Si (silicon–rich SixNy) SixNy can also act as a barrier layer against the diffusion of ions with high mobility (such as Na+, K+ ions in biological environment), thus is is used widely in bio MEMS [1] Other electrical and mechanical properties of SixNy can be changed to suit the application requirements by selecting the parameters of deposition process Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 75 accordingly SixNy also can be used in biological sensors to collect the biological element if its surface is properly modified A method called silanization is often used to modify Si and SixNy surfaces, in which a silane compound reacts with silanol groups on the surfaces and converts the surface to be reactive toward aldehyde or amine groups, which is abundant in protein Silanol group is abundant on silica or glass surface, but few are found on the native oxide layer formed on the surface of Si and SixNy [2] Therefore, another step is used, either chemically [3] or physically, to increase the silanol on Si and SixNy Chemical methods use liquid chemicals with strong oxidation or strong acidic properties This leads to the corrosion or total damage of metal patterns on the biosensors, which is essential to output signal In this paper, we present the physical method, treatment with oxygen plasma, which does no such harm The Si and SixNy samples were treated with oxygen plasma in ICP (inductive-coupled plasma) system to increase the density of silanol groups without altering the mechanical properties of the thin film We investigated the effects of plasma parameters including oxygen flow, treatment time and plasma power to find an optimized recipe Experiment The following protocol was used to modify the Si and SixNy samples: Figure 1: Cleaning process to remove inorganic and organic contaminants on samples’ surface 2.1 Cleaning process Si and SixNy with dimension 5x5 mm2 were cleaned as below: Soak in acetone Soak in ethanol Dry under a stream of N2 gas Rinse with DI water Rinse with DI water Soak in piranha solution (5 mins) Figure 1: Cleaning process to remove inorganic and organic contaminants on samples’ surface 2.2 Oxygen plasma treatment Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 76 After cleaned, the samples were treated in oxygen plasma The treatment was performed in the system ICP-200iPB (SAMCO, Japan) at the Laboratory for Nanotechnology, Vietnam National University, Ho Chi Minh city Figure 2: ICP-200iPB system at the Laboratory for Nanotechnology The treatment created a thin SiO2 film on the Si and silicon oxynitride film on SixNy surface of the samples This was done when reactive oxygen species substituted nitrogen on the surface, which happened through steps: (i) oxygen injection at the oxide-plasma interface; (ii) transport of the oxygen species through the growing oxide; (iii) transformation (oxidation reaction) at the oxide-nitride interface; (iv) transportation of nitrogen species back to the oxide-plasma interface [4] Figure 3: Depiction of inductive-coupled plasma system After treated in oxygen plasma, the samples were soaked in H2O2 30% solution at 150oC for 15 minutes to form silanol groups on Si and SixNy surfaces Then the samples were rinsed with deionized water and dried with nitrogen gas 2.3 Silanization with GOPTS Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 77 Figure 4: GOPTS molecule 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPTS) is a useful silanization agent The molecule contains three silane groups to bond with silanol group on the sample surface, and an epoxy group The reaction between the silane groups of GOPTS and the silanol groups on the sample surface happens through four stages: (i) hydrolysis of silane groups, (ii) adjacent silane groups bond with each other via hydrogen bond, (iii) condensation, (iv) forming hydrogen bond with silanol groups on sample surface and (v) condensation to form silane layer on the sample surface The epoxy ring can be opened and engage in reaction with thiol (-SH), amine or hydroxyl-containing ligands, depending on the pH of the environment In our study, we used 2% GOPTS (Aldrich) solution in toluene The samples were soaked overnight at room temperature Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 78 Figure 5: Mechanism of silanization [5] 2.4 Protein immobilization The efficiency of oxygen plasma treatment is proportionate to the density of protein reacting with epoxy group of GOPTS attached to the surface In our study, we used the protein lens culinaris agglutinin conjugated with fluorescein isothiocyanate (F-LCA, from Vector Laboratory, USA) to react with epoxy groups The concentration of F-LCA was 2.5μg/mL The samples were soaked in F-LCA solution in hours at 4oC After that the samples were washed in PBS to remove F-LCA physically absorbed on sample and then rinsed with DI water and dried with nitrogen gas The efficiency of oxygen plasma treatment was evaluated by taking fluorescence imaging with the fluorescence microscope BX41, Olympus Results and discussion Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 79 We investigated the following parameters of plasma: treatment time, O2 flow and plasma power These parameters affect the density of reactive oxygen species created by plasma and their lifetime 3.1 Effect of treatment time In this investigation, the inductive-coupling of plasma power was set at 300W, the bias power was set at 50W, the oxygen flow was set at 40 sccm and the pressure in process chamber was set at 10 Pa The treatment time was varied between 20 and 60 minutes Table 1: Process parameters for oxygen plasma treatment