Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số 39B, 2019 TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ MƠ HÌNH CHUỘT NHẮT TRẮNG (SWISS ALBINO) BÉO PHÌ DO KHẨU PHẦN ĂN GIÀU CHẤT BÉO NGUYỄN CAO TRÍ, VÕ MINH TUẤN, NGƠ MỸ TIÊN, NGUYỄN LÊ DUY, TRẦN VĂN HIẾU Khoa Sinh học – Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM tvhieu@hcmus.edu.vn Tóm tắt Béo phì bệnh phức tạp, mãn tính khó để nghiên cứu vấn đề liên quan đến béo phì người thời gian dài Vì vậy, số mơ hình béo phì phần ăn động vật xây dựng phát triển cung cấp thông tin giá trị sinh bệnh học giải pháp điều trị bệnh béo phì Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng chủng chuột Swiss albino chia làm hai nhóm thử nghiệm theo dõi 24 tuần: nhóm ăn chế độ ăn chất béo (CTL) chế độ ăn giàu chất béo (HFD) Kết cho thấy, lượng calo hấp thu, cân nặng tỉ lệ mỡ thể nhóm HFD cao so với nhóm CTL Vào tuần 16 giai đoạn thử nghiệm, nhóm HFD cho thấy số cholesterol toàn phần, acid uric, ALT AST cao so với nhóm CTL cho thấy có tình trạng gan nhiễm mỡ Như vậy, mơ hình chuột Swiss albino béo phì phần ăn chìa khóa quan trọng để nghiên cứu phát triển giải pháp ngăn ngừa điều trị béo phì Từ khóa: Béo phì, béo phì phần ăn, mơ hình chuột béo phì, Swiss albino GENERATING AND EVALUATING HIGH FAT DIET - INDUCED OBESITY SWISS ALBINO MICE MODEL Abstract Obesity is a complex and chronic disease, so it is difficult to study issues related to obesity for a long time Therefore, some of high fat diet-induced obesity animal models have been created and developed, providing valuable information about pathogenesis and treatment solutions for obesity In this study, we used Swiss albino mice that were divided into two experimental groups and followed for 24 weeks: the group eating a low-fat diet (Normal group - CTL) and a high-fat diet (HFD) Results showed that daily calories from fat intake, weight and the body fat ratio of HFD group was higher than that of CTL group At week 16 of the experimental period, the HFD group showed the total cholesterol, uric acid, ALT and AST were higher than that of the CTL group, and also showed macrovesicular steatosis formation In conclusion, obesity model from Swiss albino was established which played an important key for researching and developing obesity treatments Key words Diet-induced obesity, obesity, obesity mouse model, Swiss albino GIỚI THIỆU Béo phì vấn đề sức khỏe cộng đồng, xảy thể tích tụ nhiều mỡ hay cân nặng vượt ngưỡng cho phép, xác định dựa tương quan số BMI (Body Mass Index – số khối thể) Thừa cân béo phì mối đe dọa nghiêm trọng sức khỏe người, gây bệnh mạn tính khơng lây nhiễm kháng insulin, rối loạn mỡ máu, gan nhiễm mỡ, ngừng thở ngủ [9] Tại Việt Nam, theo thống kê Viện Dinh dưỡng Quốc gia vào năm 2015, tỉ lệ trẻ em béo phì thành phố Hồ Chí Minh Hà Nội 50% 41% có xu hướng tăng nhanh với tốc độ tăng 40% năm [22] Số liệu cho thấy tình trạng mắc bệnh béo phì ngày trẻ hóa, phát triển cách nhanh chóng trở thành vấn đề sức khỏe cộng đồng đáng lo ngại Việt Nam Việc nghiên cứu vấn đề béo phì người nhiều thời gian công sức [15], mơ hình béo phì loài động vật gặm nhấm biện pháp thay phù hợp để nghiên cứu khía cạnh chế bệnh béo phì tác động sinh lý [20], nhờ số ưu điểm rút ngắn thời gian thí nghiệm có vịng đời ngắn đặc biệt có hệ gen gần giống người © 2019 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 182 TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ MƠ HÌNH CHUỘT NHẮT TRẮNG (SWISS ALBINO) BÉO PHÌ DO