Thiết kế tối ưu gen để biểu hiện dị loài sử dụng hệ thống thương mại bằng một số phần mềm tối ưu miễn phí

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trƣờng Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 13, Số (2018) THIẾT KẾ TỐI ƢU GEN ĐỂ BIỂU HIỆN DỊ LOÀI SỬ DỤNG HỆ THỐNG THƢƠNG MẠI BẰNG MỘT SỐ PHẦN MỀM TỐI ƢU MIỄN PHÍ Hà Thúc Đức Tùng, Đồn Trọng Bích, Nguyễn Ngọc Lƣơng* Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế *Email: daigoro77@gmail.com Ngày nhận bài: 21/12/2018; ngày hoàn thành phản biện: 21/12/2018; ngày duyệt đăng: 21/12/2018 TÓM TẮT Tối ƣu gen để biểu khác lồi bƣớc quan trọng cơng nghệ DNA tái tổ Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu tiêu chí cần đạt đƣợc q trình tối ƣu gen Một số tiêu chí phổ quát gồm thiên vị mã ba, thiên vị cặp mã ba tối ƣu cấu trúc thứ cấp mRNA Để đồng thời đ{p ứng nhiều tiêu chí tối ƣu, c{c nh| Tin sinh học phát triển phần mềm tối ƣu gen nhằm tự động hóa qu{ trình n|y Tuy nhiên để có đƣợc gen theo ý muốn, cần có can thiệp ngƣời Ở đ}y điểm qua số phần mềm tối ƣu gen phổ biến miễn phí cho mục đích tối ƣu biểu gen số vật chủ phổ biến Chúng tơi mơ tả quy trình sử dụng phần mềm số kinh nghiệm rút trình sử dụng phần mềm tối ƣu gen để biểu số protein có nhiều ứng dụng Y dƣợc học Escherichia coli nấm men Từ khóa: Tối ƣu gen, biểu dị lồi, E coli, nấm men, tiêu chí tối ƣu MỞ ĐẦU Biểu gen dị lo|i, gen đƣợc lấy từ lo|i n|y đƣợc đem biểu sinh vật thƣờng dùng làm vật chủ, ví dụ Escherichia coli (E coli), nấm men bánh mì Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae), tế bào thực vật tế b|o động vật, đặt móng cho ngành cơng nghiệp cơng nghệ sinh học có trị gi{ h|ng trăm tỉ USD [1], [2], [3] Gen biểu dị loài chịu điều hòa biểu gen vật chủ, tức gồm bƣớc điều hòa ngoại di truyền (epigenetics), điều hịa phiên mã, điều hịa hậu phiên mã thơng qua miRNA v| điều hòa sau dịch mã [4], [5] Trong thực tế, ngƣời dùng kiểm sốt q trình dịch mã gen quan tâm yếu tố điều hòa ngoại di truyền, điều hòa phiên mã hậu dịch mã đƣợc tối ƣu hóa thông qua c{c hệ thống biểu thƣơng mại (vector tế bào vật chủ thƣơng mại) [1] 135 Thiết kế tối ưu gen để biểu dị loài sử dụng hệ thống thương mại số phần mềm tối ưu miễn phí Hai phƣơng ph{p phổ biến để thu nhận gen cần biểu tạo dòng gen từ nguồn tự nhiên tổng hợp gen Tạo dòng gen từ nguồn tự nhiên sử dụng kỹ thuật tạo dòng phổ biến nhƣ PCR, kết hợp kỹ thuật tạo dòng phức tạp nhƣ PCR mồi thối hóa, sàng lọc thƣ viện hệ gen thƣ viện cDNA để thu nhận gen quan tâm Kỹ thuật n|y thƣờng kèm số khó khăn nhƣ khó thu nhận nguồn sinh vật hiến (ví dụ sinh vật hiến virus gây bệnh) phải biết trƣớc trình tự DNA gen cần tạo dòng Đặc biệt việc sử dụng gen tự nhiên để biểu dị lo|i thƣờng không đảm bảo mức độ biểu tốt để thƣơng mại hóa sản phẩm *6+, *7+ Phƣơng pháp tối ƣu v| tổng hợp gen ng|y đƣợc đón nhận áp dụng rộng rãi số ƣu việt nhƣ dễ thu nhận từ trình tự c{c sở liệu sinh học, tính ổn định cao biểu giá thành tổng hợp giảm mạnh thời gian qua [1], [3] Tối ƣu gen để biểu dị lo|i đạt đƣợc số khám phá quan trọng, giúp nhà khoa học thiết kế tối ƣu gen với kết biểu ổn định dễ dự đo{n Trong thời kỳ đầu tối ƣu gen đƣợc hiểu đơn giản thay mã ba đồng nghĩa gen cần biểu mã ba phổ biến vật chủ biểu Tuy nhiên cách tiếp cận đơn giản n|y thƣờng cho kết không ổn định tất mã ba gen ba phổ biến, tRNA nhanh chóng bị cạn kiệt dẫn đến tốc độ tăng trƣởng bị ảnh hƣởng Bằng c{ch “bắt chƣớc” c{c gen biểu mạnh vật chủ, gen cần biểu đƣợc tối ƣu cho mã ba đƣợc phân bố theo số đặc trƣng nội gen vật chủ Cách tiếp cận không đảm bảo gen cần tổng hợp đƣợc dịch mã tốt mà yếu tố ảnh hƣởng đến mức độ dịch mã kh{c nhƣ độ bền mRNA, trình tự lặp, mã kết thúc ẩn đƣợc tối ƣu hóa *6+ Chuỗi polypeptide tổng hợp tRNA 3’ 5’ mRNA Ribosom e Hình Tại thời điểm ln có hai phân tử tRNA gắn với tiểu phần lớn ribosome vị trí P A Hai phân tử tRNA phải tƣơng thích cấu trúc để q trình dịch mã khơng bị gi{n đạn 136 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trƣờng Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 13, Số (2018) Tại thời điểm số tiêu chí quan trọng thiết kế tối ƣu gen để tổng hợp dị loại đƣợc xác lập Tiêu chí quan trọng tối ƣu mã ba cho số mã ba bị thay để trình dịch mã gen tối ƣu, nhƣng không ảnh hƣởng đến tốc độ tăng trƣởng Tiêu chí n|y đƣợc đ{nh gi{ nhiều phƣơng ph{p kh{c nhƣng phổ biến số thích ứng mã ba (Codon Adaptation Index, viết tắt CAI) [1], [2], [3], [6] Một tiêu chí khơng phần quan trọng hài hịa cặp mã ba nằm cạnh Điều kiện xuất phát từ thực tế thời điểm n|o bƣớc kéo dài trình dịch mã, ribosome ln ln gắn với hai mã ba [1], [3], [8] (xem Hình 1) Tiêu chí thứ ba cấu trúc thứ cấp mRNA, đƣợc phân thành hai tiêu chí phụ gồm cấu trúc thứ cấp tổng thể mRNA cấu trúc thứ cấp mRNA vùng 5’ không dịch mã (UTR 5’) mRNA phải có cấu trúc thứ cấp đủ bền để đảm bảo không dễ dàng bị exonuclease phân hủy, nhƣng phải có đầu 5’ có cấu trúc thứ cấp yếu để tạo điều kiện cho ribosome gắn v|o, đặc biệt sinh vật nhân chuẩn [1], [3], [9], [10], [11] Thực tế, có thí nghiệm đẹp cho thấy cấu trúc thứ cấp mRNA vùng 5’ qu{ chặt, gen hầu nhƣ không đƣợc dịch mã cho dù có nhiều mRNA [12] (xem Hình 2) Ba tiêu chí trở thành tiêu chí quan trọng thiết kế gen để biểu dị lồi Ngồi tiêu chí quan trọng nói số tiêu chí kh{c thƣờng đƣợc đƣa v|o qu{ trình tối ƣu gen nhƣ tỉ lệ GC gen [13], trình tự làm suy yếu mRNA [14], [15], mã kết thúc ẩn vị trí cắt hạn chế không mong muốn [1] Cấu Cấu Băng protein biểu Cấu Cấu Hình Cấu trúc thứ cấp mRNA vùng 5’ không dịch mã ảnh hƣởng lớn đến hiệu dịch mã, qua ảnh hƣởng đến mức độ biểu Mã mở đầu đƣợc biểu diễn hộp màu xanh lục hình Hiệu dịch mã lớn khơng có cấu trúc thứ cấp vùng UTR 5’ (cấu trúc 3) Ở cấu trúc 1, vị trí để ribosome gắn vào mRNA ngắn nên hiệu dịch mã giảm Ở cấu trúc 2, ribosome gắn v|o mRNA nhƣng diện cấu trúc bậc vùng chứa mã mở đầu khiến hiệu dịch mã so với cấu trúc Ở cấu trúc 4, cấu 137 Thiết kế tối ưu gen để biểu dị loài sử dụng hệ thống thương mại số phần mềm tối ưu miễn phí trúc thứ cấp có lƣợng q lớn, ribosome tiếp cận mã mở đầu dẫn đến protein khơng đƣợc tổng hợp (Kozak, 1989) Tuy có đồng thuận tiêu chí quan trọng thiết kế tối ƣu gen để biểu dị loài mức đại thể, số chi tiết c{c tiêu chí n|y đƣợc chứng minh đóng vai trị quan trọng hiệu dịch mã Mark Welch cs phát số mã mã mã hóa cho số axit amin, cụ thể serine (mã hóa AGC), threonine (ACG) leucine (AAG) ảnh hƣởng lớn đến mức độ dịch mã Những mã ba n|y giúp tăng hiệu dịch mã c{c tRNA mang axit amin tƣơng ứng với mã ba đƣợc nạp axit amin nhanh c{c tRNA mang mã ba đồng nghĩa cho dù chúng phong phú Điều n|y đặc biệt với biểu gen E coli mức độ phiên mã E coli mạnh [16] Thomas E Gorochowski cs nghiên cứu kỹ cấu trúc mRNA gen tự nhiên phong phú tRNA có khả nạp nhanh cho thấy có áp lực chọn lọc để hai yếu tố bù trừ để trình dịch mã diễn thuận lợi cho tất gen Nghiên cứu n|y cho thấy cần có tiêu chí cụ thể q trình thiết kế tối ƣu gen *17+ Để thiết kế tối ƣu gen thỏa mãn đồng thời tiêu chí nói nhiệm vụ bất khả thi thực tay Vì có nhiều phần mềm đƣợc xây dựng để hỗ trợ cho ngƣời dùng thiết kế tối ƣu gen Một số phần mềm phổ biến gồm DNAworks, Jcat, Synthetic gene designer, GeneDesign, OPTIMZER, Visual Gene Developer, Eugene, COOL, D-Tailor Costar Các phần mềm n|y cho phép ngƣời dùng tùy biến tiêu chí phổ biến nói trên, ƣu tiên số tiêu chí so với tiêu chí cịn lại tùy theo kinh nghiệm v| quan điểm riêng Tất phần mềm n|y miễn phí chạy tảng Windows/OS trực tiếp chạy web [1], [3] Tuy thiết kế tối ƣu gen đƣợc ứng dụng rộng rãi công nghiệp Cơng nghệ sinh học, quy mơ phịng thí nghiệm, đặc biệt Việt Nam, trình biểu gen dị loài đƣợc thực theo phƣơng ph{p tạo dịng biểu gen tự nhiên Chính nghiên cứu mô tả số thí nghiệm tối ƣu gen v| phƣơng ph{p để có đƣợc gen tối ƣu tổng hợp với giá thành rẻ để tiến hành thí nghiệm Ba gen đƣợc chọn cho nghiên cứu gen mã hóa miền III protein vỏ virus Dengue tuýp (EDIII) gây bệnh sốt xuất huyết [18], gen mã hóa kháng nguyên vỏ virus Coxsackievirus A16 gây bệnh chân tay miêng trẻ em (Polyprotein) [19], v| gen mã hóa protein độc tố nhạy nhiệt E coli (LTB) gây bệnh tiêu chảy ngƣời [20] EDIII đƣợc tối ƣu để biểu E coli, LTB Polyprotein đƣợc tối ƣu để biểu nấm men Pichia pastoris Saccharomyces cerevisiae Ở đ}y bàn số ƣu v| nhƣợc điểm phần mềm chọn để tối ƣu c{c gen n|y, đ}y cụ thể Visual Gene Developer COOL 138 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trƣờng Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 13, Số (2018) PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Trình tự DNA protein c{c gen nói đƣợc thu nhận từ sở liệu (CSDL) Genbank Genpept NCBI thơng qua tìm kiếm từ khóa Entrez Trƣờng hợp gen virus, thấy có biến dị lớn trình tự chủng kh{c nhau, cần phải chọn trình tự đại diện cách tìm kiếm tất trình tự polypeptide protein cần tìm kiếm CSDL, tiến hành gióng cột nhiều trình tự để tìm trình tự đại diện (consensus) 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Thu nhận trình tự Để tìm kiếm trình tự EDIII, Polyprotein v| LTB, trƣớc tiên ta tìm kiếm trình tự protein CSDL genpept từ khóa liên quan Ví dụ để tìm kiếm trình tự polypeptide EDIII virus Dengue tuýp ta đ{nh c}u lệnh: Dengue virus 1[organism] AND Envelope protein AND 495[sequence length] Theo câu lệnh tìm kiếm kết trả lại trình tự protein envelope virus Dengue tuýp có chiều dài xác 495 axit amin, chiều d|i đầy đủ protein n|y Tƣơng tự ta tìm kiếm trình tự polyprotein Coxsackievirus A16 câu lệnh: Coxsackievirus A16[organism] AND polyprotein AND 2193[sequence length] Sau ta tải tất trình tự tìm thấy gióng cột phần mềm gióng cột nhiều trình tự phổ biến nhƣ MEGA *21+ phần mềm gióng cột mạng có khả xử lý liệu lớn Kết gióng đƣợc dùng làm liệu đầu vào cho phần mềm Weblogo *22+ để tạo trình tự đại diện Trình tự đại diện đƣợc dùng để tìm kiếm BLAST xem liệu có trình tự polypeptide giống nhƣ hay khơng tự nhiên Tiếp đến trình tự DNA mã hóa cho protein đƣợc thu nhận để dùng l|m đối chứng (gen tự nhiên) 2.2.2 Tối ƣu trình tự Để tối ƣu EDIII biểu E coli, vận dụng kết Mark Welch cs làm tiêu chí tối ƣu chính, có nghĩa l| ràng buộc cho mã ba mã hóa serine, threonine leucine lần lƣợt AGC, ACG, AAG Để l|m điều sử dụng phần mềm Visual Gene Developer *23+ v| thay đổi tỉ lệ mã ba đồng nghĩa cho serine, threonine leucine, mã ba AGC, ACG AAG chiếm tỉ lệ cao tất mã ba đồng nghĩa lại chiếm tỉ lệ thấp nhƣ 139 Thiết kế tối ưu gen để biểu dị loài sử dụng hệ thống thương mại số phần mềm tối ưu miễn phí Để tối ƣu EDIII v| polyprotein Coxsackievirus A16 sử dụng phần mềm COOL [24] Tuy nhiên trình dịch mã gen biểu cao khác với trình dịch mã gen biểu bình thƣờng thấp, khơng thể dùng liệu chứa gen biểu thấp vật chủ cần biểu mà nên chọn gen biểu cao Để xác định gen biểu cao số lồi, chúng tơi sử dụng sở liệu độ phong phú protein sinh giới (PaxDb) để x{c định c{c protein có h|m lƣợng cao E coli nấm men, v| sau sử dụng gen biểu cao n|y l|m mơ hình để phần mềm tái thiết kế gen quan tâm [25] Do polyprotein tự phân cắt thành 3CD enzyme proteinase xử lý P1 thành protein VP1, VP2, VP3 VP4, tiến hành tối ƣu protein n|y dƣới dạng hai protein riêng rẽ 3CD P1 Các phần mềm thƣờng cho số trình tự ứng viên để ngƣời dùng lựa chọn Trong trƣờng hợp chọn ngẫu nhiên ba trình tự (ví dụ trƣờng hợp EDIII) chọn trình tự có tiêu chí n|o c{c tiêu chí đƣợc quan t}m (ví dụ có sổ thích ứng cặp mã ba cao), đồng thời đảm bảo số tiêu chí khác nằm khoảng chấp nhận đƣợc Các trình tự tối ƣu đƣợc chọn đƣợc gửi tổng hợp công ty Phusa Biochem (http://www.phusabiochem.com/vi/.html) dƣới dạng geneblock, với giá thành khoảng 1,4 triệu cho gen d|i dƣới 500 bp Đối với gen dài 500 bp, chúng đƣợc tổng hợp dƣới dạng trình tự geneblock dƣới 500 bp v| sau nối lại với phản ứng overlap extension PCR Để tạo trình tự geneblock này, phần mềm DNAworks 2.0 đƣợc sử dụng [26] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ƣu gen EDIII virus Dengue tuýp Dựa cách làm mô tả phần PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU thu nhận đƣợc 200 gen tối ƣu mã hóa cho EDIII Do phần mềm Visual Gene Developer thiếu chức tính số thích hợp cặp mã ba, chúng tơi buộc phải sử dụng phần mềm Anaconda 2.0 để tính to{n độ thích nghi cặp mã ba gen tối ƣu *27+ So s{nh độ thích nghi cặp mã ba gen tối ƣu n|y với số gen tự nhiên có mức độ biểu mạnh E coli giúp chọn 18 trình tự để sử dụng cho thí nghiệm tổng hợp gen gen đƣợc chọn ngẫu nhiên cho thí nghiệm đƣợc trình bày đ}y dƣới dạng kết gióng cột trình tự, số CAI, lƣợng gập cuộn cấu trúc bậc hai mRNA sổ thích nghi cặp mã ba Dựa kết n|y, gen đƣợc chọn có CAI thấp gen tự nhiên (0.72) nhƣng c{c số kh{c tốt Theo nhiều nghiên cứu CAI khơng cịn số đ{ng tin 140 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trƣờng Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 13, Số (2018) cậy để dự đo{n mức độ biểu *3+ giả định mức độ biểu c{c gen đƣợc chọn xấp xỉ gen tự nhiên Bảng Gen mã hóa EDIII virus Dengue tuýp đƣợc tối ƣu để biểu E coli Tên trình tự Dengue Dengue Dengue Hàm lƣợng GC3 50,5 45,4 47,4 CAI Chỉ số thích nghi cặp mã ba 0,69 0,69 0,67 -0,12086 -0,12042 -0,11857 Năng lƣợng cấu trúc bậc hai mRNA -77,5 -81,4 -83,5 Hình Các trình tự EDIII virus Dengue tuýp tối ƣu để biểu E coli Kết gióng cột đƣợc thực phần mềm ClustalX Để ràng buộc điều kiện gen tối ƣu phải có mã ba định cho số axit amin (serine mã hóa AGC, threonine mã hóa ACG leucine mã hóa AAG), thay đổi tần số mã ba mã hóa cho axit amin cho AGC, ACG AAG có tần số cao có Tần số n|y đƣợc tính cách tìm tần số thấp nhóm mã ba đồng nghĩa bảng mã chuẩn E coli (ở đ}y l| AGG mã hóa cho Arg, tần số 0.02), sau {p dụng tần số cho tất mã ba đồng nghĩa cịn lại Ví dụ Thr, bốn mã ba đồng nghĩa l| ACC (0,440) ACG (0.270), ACA (0,130), ACT (0,160) Bằng cách ràng buộc điều kiện ACG mã hóa cho Thr có thể, ba mã ba ACC, ACA ACT đƣợc gán tần số thấp 0,02 tần số ACG mã hóa cho Thr – 3x0,02 = 0,94 Tƣơng tự nhƣ tần số AGC mã hóa cho serine – 5x0,02 = 0,9 tần số AAG mã hóa cho leucine – 5x0,02 = 0,9 Bằng cách gán tần số nhƣ ta đảm bảo AGC, ACG AAG xuất nhiều trình tự gen tối ƣu, nhƣng bị ràng buộc theo tiêu chí kh{c nhƣ độ thích nghi cặp mã ba, tỉ lệ GC v| lƣợng gập cuộn mRNA 3.2 Tối ƣu gen LTB E coli Trình tự LTB đƣợc nhập vào phầm mềm COOL tối ƣu cách tối ƣu số CAI, tối ƣu độ thích nghi cặp ba tối ƣu tỉ lệ GC Tại thời điểm chúng tơi tối ƣu trình tự LTB phần mềm COOL chƣa có tính tối ƣu cấu trúc thứ cấp mRNA nên sử dụng phần mềm Visual Gene Developer để tính to{n lƣợng gập cuộn cấu trúc thứ cấp mRNA để chọn gen tối ƣu Kết chọn 141 Thiết kế tối ưu gen để biểu dị loài sử dụng hệ thống thương mại số phần mềm tối ưu miễn phí gen để tối ƣu Trình tự gen n|y đƣợc cung cấp phần phụ Kết tìm kiếm gen CSDL mRNA S cerevisiae đƣợc chọn tiêu chí phụ để chọn gen từ tập hợp c{c gen đƣợc tối ƣu, v| kết n|y đƣợc trình bày Hình 3.3 Tối ƣu gen CD3 P1 Coxsackievirus A16 Để tối ƣu c{c gen n|y chọn 14 gen mã hóa cho c{c protein có độ phong phú cao chủng nấm men Pichia pastoris (tên Komagataella phaffii GS115) dựa thơng tin tìm thấy CSDL PaxDb [25] danh mục protein Pichia pastoris theo thứ tự h|m lƣợng cao đến thấp [28] (Bảng 2) C{c gen n|y đƣợc gióng cột để tìm trình tự Kozak (Hình 5) v| dùng để làm gen mơ hình để phần mềm mơ theo q trình tối ƣu gen Kết chúng tơi chọn đƣợc gen 3CD gen P1 để tổng hợp cho thí nghiệm Các trình tự n|y đƣợc cung cấp phần phụ lục Do gen lớn (1961 bp 3CD v| 2609 bp P1), chúng đƣợc chia nhỏ th|nh c{c gen có kích thƣớc khoảng 350 bp để đặt hàng tổng hợp dƣới dạng geneblock Trình tự c{c gen n|y đƣợc trình bày phần phụ lục Hình Kết BLAST gen LTB tối ƣu CSDL mRNA S cerevisiae Gen có nhiều vùng giống với trình tự CSDL RNA S cerevisiae đƣợc kiểm tra mắt chọn để tổng hợp Hình Trình tự Kozak gen mã hóa protein nấm men P pastoris xây dựng từ gen tự nhiên có mức độ biểu cao P pastoris phần mềm Weblogo 142 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trƣờng Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 13, Số (2018) KẾT LUẬN Tối ƣu v| tổng hợp gen để biểu dị lo|i l| xu hƣớng chủ đạo công nghệ DNA tái tổ hợp Hiện tiêu chí tối ƣu v| diện nhiều phần mềm miễn phí có khả tối ƣu gen theo c{c tiêu chí ngƣời dùng để biểu nhiều vật chủ phổ biến Tối ƣu gen đƣợc chứng minh giúp cải thiện kết biểu hiện, đồng thời tối ƣu gen cho phép thu nhận gen có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh Bảng Danh s{ch c{c gen đƣợc dùng để tối ƣu 3CD v| P1 Coxsackievirus A16 [28] Xếp hạng độ phong phú Mã truy cập 10 11 12 254568470 254567507 254570367 254568544 254573764 254566601 254566257 254567798 254570575 254571387 254571425 254568572 13 254571679 14 254569858 Tên protein Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, isozyme Nh}n tố kéo d|i phiên mã EF-1 alpha Enolase I Alcohol dehydrogenase isozyme III ti thể ATPase tham gia gập cuộn protein v| vận chuyển nh}n 3-phosphoglycerate kinase Protein sốc nhiệt Hsp90 Protein giả định Pyruvate decarboxylase số c{c isozyme Tiểu phần alpha ATP synthase F1F0 ti thể Th|nh phần protein tiểu phần nhỏ ribosome Protein dung hợp, giống hệt với Rpl40Bp Protein dung hợp đƣợc cắt th|nh protein th|nh phần tiểu phần nhỏ ribosome v| ubiquitin Tiểu phần beta ATP synthase F1F0 ti thể Trong nghiên cứu chúng tơi trình bày số kết tối ƣu số gen kháng nguyên từ virus (Dengue tuýp 1, Coxsackievirus A16 E coli) hai phần mềm tối ƣu gen phổ biến Visual Gene Developer COOL Do phần mềm cho nhiều gen tối ƣu ứng viên, việc lựa chọn số gen để kiểm tra địi hỏi ngƣời dùng phải có số kinh nghiệm tri thức riêng Ở đ}y chúng tơi trình b|y số kinh nghiệm nhƣ việc lựa chọn số gen vi sinh vật tối ƣu Các tiêu chí lựa chọn gồm: mức độ giống với gen tự nhiên toàn chiều dài, chọn ngẫu nhiên ba gen để kiểm tra, trƣờng hợp bất khả kháng (khi chiều dài gen lớn dẫn đến giá thành tổng hợp gen q lớn) chọn gen có thơng số tốt LỜI CÁM ƠN Nghiên cứu n|y đƣợc thực dƣới tài trợ Đề t|i ĐHH mã số DHH2016-01-87 Tác giả tun bố khơng có mẫu thuẫn quyền lợi 143 Thiết kế tối ưu gen để biểu dị loài sử dụng hệ thống thương mại số phần mềm tối ưu miễn phí TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Gould N., Hendy O., Papamichail D (2014) Computational Tools and Algorithms for Designing Customized Synthetic Genes Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, [2] Parret A.H., Besir H., Meijers R (2016) Critical reflections on synthetic gene design for recombinant protein expression Current Opinion in Structural Biology, 38, 155–162 [3] Webster G.R., Teh A.Y.-H., Ma J.K.-C (2017) Synthetic gene design-The rationale for codon optimization and implications for molecular pharming in plants: Synthetic Gene Design Biotechnology and Bioengineering, 114(3), 492–502 [4] Lodish H.F., Berk A., A Kaiser C cộng (2013) Transcriptional control of gene expression Molecular Cell Biology 7th, W H Freeman, 279–388 [5] Lodish H.F., Berk A., A Kaiser C cộng (2013) Post-transcriptional Gene Control Molecular Cell Biology 7th, W H Freeman, 345–391 [6] Elena C., Ravasi P., Castelli M.E cộng (2014) Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives Frontiers in Microbiology, [7] Gustafsson C., Minshull J., Govindarajan S cộng (2012) Engineering genes for predictable protein expression Protein Expression and Purification, 83(1), 37–46 [8] Papamichail D., Liu H., Machado V cộng (2018) Codon Context Optimization in Synthetic Gene Design IEEE/ACM Transactions on Computational Biology and Bioinformatics, 15(2), 452–459 [9] Bai C., Wang X., Zhang J cộng (2014) Optimisation of the mRNA secondary structure to improve the expression of interleukin-24 (IL-24) in Escherichia coli Biotechnology Letters, 36(8), 1711–1716 [10] Griswold K.E., Mahmood N.A., Iverson B.L cộng (2003) Effects of codon usage versus putative 5′-mRNA structure on the expression of Fusarium solani cutinase in the Escherichia coli cytoplasm Protein Expression and Purification, 27(1), 134–142 [11] Gaspar P., Moura G., Santos M.A.S cộng (2013) mRNA secondary structure optimization using a correlated stem–loop prediction Nucleic Acids Research, 41(6), e73– e73 [12] Kozak M (1989) Circumstances and mechanisms of inhibition of translation by secondary structure in eucaryotic mRNAs Molecular and Cellular Biology, 9(11), 5134– 5142 [13] Kudla G., Lipinski L., Caffin F cộng (2006) High Guanine and Cytosine Content Increases mRNA Levels in Mammalian Cells PLoS Biology, 4(6), e180 [14] Brown C.Y., Lagnado C.A., Goodall G.J (1996) A cytokine mRNA-destabilizing element that is structurally and functionally distinct from A+U-rich elements Proceedings of the National Academy of Sciences, 93(24), 13721–13725 [15] Putland R.A., Sassinis T.A., Harvey J.S cộng (2002) RNA Destabilization by the Granulocyte Colony-Stimulating Factor Stem-Loop Destabilizing Element Involves a 144 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trƣờng Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 13, Số (2018) Single Stem-Loop That Promotes Deadenylation Molecular and Cellular Biology, 22(6), 1664–1673 [16] Welch M., Govindarajan S., Ness J.E cộng (2009) Design Parameters to Control Synthetic Gene Expression in Escherichia coli PLoS ONE, 4(9), e7002 [17] Gorochowski T.E., Ignatova Z., Bovenberg R.A.L cộng (2015) Trade-offs between tRNA abundance and mRNA secondary structure support smoothing of translation elongation rate Nucleic Acids Research, 43(6), 3022–3032 [18] Chen Y., Maguire T., Hileman R.E cộng (1997) Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulfate Nature Medicine, 3(8), 866–871 [19] Gong M., Zhu H., Zhou J cộng (2014) Cryo-Electron Microscopy Study of Insect Cell-Expressed Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16 Virus-Like Particles Provides a Structural Basis for Vaccine Development Journal of Virology, 88(11), 6444–6452 [20] Sixma T.K., Pronk S.E., Kalk K.H cộng (1991) Crystal structure of a cholera toxinrelated heat-labile enterotoxin from E coli Nature, 351(6325), 371–377 [21] Kumar S., Stecher G., Tamura K (2016) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets Molecular Biology and Evolution, 33(7), 1870–1874 [22] Crooks G.E (2004) WebLogo: A Sequence Logo Generator Genome Research, 14(6), 1188– 1190 [23] Jung S.-K McDonald K (2011) Visual gene developer: a fully programmable bioinformatics software for synthetic gene optimization BMC Bioinformatics, 12(1), 340 [24] Chin J.X., Chung B.K.-S., Lee D.-Y (2014) Codon Optimization OnLine (COOL): a web-based multi-objective optimization platform for synthetic gene design Bioinformatics, 30(15), 2210–2212 [25] Wang M., Weiss M., Simonovic M cộng (2012) PaxDb, a Database of Protein Abundance Averages Across All Three Domains of Life Molecular & Cellular Proteomics, 11(8), 492–500 [26] Hoover D.M (2002) DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis Nucleic Acids Research, 30(10), 43e – 43 [27] Moura G., Pinheiro M., Arrais J cộng (2007) Large Scale Comparative Codon-Pair Context Analysis Unveils General Rules that Fine-Tune Evolution of mRNA Primary Structure PLoS ONE, 2(9), e847 [28] Renuse S., Madugundu A.K., Kumar P cộng (2014) Proteomic analysis and genome annotation of Pichia pastoris, a recombinant protein expression host PROTEOMICS, 14(23–24), 2769–2779 145 Thiết kế tối ưu gen để biểu dị loài sử dụng hệ thống thương mại số phần mềm tối ưu miễn phí GENE REDESIGN FOR HETEROLOGOUS EXPRESSION IN COMMERCIAL SYSTEMS USING FREE GENE OPTIMIZATION PROGRAMS Ha Thuc Duc Tung, Doan Trong Bich, Nguyen Ngoc Luong* Faculty of Biology, University of Sciences, Hue University * Email: daigoro77@gmail.com ABSTRACT Gene optimization for heterologous expression is the foundation in modern recombinant DNA technology for biopharmaceutical productions Several studies have examined and established opitimization criteria The most popular criteria include codon bias, codon context bias and mRNA secondary structure To simultaneously optimize several criteria, software has been developed to automate this process However, to obtain genes for subsequent work, human intervention is necessary, particularly in selecting a few among several candidates, based on users’ experience, insights or own criteria In this study, we overviewd some free gene optimization programs for gene optimization We described in details procedures for using these programs and our own experience in using these programs to optimize some proteins that have applications in biopharmaceutical biotechnology industries, particularly in common expression hosts such as Escherichia coli and yeasts Keywords: E coli, Gene optimization, heterologous expression,, criteria, yeasts 146 optimization TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trƣờng Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 13, Số (2018) Hà Thúc Đức Tùng sinh ngày 26/05/1993 Thừa Thiên Huế Hiện ông sinh viên ngành Công nghệ Sinh học Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế Đồn Trọng Bích sinh ngày 24/02/1992 Thừa Thiên Huế Năm 2015, ông tốt nghiệp kỹ sƣ ng|nh Công nghệ Sinh học Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế Hiện ông nhân viên kiểm