PICP=300w; PBias= 50w Oxygen flow = 40sccm Pressure = 10Pa Treatment time (mins) 20 30 45 60 RFU 0.1 0.3 15.1 75.5 The fluorescence images were processed with the software ImageJ to calculate the averaged brightness We assumed that the brightness of the images was directly proportionate to the fluorescence intensity of F-LCA attached (which was in turn proportionate to the density of epoxy groups and the efficiency of oxygen plasma treatment) Therefore, we considered the averaged brightness of the image as the relative fluorescence unit (RFU) and used it to compare the efficiency of experiments Figure 6: Dependence of RFU on plasma treatment time The graph shows that the longer the treatment happened, the brighter the fluorescence intensity became The samples treated in less than 30 minutes had negligible fluorescence Sample treated in 45 minutes gave some fluorescence, and sample treated in 60 minutes gave very strong fluorescence Perhaps in the first 30 minutes, the oxygen plasma just removed contaminant on the sample and did not start creating oxide Only after some period longer than 30 minutes then the formation of oxide started to happen and thus more silanol groups were created This led to the increase of GOPTS number attached to the surface and subsequently more F-LCA immobilized on the surface 3.2 Effect of oxygen flow Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 80 In this investigation, the oxygen flow was varied from 20 to 160 sccm The other parametes were fixed at values stated in Table The results show that oxygen flow strongly affected the density of silanol group created on samples Either too high or too low flow had bad effect The investigation shown that the optimized oxygen flow was about 40 sccm At the regime of low oxygen flow, there might be not enough oxygen flowing into the chamber and received energy from plasma to become excited and react with sample surface Table 2: Process parameters for oxygen plasma treatment PICP= 300w; PBias= 50w Treatment time: 60 minutes Pressure= 10Pa Oxygen flow (sccm) 20 40 80 120 160 RFU 2.8 75.5 16.5 4.4 3.7 At the regime of too high oxygen flow, there might be too much oxygen flowing into the chamber, and the plasma was not able to make all of them reactive There might be two kinds of oxygen in the chamber: reactive oxygen (which received energy from plasma, this species was at excited level and was chemically active) and normal oxygen (which did not receive energy from plasma, this species was at ground energy level and thus less chemically active) The oxygen species at ground energy level could have collide and take some energy from the excited oxygen, thus there were fewer oxygen excited enough to react with sample surface Therefore, there would be less silanol group created Figure 7: Dependence of RFU on oxygen flow 3.3 Effect of plasma power Table 3: Parameters for oxygen plasma treatment Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 81 PBias= 50w; Pressure = 10Pa Oxygen flow = 40sccm Treatment time: 60 minutes ICP Power (W) 200 300 400 RFU 2.6 75.5 16.0 In this investigation the ICP power was set at various value, while other parameters were fixed The results shows that at 300 W of ICP power the efficiency of plasma treatment is the greatest We haven’t been able to understand this kind of behavior yet and more tests will be conducted in the future about this parameter Figure 8: Dependence of RFU on ICP power 3.4 Optimized recipe and application The following table lists the optimized recipe for oxygen plasma treatment in the conditions of our experiments: Table 4: Optimized parameters for oxygen plasma treatment ICP power Bias power 50 (W) Oxygen flow 40 (sccm) Pressure 10 (Pa) Treatment time Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ 300 (W) 60 (minutes) Nguyễn Trung Thành 82 (a) (b) Figure 8: Fluorescence image of samples (a) without oxygen treatment and (b) with oxygen treatment The green color from the sample treated with oxygen plasma under fluorescence microscope proved that F-LCA was immobilized and hence the sample was efficiently modified with GOPTS We can conclude that the treatment helped increase significantly the density of silanol groups on the surface, thus increased the density of GOPTS attached and finally the density of F-LCA immobilized This optimized recipe can be used in immunosensor, in which F-LCA can be replaced with other antibody to detect antigen The optimized recipe can help increase the sensitivity of the immunosensor, because the higher the density of antibody on the sensor is, the more antigens the sensor can capture Acknowledgments The authors highly appreciate the financial support of Vietnam National University - Ho Chi Minh City This work was funded by Vietnam National University - Ho Chi Minh City through the scientific project 2014 with the code of C2014-32-01 References [1] Nardim M and Kirt W 2003 An Introduction to Microelectromechanical Systems Engineering (London: Artech House) [2] Williams R A and Blanch H W 1994 Covalent immobilization of protein monolayers for biosensor application Biosensors & BioeIectronics 159 [3] Lee S H, Lee C S, Shin D S, Kim B G, Lee Y S and Kim Y K 2004 Microprotein patterning using a lift-off process with fluorocarbon thin film Sensors and Actuators B 99 623 [4] Buiu O, Kennedy G P, Gartner M and Taylor S 1998 Structural Analysis of Silicon Dioxide and Silicon Oxynitride Films Produced using an Oxygen Plasma IEEE Transactions on Plasma Science 26 1700 [5] Greg T H 2013 Bioconjugate Techniques 3rd edition chapter 13 (London, Academic Press) p 536 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành