Nghiên cứu xác định chế độ thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng (litopenaeus vannamei) bằng enzyme để tạo ra dịch thủy phân protein ứng dụng trong sản xuất nước mắm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG -*** HOÀNG THỊ THU GIANG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CHẾ ĐỘ THỦY PHÂN ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) BẰNG ENZYME ĐỂ TẠO RA DỊCH THỦY PHÂN PROTEIN ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NƢỚC MẮM LUẬN VĂN THẠC SĨ Khánh Hòa, tháng năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG -*** HOÀNG THỊ THU GIANG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CHẾ ĐỘ THỦY PHÂN ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) BẰNG ENZYME ĐỂ TẠO RA DỊCH THỦY PHÂN PROTEIN ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NƢỚC MẮM LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 607/QĐ-ĐHNT Quyết định thành lập HĐ: 685/QD-DHNT Ngày bảo vệ: 19/8/2017 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS NGÔ ĐĂNG NGHĨA TS NGUYỄN THỊ MỸ HƢƠNG Chủ tịch Hội đồng: PGS.TS VŨ NGỌC BỘI Khoa sau đại học: Khánh Hòa, tháng năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết nêu luận văn trung thực Khánh Hòa, ngày17 tháng năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thu Giang iii LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành luận văn này, nhận đƣợc quan tâm, giúp đỡ nhiều từ thầy cơ, gia đình, đồng nghiệp bạn bè Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng biết ơn đến PGS.TS Ngơ Đăng Nghĩa TS Nguyễn Thị Mỹ Hƣơng, ngƣời tận tình bảo nhƣ hƣớng dẫn tơi tồn trình thực luận văn Xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Nha Trang tạo điều kiện cho tơi tham gia khố học, thầy cô giảng dạy khoa Sau Đại học truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trƣờng Tôi xin cám ơn tập thể cán Các phòng thí nghiệm Trung tâm Thí nghiệm Thực hành - Trƣờng Đại học Nha Trang ln giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực luận văn này, cám ơn anh chị, đồng nghiệp quan tâm, giúp đỡ, động viên cổ vũ tinh thần tôi, cho tơi ý kiến bổ ích để hồn thành đề tài Cám ơn ngƣời bạn, ngƣời em thân thiết bên cạnh chia sẻ ủng hộ tơi Và hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình ngƣời thân yêu sát cánh bên tôi, hỗ trợ vật chất lẫn tinh thần, tạo điều kiện thuận lợi để tơi chun tâm học tập, làm việc nghiên cứu Khánh Hòa, ngày17 tháng năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thu Giang iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CÁM ƠN iv MỤC LỤC .v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .ix MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tôm phế liệu tôm 1.1.1 Sản lƣợng khai thác nuôi trồng tôm Việt Nam 1.1.2 Tình hình chế biến xuất tôm Việt Nam .4 1.1.3 Phế liệu tôm 1.2 Tổng quan thủy phân protein enzyme protease .8 1.2.1 Khái quát thủy phân protein 1.2.2 Thủy phân phƣơng pháp hóa học 1.2.3 Thủy phân enzyme 1.2.4 Enzyme protease 1.2.5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình thủy phân protein 14 1.3 Ứng dụng sản phẩm thủy phân protein 15 1.3.1 Ứng dụng sản phẩm thủy phân protein lĩnh vực công nghiệp thực phẩm 15 1.3.2 Ứng dụng sản phẩm thủy phân protein lĩnh vực dƣợc phẩm 18 1.3.3 Ứng dụng sản phẩm thủy phân protein lĩnh vực nuôi trồng thủy sản 18 1.3.4 Ứng dụng sản phẩm thủy phân protein lĩnh vực khác 19 1.4 Tổng quan nƣớc mắm 20 1.4.1 Giới thiệu sản phẩm nƣớc mắm 20 1.4.2 Các phƣơng pháp sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày: 21 1.4.3 Giá trị dinh dƣỡng thành phần hóa học nƣớc mắm 22 1.4.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình sản xuất nƣớc mắm 23 1.4.5 Tiêu chuẩn đánh giá chất lƣợng nƣớc mắm 24 v 1.5 Tình hình nghiên cứu giới nƣớc thủy phân protein enzyme protease 25 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 25 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 26 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 28 2.1.1 Đầu tôm thẻ chân trắng 28 2.1.2 Enzyme 28 2.1.3 Hoá chất, trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm 28 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Phƣơng pháp thu xử lý mẫu .29 2.2.2 Phƣơng pháp phân tích hóa học .29 2.2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu 30 2.2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .30 2.3 Sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng theo thông số tối ƣu xác định đƣợc đánh giá chất lƣợng sản phẩm thủy phân protein thu đƣợc 44 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Thành phần hóa học đầu tơm thẻ chân trắng 45 3.2 Kết lựa chọn loại enzyme tốt cho trình thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng 45 3.3 Kết tối ƣu hóa chế độ thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng enzyme Alcalase 47 3.3.1 Kết thí nghiệm thăm dị thơng số thích hợp cho thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng 47 3.3.2 Kết tối ƣu hóa chế độ thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng enzyme Alcalase 53 3.4 Kết đánh giá chất lƣợng dịch thủy phân protein theo quy trình sản xuất 63 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần hóa học phế liệu tơm Penaeus vannamei (Trung cộng sự, 2007) Bảng 1.2: Thành phần axit amin sản phẩm bột nêm canh gia vị đƣợc sản xuất từ dịch thủy phân protein đầu cá chẽm (Đỗ Trọng Sơn cộng sự, 2013b) 17 Bảng 1.3: Các tiêu cảm quan nƣớc mắm 24 Bảng 1.4: Các tiêu hóa học nƣớc mắm 24 Bảng 1.5: Các tiêu vi sinh nƣớc mắm 25 Bảng 3.1:Thành phần hóa học đầu tơm thẻ chân trắng ( tính theo khối lƣợng ƣớt) 45 Bảng 3.2: Bảng quy đổi biến mã biến thực 54 Bảng 3.3: Bảng thiết kế thí nghiệm theo biến mã sử dụng mơ hình Box-behnken kết 54 Bảng 3.4: Kết phân tích ANOVA cho mơ hình đáp ứng bậc hàm mục tiêu độ thủy phân (%) 56 Bảng 3.5: Thơng số đánh giá tính phù hợp tƣơng quan mơ hình 56 Bảng 3.6: Các hệ số ảnh hƣởng tronng mơ hình hồi quy 58 Bảng 3.7: Các thông số tối ƣu từ mơ hình hồi quy 61 Bảng 3.8: Thí nghiệm lặp lại điểm tối ƣu kết 62 Bảng 3.9: Chất lƣợng cảm quan dịch đạm thủy phân 63 Bảng 3.10: Chỉ tiêu hóa học dịch đạm thủy phân 63 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Sơ đồ xác định thành phần hóa học đầu tơm thẻ chân trắng 30 Hình 2.2: Sơ đồ dự kiến sản xuất dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng 32 Hình 2.3: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 33 Hình 2.4: Sơ đồ lựa chọn loại enzyme tốt để thủy phân đầu tơm thẻ chân trắng 35 Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nƣớc thích hợp 37 Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Alcalase thích hợp .38 Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp .40 Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp 42 Hình 3.1: Ảnh hƣởng loại enzyme đến độ thủy phân 46 Hình 3.2: Ảnh hƣởng loại enzyme đến hiệu suất thu hồi nitơ 46 Hình 3.3: Ảnh hƣởng tỉ lệ nƣớc đến độ thủy phân 47 Hình 3.4: Ảnh hƣởng tỉ lệ nƣớc đến hiệu suất thu hồi nitơ 48 Hình 3.5: Ảnh hƣởng tỉ lệ enzyme đến độ thủy phân .49 Hình 3.6: Ảnh hƣởng tỉ lệ enzyme đến hiệu suất thu hồi nitơ 49 Hình 3.7: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến độ thủy phân 50 Hình 3.8 : Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi nitơ .51 Hình 3.9:Ảnh hƣởng thời gian đến độ thủy phân 52 Hình 3.10: Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi nitơ 52 Hình 3.11: Bề mặt đáp ứng thể ảnh hƣởng tỉ lệ enzyme tỉ lệ nƣớc đến độ thủy phân 58 Hình 3.12: Bề mặt đáp ứng thể ảnh hƣởng yếu tố nhiệt độ tỉ lệ nƣớc đến độ thủy phân 59 Hình 3.13: Bề mặt đáp ứng thể ảnh hƣởng thời gian tỉ lệ nƣớc đến độ thủy phân .59 Hình 3.14: Bề mặt đáp ứng thể ảnh hƣởng nhiệt độ tỉ lệ enzyme đến độ thủy phân 60 Hình 3.15: Bề mặt đáp ứng thể ảnh hƣởng tỉ lệ enzyme thời gian đến độ thủy phân 60 Hình 3.16: Bề mặt đáp ứng thể ảnh hƣởng yếu tố nhiệt độ thời gian đến độ thủy phân 61 Hình 3.17: Điểm tối ƣu thu đƣợc từ mơ hình hồi quy 62 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Nghiên cứu xác định chế độ thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng ( Litopenaeus vannamei) enzyme để tạo dịch thủy phân protein ứng dụng sản xuất nƣớc mắm Giới thiệu đề tài mục tiêu nghiên cứu Việt Nam quốc gia mạnh xuất thủy hải sản, tơm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) mặt hàng chủ lực ngành thủy sản nay, sản phẩm đƣợc chế biến đa dạng phong phú tạo lƣợng phế liệu tơm có chứa nhiều thành phần có giá trị dinh dƣỡng nhƣ protein, astaxanthin, chitin Các thành phần ứng dụng số lĩnh vực nhƣ kháng khuẩn, kháng nấm; bổ sung thức ăn thủy sản; chống ơxy hóa, bảo quản thực phẩm; bổ sung tăng giá trị dinh dƣỡng thức ăn cho cá hồi; dƣợc phẩm, mỹ phẩm…, cần tìm cách tận dụng triệt để nguồn protein đầu tơm tránh gây lãng phí nguồn nguyên liệu biến chúng trở thành sản phẩm có giá trị để từ tăng thêm lợi nhuận cho doanh nghiệp chế biến thủy sản, nâng cao giá trị sử dụng phế liệu đồng thời giảm nguy nhiễm mơi trƣờng góp phần phát triển ngành thủy sản cách bền vững Phƣơng pháp nghiên cứu Đề tài sử dụng phƣơng pháp enzyme để tiến hành thủy phân protein đầu tôm thẻ chân trắng Q trình thủy phân đầu tơm thẻ chân trắng đƣợc thực loại enzyme: Alcalase, Protamex Flavourzyme để chọn enzyme tốt Sau lựa chọn đƣợc enzyme, tiến hành thực nghiên cứu xác định thơng số tối ƣu cho q trình thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng enzyme lựa chọn Cuối cùng, sản xuất dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng theo thông số tối ƣu để ứng dụng vào sản xuất nƣớc mắm Kết đạt đƣợc  Đã xác định đƣợc thành phần hóa học đầu tơm thẻ chân trắng với độ ẩm 81,78%, protein 10,77%, lipit 4,39% tro 2,58% ix  Đã nghiên cứu lựa chọn đƣợc loại enzyme thích hợp cho q trình thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng để thu hồi dịch thủy phân protein enzyme Alcalase  Đã tìm đƣợc kết tối ƣu cho chế độ thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng enzyme Alcalase tỷ lệ nƣớc /nguyên liệu 25,85%, tỷ lệ enzyme/nguyên liệu 0,3%, nhiệt độ thủy phân 56,53oC thời gian thủy phân 8,56  Dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng đạt yêu cầu chất lƣợng sử dụng sản xuất nƣớc mắm x Tài liệu tiếng Anh 10 Akiyama, D.M., Dominy, W.G., Lawrence, A.L., 1992 Penaeid shrimp nutrition In: Fast AW., Lester LJ (eds) Marine Shrimp Culture: Principles and Practices Developments in Aquaculture and Fisheries Science, 23, 535- 568 11 Aranyakananda, P., Lawrence, A.L., 1994 Effects of ingestion rate on dietary protein and energy requirenments of penaeus vannamei and the optimal protein to energy ratio Memorias Simposio en Nutricion Acuicola Monterrey, Mexico, 1-19 12 Aspmo, S.I., Horn, S.J., Eijsink, V.G.H., 2005 Enzymatic hydrolysis of Atlantic cod ( Gadus morhua L.) viscera Process Biochemistry, 40, 1957-1966 13 Chalamaiah, M., Narsing Rao, G., Rao, D G., Jyothirmayi, T., 2010 Protein hydrosates from meriga ( Cirrhinus mrigala) egg and evaluation of their functional properties Food Chemistry, 120, 652-657 14 Ghorbel, S., Souissi, N., Triki-Ellouz, Y., Dufosse, L., Guerard, F., Nasri, M., 2005 Preparation and testing of Sardinella protein hydrolysates as nitrogen source for extracellular lipase production by Rhizopus oryzae World Journal of Microbiology & Biotechnology 21, 33-38 15 Hardy, R.W., 1991 Fish hydrolysates: production and use in aquaculture feeds In: Akiyama, D.M., Tan, R.K.H(eds) Proceeding of the aquaculture feed processing and nutrition workshop American Soybean Association, Singapore, 109-115 16 Ho, T., 2009 Feed attractants for Juvenile chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) prepared from hydrolysates of Pacific hake (Merluccius productus) Master of science, The university of Bristish Columbia 17 Holanda HD, Netto FM., 2006 Recovery of components from Shrimp (Xiphopenaeus kroyeri ) processing waste by enzymatic hydrolysis Journal of Food Sciences., 71(5), 298-303 18 Je, J.Y., Qian, Z.J., Lee, S.H., Byun, H.G., Kim, S.K., 2008 Purification and antioxidant properties of bigeye tuna (thunnus obesus) dark muscle peptide on free radical-mediated oxidative systems J Med Food 11(4): 629-637 19 Kotdamanis, Y.P., Gisbert, E., Gatesope, F.J., Zambonino Infante, J., Cahu, C., 2007 Effects of different dietary levels of fish protein hydrolysates on growth, digestive enzymes, gut microbiota, and resistance to Vibrio anguillaruin European sea bass ( Dicentrarchus labrax) larvae Comparative Biochemistry and Physiology Part A 147, 205-214 66 20 Kristinsson, H.g., Rasco, B.A., 2000b Fish protein hydrolysates: production, biochemical and functional properties Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 40(1), 43-81 21 Marchbank, T., Limdi, J.k., Mahmood, A., Elia, G., Playford, R.J., 2008 Clinical trial: Protective effect of a commericial fish protein hydrolysate against indomethacin (NSAID)- induced small intestinal injury Alimentary Pharmacology and therapeutics, 28, 799-804 22 Martone CB, Olinda PB, Jorge JS 2005 Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and archaea growth media Bioresource Technology, 96, 383-387 23 Nesse, K.O., Nagalakshmi, A.P., Marimuthu, P., Mamta S., 2011 Efficacy of a fish protein hydrolysate in malnourished children Indian Journal of Clinical Biochemistry, 26(4), 360-365 24 Pacheco-Aguilar, R., Mazorra-Manzano, M.A and Ramirez-Suarez, J.C., 2008 Functional properties of fish protein hydrolysates from Pacific whiting (Merluccius productus) muscle produced by a commercial protease Food Chemistry, 109, 782-789 25 Pasupuleti, V.K., Braun, S., 2010 State of the art manufacturing of protein hydrolysates In: PasupuletiVK, DemainAL, editors Protein hydrolysates in biotechnology, New York: Springer Dordrec 26 Randriamahatody Z, Sylla K.S.B, Nguyen T.M.H., Donnay-Moreno C., Razanamparany L., Bourgougnon N., Bergé J.P., 2011 Proteolysis of shrimp byproducts (Penaeus monodon) from Madagascar CyTA- Journal of Food, 9(3), 220-228 27 Sowmya, R., Rathinarạ, K., Sachindra, N.M., 2011 An autolytic process for recovery of antioxidant activity rich carotenoprotein from shrimp heads Marine Biotechnology, 13, 918-927 Trang web 28 Mai Anh Truy cập 09/12/2014, từ http://www.thuysanvietnam.com.vn 29 Nhƣ Hoa Truy cập 04/01/2017, từ http://www.fistenet.gov.vn 30 Nhƣ Hoa, 2016 Năm 2016, giá trị sản xuất ngành thủy sản đạt 200 nghìn tỷ đồng, từ http://vanban.hanoi.gov.vn Truy cập 04/01/2017, 67 31 Nguyễn Chi, 2016 Ngành thủy sản tổng kết hoạt động năm 2016, từ http://thuysanvietnam.com.vn Truy cập 31/12/2016, 32 Nguồn: cổng thơng tin phủ, 2015 Sản lƣợng thủysaản khai thác nuôi trồng tăng nhẹ, từ http://tuoitre.vn Truy cập 28/11/2016 33 Kim Thu, 2015 Xuất tơm tốn cung cầu lợi nhuận, từ http://vasep.com.vn Truy cập 12/0/2016 34 Lê Hằng, 2016 Nhập tôm Việt Nam năm 2015, từ http://vasep.com.vn Truy cập 02/02/2016 35 Kim Thu, 2017 Xuất tôm phục hồi tích cực năm 2016, từ http://vasep.com.vn Truy cập 14/02/2017 68 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Bảng 1: Độ thủy phân hiệu suất thu hồi nitơ đới với loại enzyme khác Độ thủy phân (%) Mẫu Enzyme Flavourzyme Enzyme Alcalase Enzyme Protamex Hiệu suất thu hồi nitơ (%) 39,1 59,9 42 66,1 39,95 61,4 Bảng 2: Độ thủy phân hiệu suất thu hồi nitơ, hàm lƣợng nitơ tổng số mẫu có tỉ lệ nƣớc khác Mẫu Độ thủy phân (%) Hiệu suất thu hồi nitơ (%) Nƣớc 10% 44,8 45,8 Nƣớc 20% 49,1 51,0 Nƣớc 30% 52,1 51,9 Nƣớc 40% 50,8 52,8 Nƣớc 50% 51,8 51,3 Bảng 3: Độ thủy phân hiệu suất thu hồi nitơ mẫu có tỉ lệ enzyme khác Mẫu Độ thủy phân (%) Hiệu suất thu hồi nitơ (%) Enzyme 0.1% 41,7 49,7 Enzyme 0.2% 47,5 60,3 Enzyme 0.3% 51,6 63,7 Enzyme 0.4% 51,1 62,4 Enzyme 0.5% 49,9 63,7 Bảng 4: Độ thủy phân hiệu suất thu hồi nitơ, nitơ tổng số mẫu có nhiệt độ khác Mẫu Độ thủy phân (%) Hiệu suất thu hồi nitơ (%) 40oC 40,5 45,6 45oC 46,6 52,4 50oC 54,5 59,6 55oC 58,8 65,6 60oC 57,4 60,6 Bảng 5: độ thủy phân hiệu suất thu hồi nitơ, nitơ tổng số mẫu có thời gian khác Mẫu Độ thủy phân (%) Hiệu suất thu hồi nitơ(%) 48,9 57,6 55,5 61,3 60,3 65,6 62,8 68,2 63 67,9 10 PHỤ LỤC 2: Phƣơng pháp xác định độ thủy phân tính hiệu suất thu hồi nitơ Phƣơng pháp xác định độ thủy phân (DH%) a Dụng cụ hóa chất - Bình định mức 100ml - Cốc thủy tinh 100ml - Bể ổn nhiệt - Ống nghiệm - Tetra borat natri - Glycine - DNFB - HCl đậm đặc b Cách tiến hành  Xây dựng đƣờng chuẩn glycine - Dung dịch glycine 5mM: Cân 0,0375g glycine sau định mức với 100ml nƣớc cất - Dung dịch tetra borat natri 2% - Hút 325µl DNFB (dinitrofluorobenzene) pha 25ml etanol - Tiến hành hút vào ống nghiệm với nồng độ tƣơng ứng theo bảng Mỗi nồng độ cho vào ống 1ml dung dịch tetra borat natri 2% - Sau cho vào ống nghiệm 0,25ml dung dịch DNFB,lắc đem ủ bể ổn nhiệt 600C thời gian 10 phút, tiến hành làm nguội Sau làm nguội ta cho 2ml HCl đậm đặc vào tất ống nghiệm, lắc đem đo hàm lƣợng OD máy quang phổ tử ngoại khả kiến bƣớc sóng 410nm Nồng độ 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 Glycine 5mM 40 80 120 160 200 1000 960 920 880 840 800 0,367 0,570 0,882 1,300 1,528 Nƣớc (µl) OD (410nm) - Đƣờng chuẩn  Xác định độ thủy phân; - Hút 500 µl dịch thủy phân cho vào bình định mức 100ml, thêm nƣớc cất đủ vạch, lắc đỏ cốc thủy tinh 100ml khô (hệ số pha loãng 200 lần) - Hút 1ml mẫu pha loãng vào ống nghiệm tƣơng ứng, mẫu ống nghiệm Sau cho 1ml dung dịch tetra borat natri 2% vào ống nghiệm chứa mẫu ống nghiệm khơng chứa mẫu dịch thủy phân pha lỗng để làm mẫu chuẩn Tiến hành cho vào ống nghiệm 0,25ml dung dịch DNFB,lắc đem ủ bể ổn nhiệt 600C thời gian 10 phút, tiến hành làm nguội Sau làm nguội ta cho 2ml HCl đậm đặc vào tất ống nghiệm, lắc đem đo hàm lƣợng OD máy quang phổ tử ngoại khả kiến bƣớc sóng 410nm - Cơng thức tính độ thủy phân: A x 200 DH = P x 8,6 x 0,001 x 100 Trong đó: - DH: Độ thủy phân (%) A: Lƣợng axit amin đƣợc hình thành trình thuỷ phân (mol/ml) 200: Hệ số pha loãng P: Hàm lƣợng protein 1ml dịch thủy phân (g/ml) Phƣơng pháp tính hiệu suất thu hồi Nitơ Trong đó: • H: Hiệu suất thu hồi nitơ (%) • Lƣợng nitơ tổng số có dịch thủy phân (g) • Lƣợng nitơ tổng số có nguyên liệu đem thủy phân (g) PHỤ LỤC 3: Các phƣơng pháp xác định thành phần hóa học Xác định hàm lƣợng nƣớc nguyên liệu theo phƣơng pháp sấy a Nguyên lý Dùng nhiệt độ cao làm bay nƣớc mẫu, sau dựa vào hiệu số khối lƣợng mẫu trƣớc sau sấy để tính hàm lƣợng nƣớc thực phẩm b Dụng cụ, hóa chất - Tủ sấy điều chỉnh đƣợc nhiệt độ - Cân phân tích độ xác 10-4 g - Cốc sấy sứ thủy tinh - Đũa thủy tinh - Bình hút ẩm c Tiến hành Sấy cốc sấy đến khối lƣợng không đổi: cốc đƣợc rửa úp khô, sấy nhiệt độ 100 – 105oC khoảng giờ, lấy làm nguội bình hút ẩm sau cân sấy tiếp nhiệt độ -> làm nguội bình hút ẩm -> cân đến hai lần cân liên tiếp sai khác khơng q 0.0005g Cân xác 5g mẫu cốc sấy khô đến khối lƣợng không đổi Đánh tơi mẫu đũa thủy tinh, dàn mẫu đáy cốc chuyển cốc vào tủ sấy, sấy 6080oC vịng Sau nâng nhiệt độ sấy lên 100-105oC sấy liên tục vòng giờ(cứ đảo mẫu lần) Lấy mẫu để nguội bình hút ẩm -> cân cân phân tích -> sấy tiếp nhiệt độ 100-105oC đến khối lƣợng khơng đổi d Tính kết Độ ẩm (hầm lƣợng nƣớc) mẫu đƣợc tính theo cơng thức sau: Trong : • XH2 O: độ ẩm thực phẩm (%) • G1 : Khối lƣợng cốc sấy mẫu thử trƣớc sấy • G2 : Khối lƣợng cốc sấy mẫu thử sau sấy • G : khối lƣợng cốc sấy Xác định hàm lƣợng tro nguyên liệu theo phƣơng pháp nung a Nguyên lý Dùng sức nóng (550-6000C) nung cháy hồn tồn chất hữu Phần cịn lại đem cân tính hàm lƣợng tro toàn phần thực phẩm b Dụng cụ, vật liệu thuốc thử - Chén nung sứ - Đèn cồn hay bếp điện - Lò nung điều chỉnh đƣợc nhiệt độ - Cân phân tích - Bình hút ẩm - H2O2 , HNO3 đậm đặc c Tiến hành - Nung chén sứ rửa lò nung tới nhiệt độ 550-6000C đến trọng lƣợng khơng đổi Lấy để nguội bình hút ẩm sau cân cân phân tích ghi lại số liệu - Cho vào chén 5g mẫu cần phân tích Cân tất cân phân tích sau cho tất vào lị nung tăng nhiệt độ từ từ 550-6000C Nung tro trắng nghĩa loại hết chất hữu cơ, thông thƣờng khoảng đến - Trƣờng hợp cịn tro đen, lấy để nguội sau cho thêm vài giọt H2O2 10 thể tích HNO3 đậm đặc nung lại thành tro trắng Để nguội bình hút ẩm cân cân phân tích Tiếp tục nung nhiệt độ 30 phút để nguội bình hút ẩm cân, lặp lặp lại thí nghiệm trọng lƣợng không đổi Kết hai lần cân nung liên tiếp sai khác không 0.0005g d Tính kết Hàm lƣợng tro theo phần trăm (X1) tính cơng thức: Trong đó: • G1 khối lƣợng chén nung mẫu (g) • G khối lƣợng chén nung (g) • G2 khối lƣợng chén nung tro trắng (g) Chú ý: Khi chén nung cịn nóng đựng bình hút ẩm nhớ để nắp lúc đầu mở vịi khơng khí nắp bình hút ẩm tránh khơng khí nở đẩy bật làm vỡ nắp bình Xác định hàm lƣợng đạm NH3 nguyên liệu theo phƣơng pháp lôi kéo nƣớc a Nguyên lý Đẩy muối amoni khỏi dung dịch chất kiềm mạnh ammoniac nhƣng không mạnh để tránh ảnh hƣởng đến thực phẩm Dùng nƣớc kéo ammoniac đƣợc giải phóng thể tự sang bình chứa H2SO4 tiêu chuẩn dƣ định lƣợng H2SO4 tiêu chuẩn dƣ NaOH tiêu chuẩn Phản ứng xảy ra: 2NH4Cl + Mg(OH)2 = 2NH3 + MgCl2 + 2H2O 2NH3 + H2SO4tiêu chuẩn = (NH4)2SO4 2NaOHtiêu chuẩn + H2SO4tiêu chuẩn dƣ = Na2SO4 + 2H2O b Tiến hành Bƣớc 1: sục rửa thiết bị,kiểm tra độ kín thiết bị Bƣớc 2: chuẩn bị cơc hứng: Lấy cốc thủy tinh 500ml cho vào 20ml H2SO4 0,1N vài giọt mêtyl đỏ 0,2% Đặt cốc hứng dƣới đầu ống sinh hàn,ống sinh hàn phải đặt ngập cốc hứng Bƣớc 3: Chƣng cất - Lấy 10ml mẫu chuẩn bị cho vào bình cảu thiết bị chƣng cất đạm thối, thêm vào vài giọt phenolphtalein 1%, cho từ từ dung dịch Mg(OH)2 bão hịa vào đến dung dịch bình có màu hồng Thêm 20ml nƣớc cất, khóa phễu, kiểm tra độ kín thiết bị,cho nƣớc chảy vào ống sinh hàn tiến hành chƣng cất - Chƣng cất khoảng 30 phút kể từ dung dịch bình bắt đầu sơi,tiến hành kiểm tra xem q trình chƣng cất kết thúc hay chƣa - Cách thử nhƣ sau: nâng đầu ống sinh hàn lên khổi cốc hứng ( cốc hứng đặt đầu ống sinh hàn) Dùng bình tia rửa xung quanh ống sinh hàn Nƣớc rửa tiếp tục đƣợc hứng vào cốc hứng Chƣng cất khoảng – phút,dùng giấy quỳ giấy đon PH để thử Nếu pH = trình chƣng cất kết thúc Nếu PH > tiếp tục chƣng cất Bƣớc 4: chuẩn độ Lấy cốc hứng đem chuẩn độ NaOH 0,1N dung dịch có màu vàng đọc thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn b Tính kết 0,0014: số gam nitơ tƣơng đƣơng với 1ml H2SO4 0,1N A : số ml H2SO4 0,1N dùng B : số ml NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ V : số ml đem thí nghiệm Xác định hàm lƣợng đạm formol nguyên liệu theo phƣơng pháp Sorensen a Nguyên lý Các axít amin dung dịch nƣớc trung bình khơng phải vị trí có nhóm chức axít (-COOH) amin (-NH2) trung hịa lẫn mà nhóm chức yếu,điện ly Khi gặp focmon,nhóm –NH2 kết hợp với focmon tạo thành nhóm metyleic (N=CH2) tính chất kiềm Do đó, tính chất axít nhóm (-COOH) bật lên Có thể định lƣợng đƣợc chất kiềm với thị phenolphtalein Nếu mẫu thử có mặt loại muối amoni Vd: NH4Cl gặp focmon làm cho dung dịch trở thành axít: 4NH4Cl + 6HCHO (CH2)6N4 + 6H2O + 4HCl b Tiến hành - Chuẩn bị cốc có màu pH = 9,2 - Chuẩn bị dung dịch focmon trung tính - Lấy 50ml dung dịch chuẩn bị cho vào bình định mức 250ml, thêm vào vài giọt phenolphthalein 1% 2g BaCl2, cho từ từ Ba(OH)2 bão hòa vào dung dịch có màu đỏ giống nhƣ màu có pH = 9,2 Thêm nƣớc cất cho đủ vạch,lắc để lắng 15 phút (nếu có kết tủa lọc bỏ kết tủa) - Dùng pipet lấy xác 20ml dung dịch lọc cho vào cốc thủy tinh 250ml sạch, đem trung hòa dung dịch HCl 0,1N dung dịch màu Thêm khoảng 10ml focmon trung tính, cho vào tủ lạnh 15 – 20 phút - Dùng dung dịch NaOH 0,1N để chuẩn độ dung dịch cốc có màu đỏ giống nhƣ màu dung dịch có pH = 9,2 Xác định thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn c Tính kết 0,0014: số gam nitơ tƣơng đƣơng với 1ml NaOH 0,1N A: số ml NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ F: hệ số pha loãng F = F1 x F2 = 25 x (250/50) = 125 V: số ml mẫu đem thí nghiệm Nitơ axít amin (Naa) đƣợc xác định theo công thức: Naa = NF – NNH3 (gN/lít) Xác định hàm lƣợng đạm tổng số nguyên liệu theo phƣơng pháp kjeldahl a Nguyên lý Vô vơ hóa mẫu thực phẩm H2SO4 đặm đặc có chất xúc tác đặc biệt,rồi dùng kiềm mạnh: NaOH đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 thể tự NH3 đƣợc hấp thụ H2SO4 tiêu chuẩn Sau định lƣợng H2SO4 tiêu chuẩn dƣ NaOH tiêu chuẩn Các phản ứng xảy ra: 2NaOH + (NH4)2SO4 = NaSO4 + 2NH3 + 2H2O 2NH3 + H2SO4 tiêu chuẩn = (NH4)2SO4 2NaOHtiêu chuẩn +H2SO4 tiêu chuẩn dƣ = Na2SO4 + 2H2O b Tiến hành Bƣớc 1: Vơ hóa mẫu Lấy xác 10ml mẫu pha loãng trên, cho cẩn thận vào đáy bình Kjeldahl, thêm 2g hỗn hợp xúc tác CuSO4 K2SO4 + 10ml H2SO4 đậm đặc Đặt nghiêng bình Kjeldahl góc 450 bếp điện tủ Host tiến hành vô cơ,trong vô màu sắc chuyển tử màu nâu đen → vàng → xanh → xanh không màu đƣợc,sau vô xong, để nguội mẫu Chú ý: - Trong q trình vơ mẫu chƣa đạt đến màu xanh mà dung dịch bị cạn lấy bình để nguội thêm 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc tiếp tục vô - Khi vô hóa mẫu,tránh tƣơng mẫu sơi q mạnh bị bắn ngồi gây sai số,vơ triệt để hồn tồn - Trong vơ hóa mẫu tiến hành rửa thiết bị chƣng cất đạm,kiểm tra độ kín Yêu cầu thiết bị phải kín Bƣớc 2: Sục rửa thiết bị,kiểm tra độ kín thiết bị Bƣớc 3: Chuẩn bị cốc hứng Lấy cốc thủy tinh 250ml cho vào cốc 20ml H2SO4 0,1N vài giọt metyl đỏ 0,2% Đặt cốc dƣới đầu ống sinh hàn thiết bị chƣng cất đậm Đầu ống sinh hàn phải ngập vào dung dịch cốc Bƣớc 4: Chƣng cất Sau vơ hóa mẫu xong để nguội đổ từ từ dung dịch bình Kjeldahl vào bình chƣng cất tráng tráng lại bình vài lần,nƣớc tráng chuyển vào bình chƣng cất,cho vài giọt phenolphthalein 1% vào bình chƣng cất Thêm từ từ dung dịch NaOH 30% vào bình chƣng cất dung dịch bình có màu đỏ tím đỏ đƣợc Dùng nƣớc cất tráng đƣờng ống dẫn vào bình chƣng cất Lắp kín thiết bị,cho nƣớc chảy vào ống sinh hàn bắt đầu chƣng cất,chƣng cất khoảng 20 phút kể từ dung dịch bình bắt đầu sơi, sau tiến hành thử để xác định xem mẫu thử hết đạm chƣa Cách thử nhƣ sau: nâng đầu ống sinh hàn lên khỏi cốc hứng (cốc hứng đặt đầu ống sinh hàn) Dùng bình tia rửa xung quanh ống sinh hàn Nƣớc rửa tiếp tục đƣợc hứng vào cốc hứng Chƣng cất khoảng 1-2 phút,dùng giấy giấy đo pH Nếu pH=7 trình chƣng cất kết thúc Nếu pH >7 tiếp tục chƣng cất Bƣớc 5:chuẩn độ Lấy cốc hứng đem chuẩn độ NaOH 0,1N có màu vàng dừng lại Đọc thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn c Tính kết Đạm tổng số mẫu đƣợc tính cơng thức sau: 0,0014: số gam N tƣơng đƣơng với 1ml H2SO4 0,1N A : số ml H2SO4 0,1N dùng B: số ml NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ F : hệ số pha loãng V : số ml mẫu đem làm thí nghiệm 1000: hệ số quy ... ) enzyme để tạo dịch thủy phân protein ứng dụng sản xuất nƣớc mắm? ?? Mục tiêu nghiên cứu Xác định chế độ tối ƣu cho q trình thủy phân đầu tơm thẻ chân trắng enzyme để sản xuất dịch thủy phân protein. .. phân đầu tơm thẻ chân trắng để thu hồi dịch thủy phân protein  Tối ƣu chế độ thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng enzyme chọn  Sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng theo thông... VĂN Nghiên cứu xác định chế độ thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng ( Litopenaeus vannamei) enzyme để tạo dịch thủy phân protein ứng dụng sản xuất nƣớc mắm Giới thiệu đề tài mục tiêu nghiên cứu Việt