định chất lƣợng Công ty Carlsberg Việt Nam, chi nhánh nhà máy bia Huda Thừa Thiên Huế Nguyễn Ngọc Lƣơng sinh ngày 28/03/1977 H| Tĩnh Năm 2002 ông tốt nghiệp đại học ngành Giải phẫu ngƣời Đại học Melbourne, năm 2007 tốt nghiệp Thạc sĩ ng|nh Sinh học Đại học Huế năm 2014 tốt nghiệp Tiến sĩ Đại học Quốc gia Chonbuk Hiện ông giảng viên Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế Lĩnh vực nghiên cứu: biểu gen dị loài 147 Thiết kế tối ưu gen để biểu dị loài sử dụng hệ thống thương mại số phần mềm tối ưu miễn phí PHỤ CHÚ Trình tự CD3 tối ƣu: CCAAAATGGCTGGACCATCACTTGACTTTGCACTTTCACTTCTTCGTCGAAACATTCGTCAAGTCCAAACGGACCAGG GTCACTTCACCATGTTGGGTGTCCGGGACAGGCTTGCTATTCTCCCAAGACACTCCCAACCAGGCAAAACCATTTGGG TGGAGCACAAGCTCATCAACGTTCTGGATGCCGTCGAGCTGGTGGACGAACAAGGGGTCAACCTGGAGCTTACACTT GTCACGTTGGACACCAACGAGAAGTTCAGAGATGTCACCAAGTTTATCCCAGAAACCATCACTGGTGCTTCAGATGC TACGCTCATTATCAACACCGAACACATGCCCTCCATGTTCGTCCCAGTTGGGGACGTCGTTCAATATGGGTTCCTCAA TCTCTCTGGAAAGCCAACCCACCGTACCATGATGTACAACTTCCCGACCAAGGCCGGACAATGTGGTGGTGTTGTTAC CTCTGTCGGCAAGATTATTGGTATTCACATTGGTGGCAACGGTCGTCAGGGTTTCTGTGCTGGTCTCAAGAGAGGTTA CTTCGCTTCAGAGCAAGGCGAAATACAATGGATGAAGTCCAACAAGGAAACCGGGAGACTCAACATCAACGGTCCA ACCAGAACCAAATTGGAGCCAAGCGCTTTCTACGATGTTTTCGAGGGTTCCAAGGAACCAGCTGTTCTCACTTCCAAG GACCCACGCCTGGAAGTCGACTTCGAACAGGCCCTATTCTCCAAATACGTTGGGAACACCTTGCACGAGCCGGACGA GTATGTCACTCAAGCTGCATTGCACTACGCAAACCAACTCAAGCAATTGGACATCAACATCAACAAGATGTCCATGG AGGAGGCTTGTTATGGTACGGAGTACTTGGAAGCTATCAATCTTCACACCTCAGCTGGTTACCCATACTCTGCTTTGG GAGTCAAGAAGTCAGATATCTTGGATCCAACCACCAGAGACACTACCAAGATGAAGTTCTACATGGACAAGTACGGC TTGGACCTGCCCTACTCTACCTACGTCAAGGACGAGTTGCGATCGCTGGACAAGATCAAGAAAGGAAAATCCCGCCT CATCGAAGCCTCTTCACTCAACGACTCCGTTTACCTACGAATGACCTTTGGACACTTGTACGAGACTTTCCACGCAAA CCCTGGGACGGTTACAGGATCTGCCGTGGGGTGCAATCCCGATGTCTTCTGGTCGAAGTTGCCAATTCTGCTTCCAGG TTCCTTATTTGCCTTCGACTACTCGGGTTACGACGCCTCCTTGTCTCCAGTCTGGTTCCGAGCCTTGGAGGTTGTATTA CGGGAGATCGGCTACTCCGAAGAAGCCGTTTCTCTTATCGAAGGTATCAACCACACTCACCACGTGTACCGAAACAG AACTTACTGTGTTTTGGGAGGTATGCCATCCGGTTGTTCTGGGACCTCCATCTTCAACTCTATGATCAACAACATTATC ATCAGAACTTTGCTTATCAAGACTTTCAAGGGTATCGATTTGGACGAGCTCAACATGGTTGCTTACGGCGACGACGTT TTGGCCTCCTACCCATTCCCAATCGACTGTTCGGAGCTTGCCAAGACCGGAAAGGAATACGGTCTTACCATGACTCCA GCGGACAAGTCCCCATGTTTCAACGGGGTTACATGGGAGAACGCTACCTTTCTCAAGAGAGGATTCCTCCCAGACCA CCAATTCCCATTCCTTATTCACCCAACCATGCCAATGCGAGAGATCCACGAGTCTATCAGATGGACCAAGGATGCCA GAAACACTCAGGATCACGTCAGATCTCTGTGTTTGTTGGCCTGGCACAACGGAAAGGAGGAATACGAGAAATTCGTC TCCACCATCAGATCTGTTCCAGTTGGAAAGGCTCTGGCTATTCCAAACTTCGAGAACCTCAGAAGAAACTGGTTGGA GTTGTTCTAA Trình tự geneblock cần tổng hợp để tổng hợp gen 3CD vật lý: Gene 1: GAATTCACACAATGGCTGGACCATCACTTGACTTTGCACTTTCACTTCTTCGTCGAAACATTCGTCAAGTCCAAACGG ACCAGGGTCACTTCACCATGTTGGGTGTCCGGGACAGGCTTGCTATTCTCCCAAGACACTCCCAACCAGGCAAAACC ATTTGGGTGGAGCACAAGCTCATCAACGTTCTGGATGCCGTCGAGCTGGTGGACGAACAAGGGGTCAACCTGGAGCT TACACTTGTCACGTTGGACACCAACGAGAAGTTCAGAGATGTCACCAAGTTTATCCCAGAAACCATCACTGGTGCTTC AGATGCTACGCTCATTATCAACACCGAACACATG 148 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trƣờng Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 13, Số (2018) Gene 2: TCATTATCAACACCGAACACATGCCCTCCATGTTCGTCCCAGTTGGGGACGTCGTTCAATATGGGTTCCTCAATCTCTC TGGAAAGCCAACCCACCGTACCATGATGTACAACTTCCCGACCAAGGCCGGACAATGTGGTGGTGTTGTTACCTCTGT CGGCAAGATTATTGGTATTCACATTGGTGGCAACGGTCGTCAGGGTTTCTGTGCTGGTCTCAAGAGAGGTTACTTCGC TTCAGAGCAAGGCGAAATACAATGGATGAAGTCCAACAAGGAAACCGGGAGACTCAACATCAACGGTCCAACCAGA ACCAAATTGGAGCCAAGCGCTTTCTACGATGTTTTCGAG Gene 3: CGCTTTCTACGATGTTTTCGAGGGTTCCAAGGAACCAGCTGTTCTCACTTCCAAGGACCCACGCCTGGAAGTCGACTT CGAACAGGCCCTATTCTCCAAATACGTTGGGAACACCTTGCACGAGCCGGACGAGTATGTCACTCAAGCTGCATTGC ACTACGCAAACCAACTCAAGCAATTGGACATCAACATCAACAAGATGTCCATGGAGGAGGCTTGTTATGGTACGGAG TACTTGGAAGCTATCAATCTTCACACCTCAGCTGGTTACCCATACTCTGCTTTGGGAGTCAAGAAGTCAGATATCTTG GATCCAACCACCAGAGACACTACCAAGATGAAGTTCTACA Gene 4: TGTGATGGTTCTACTTCAAGATGTACCTGTTCATGCCGAACCTGGACGGGATGAGATGGATGCAGTTCCTGCTCAACG CTAGCGACCTGTTCTAGTTCTTTCCTTTTAGGGCGGAGTAGCTTCGGAGAAGTGAGTTGCTGAGGCAAATGGATGCTT ACTGGAAACCTGTGAACATGCTCTGAAAGGTGCGTTTGGGACCCTGCCAATGTCCTAGACGGCACCCCA CGTTAGGGCTACAGAAGACCAGCTTCAACGGTTAAGACGAAGGTCCAAGGAATAAACGGAAGCTGATGAGCCCAAT GCTGCGGAGGAACAGAGGTCAGACCAAGGCTCGGAACCTCCAACATAAT Gene 5: GCTCGGAACCTCCAACATAATGCCCTCTAGCCGATGAGGCTTCTTCGGCAAAGAGAATAGCTTCCATAGTTGGTGTGA GTGGTGCACATGGCTTTGTCTTGAATGACACAAAACCCTCCATACGGTAGGCCAACAAGACCCTGGAGGTAGAAGTT GAGATACTAGTTGTTGTAATAGTAGTCTTGAAACGAATAGTTCTGAAAGTTCCCATAGCTAAACCTGCTCGAGTTGTA CCAACGAATGCCGCTGCTGCAAAACCGGAGGATGGGTAAGGGTTAGCTGACAAGCCTCGAACGGTTCTGGCCTTTCC TTATGCCAGAATGGTACTGAGGTCGCCTGTTCAGGGGTAC Gene 6: TCGCCTGTTCAGGGGTACAAAGTTGCCCCAATGTACCCTCTTGCGATGGAAAGAGTTCTCTCCTAAGGAGGGTCTGGT GGTTAAGGGTAAGGAATAAGTGGGTTGGTACGGTTACGCTCTCTAGGTGCTCAGATAGTCTACCTGGTTCCTACGGTC TTTGTGAGTCCTAGTGCAGTCTAGAGACACAAACAACCGGACCGTGTTGCCTTTCCTCCTTATGCTCTTTAAGCAGAG GTGGTAGTCTAGACAAGGTCAACCTTTCCGAGACCGATAAGGTTTGAAGCTCTTGGAGTCTTCTTTGACCAACCTCAA CAAGATTCCATGG Trình tự gen P1 tối ƣu: CCAAAATGGCTGGTTCTCAAGTCTCTACGCAACGCTCTGGTTCTCACGAGAACTCCAATAGTGCATCAGAAGGTTCA ACGATCAACTACACAACCATCAATTACTACAAGGATGCCTACGCGGCCAGCGCTGGACGTCAAGACATGTCGCAAGA CCCAAAGAAATTCACGGACCCTGTCATGGATGTTATCCACGAGATGGCTCCGCCCCTCAAGAGTCCAAGCGCGGAAG CCTGTGGTTATTCAGACAGAGTTGCACAACTTACCATCGGCAATTCTACCATCACAACACAAGAGGCGGCAAATATT 149 Thiết kế tối ưu gen để biểu dị loài sử dụng hệ thống thương mại số phần mềm tối ưu miễn phí GTTATCGCATATGGCGAATGGCCCGAGTACTGTCCAGACACGGATGCTACCGCAGTCGACAAACCAACCAGACCGGA TGTGTCTGTCAACCGGTTCTTTACTTTGGACACCAAGTCTTGGGCGAAAGACTCGAAGGGATGGTATTGGAAGTTTCC CGACGTTCTTACAGAGGTTGGTGTCTTCGGACAGAATGCCCAATTCCACTATCTTTATCGCTCGGGATTTTGCGTTCAT GTGCAGTGCAATGCCTCGAAGTTCCATCAGGGTGCTTTGCTTGTTGCGGTTTTGCCAGAATATGTACTCGGGACCATT GCCGGGGGTACGGGGAACGAAAACAGCCATCCCCCTTACGCCACGACCCAACCTGGTCAAGTTGGTGCCGTGCTCAC GCATCCATATGTGCTGGATGCGGGTATCCCACTGTCACAGCTCACCGTCTGTCCACATCAATGGATCAATCTCAGGAC GAACAACTGCGCTACGATCATTGTACCCTACATGAATACCGTTCCATTCGATAGCGCTTTGAACCACTGTAACTTCGG CCTGTTGGTTATCCCAGTTGTTCCTCTTGACTTCAACACTGGAGCTACTTCTGAAATTCCTATCACTGTGACCATTGCT CCAATGTGTGCTGAGTTTGCCGGTTTGCGTCAGGCTGTCAAGCAAGGTATTCCAACTGAGCTGAAGCCTGGTACAAAC CAATTCCTTACCACCGATGACGGTGTTTCCGCCCCAATTCTGCCAGGTTTCCACCCAACCCCACCAATCCACATCCCT GGTGAGGTTCACAACTTGTTAGAGATCTGTAGAGTTGAGACCATTCTAGAAGTTAACAACTTGAAAACTAACGAAAC TACTCCAATGCAAAGACTGTGTTTCCCAGTTTCTGTCCAATCCAAGACTGGCGAGCTTTGTGCCGCTTTCAGAGCTGA CCCAGGTAGAGATGGTCCATGGCAGTCCACCATTTTGGGTCAGCTGTGTAGATACTATACTCAGTGGTCTGGTTCTCT AGAGGTTACTTTCATGTTCGCTGGTTCTTTCATGGCCACTGGAAAAATGCTGATCGCTTACACTCCACCAGGTGGTAA CGTCCCAGCTGACAGAATTACCGCTATGTTGGGAACACACGTTATCTGGGACTTCGGATTGCAGTCCTCCGTCACCCT GGTTGTTCCATGGATTTCTAATACCCACTACAGAGCTCACGCTAGAGCTGGTTACTTCGACTACTATACTACTGGTATT ATCACCATCTGGTATCAAACCAACTACGTTGTCCCTATTGGTGCCCCAACCACCGCTTACATTGTAGCCTTGGCTGCT GCTCAAGATAACTTCACTATGAAGTTGTGTAAGGATACTGAAGACATCGAACAAACTGCTGACATTCAAGGTGATCC AATTGCCGACATGATTGACCAAACTGTCAACAACCAAGTCAACAGATCCTTGACGGCTTTGCAAGTCTTGCCTACTGC TGCTAACACCGAGGCTTCGTCCCACAGATTGGGTACTGGAGTTGTCCCAGCTTTGCAAGCTGCTGAAACCGGTGCTTC CTCCAACGCCTCCGATAAGAACCTGATTGAGACTCGTTGTGTTTTGAACCACCACTCAACTCAAGAGACAGCTATTGG TAACTTCTTCTCCAGAGCTGGACTTGTTTCTATTATCACCATGCCAACCATGGGAACTCAGAACACTGATGGCTATGC AAACTGGGACATTGACTTGATGGGATACGCTCAGCTGAGAAGAAAGTGTGAGCTGTTCACTTACATGAGGTTTGATG CCGAGTTCACCTTCGTTGTTGCCAAACCTAACGGTGAGTTAGTTCCACAATTGCTGCAATACATGTACGTCCCACCTG GTGCTCCTAAGCCAACCTCTAGAGACTCTTTCGCCTGGCAAACCGCTACTAATCCATCTGTCTTCGTCAAGATGACCG ACCCACCAGCTCAGGTCTCAGTCCCATTCATGTCCCCAGCCTCTGCTTATCAATGGTTCTACGATGGTTACCCTACCTT CGGGGAGCACTTGCAAGCCGACGATTTGGACTACGGTCAATGTCCAAACAACATGATGGGCACTTTCTCCATTAGAA CCGTCGGTACTAAGAAATCCCCACACTCTATCACCTTGAGAGTCTACATGAGAATCAAGCACGTTAGAGCCTGGATC CCAAGACCATTGAGAAACCAGCCATACTTGTTCAAGACCAACCCAAACTACAAGGGTAACGACATCAAGTGTACTTC TACTTCCAGAGACAAGATCACCACCTTGTAA Mã mở đầu (ATG) mã kết thúc c{c gen đƣợc bôi đậm gạch dƣới (ghi tác giả) 150 ... Developer để tính to{n lƣợng gập cuộn cấu trúc thứ cấp mRNA để chọn gen tối ƣu Kết chọn 141 Thiết kế tối ưu gen để biểu dị loài sử dụng hệ thống thương mại số phần mềm tối ưu miễn phí gen để tối ƣu... Thiết kế tối ưu gen để biểu dị loài sử dụng hệ thống thương mại số phần mềm tối ưu miễn phí Để tối ƣu EDIII v| polyprotein Coxsackievirus A16 sử dụng phần mềm COOL [24] Tuy nhiên trình dịch mã gen. . .Thiết kế tối ưu gen để biểu dị loài sử dụng hệ thống thương mại số phần mềm tối ưu miễn phí Hai phƣơng ph{p phổ biến để thu nhận gen cần biểu tạo dòng gen từ nguồn tự nhiên tổng hợp gen Tạo