KHẨU PHẦN ĂN GIÀU CHẤT BÉO Tuy nhiên, thách thức lớn phải chọn mơ hình động vật béo phì phù hợp có tương quan với bệnh lí thường gặp người Trong mơ hình chuột béo phì nay, mơ hình sử dụng nhiều mơ hình chuột béo phì thiếu hụt gen mã hóa leptin (chuột ob/ob) [10] gen mã hóa thụ thể leptin (chuột db/db), [4] Tuy nhiên, thực tế việc khiếm khuyết gen gặp người nên mơ hình gặp khó khăn việc nghiên cứu bệnh liên quan Vì vậy, số mơ hình chuột béo phì chế độ ăn xây dựng góp phần nghiên cứu chế giải pháp điều trị béo phì Thực phẩm giàu chất béo chứng minh có khả làm tăng khối lượng thể bệnh tiểu đường nhiều chủng chuột khác [18] Trong nhiều năm vừa qua, có nhiều nghiên cứu cho thấy động vật thí nghiệm có thay đổi rõ rệt sử dụng chế độ ăn giàu chất béo Một số động vật cho thấy có gia tăng tỉ lệ chất béo thể, có số lồi khơng có đáp ứng với chế độ ăn [14] Chủng chuột đen C57BL/6J coi mơ hình chuột béo phì chế độ ăn phổ biến nhạy cảm với chế độ ăn nhiều chất béo có tương đồng tượng rối loạn chuyển hóa giai đoạn béo phì cho ăn chế độ ăn giàu chất béo, chủng chuột có tăng khối lượng, insulin máu đường huyết [5] Tuy nhiên chủng chuột thường sử dụng cho nghiên cứu Việt Nam nên việc tạo mơ hình chuột béo phì phần ăn chủng C57BL/6J thường tốn nhiều chi phí địi hỏi cần phải nhập chuột Việt Nam Mặt khác, Việt Nam, chuột nhắt trắng Swiss albino (Mus musculus) giống chuột thường sử dụng nghiên cứu bệnh người Do đó, chúng tơi nghiên cứu thiết lập tạo mơ hình chuột béo phì chế độ ăn với chi phí thấp thuận tiện cho nghiên cứu béo phì nước cách sử dụng chủng chuột nhắt trắng Swiss albino Kết tạo mơ hình chuột béo phì phần ăn nghiên cứu giúp nghiên cứu chế, giải pháp điều trị béo phì có khả thi tương lai VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu sinh học Chuột nhắt trắng Swiss albino (Mus musculus) (chuột cái, cân nặng 18 – 20 g) đạt chuẩn cung cấp từ Viện Kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh Chuột ni ổn định tuần trước tiến hành thí nghiệm Thức ăn dùng để ni chuột thời gian trước thí nghiệm cám viên cung cấp Viện Pasteur (thành phần bao gồm đạm tổng số 21%, chất béo – 7%, chất xơ – 6%, chất khoáng tổng hợp – 8%), nước uống lấy nguồn nước lọc dân dụng áp dụng chu kỳ ngày đêm 12 sáng/tối với nhiệt độ thích hợp 25±30 C 2.2 Tạo mơ hình chuột béo phì phần ăn giàu chất béo Chuột chia ngẫu nhiên thành hai nhóm (n=12) cho ăn 24 tuần sau: nhóm đối chứng (CTL) cho ăn chế độ ăn 10% chất béo; nhóm ăn béo (HFD) cho ăn chế độ ăn 60% chất béo (Research Diet, Mỹ) [17] Hàm lượng chất chế độ ăn thể bảng bảng bảng Bảng Thành phần dinh dưỡng phần ăn 60% béo Các thành phần dinh dưỡng Protein Protein Carbohydrate Carbohydrate Chất xơ Chất béo Chất béo Khoáng chất Vitamine Vitamine Chất màu Thành phần Casein, Lactic, 30 Mesh Cystine, L Lodex 10 Sucrose Solka Floc, FCC200 Mỡ heo Dầu đậu nành, USP Các muối Na+, K+, Ca2+ Choline Bitartrate Các vitamin A, B D Dye, Blue FD&C #1, Alum Lake 35-42% © 2019 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Khối lượng (g) 200 125 72,8 50 245 25 50 0,05 Tổng cộng: 773,85 TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ MÔ HÌNH CHUỘT NHẮT TRẮNG (SWISS ALBINO) BÉO PHÌ DO KHẨU PHẦN ĂN GIÀU CHẤT BÉO 183 Bảng Thành phần dinh dưỡng phần ăn đối chứng Các thành phần dinh dưỡng Protein Protein Carbohydrate Carbohydrate Carbohydrate Chất xơ Chất béo Chất béo Khoáng chất Vitamine Vitamine Chất màu Thành phần Casein, Lactic, 30 Mesh Cystine, L Sucrose Bột ngô Lodex 10 Solka Floc, FCC200 Mỡ heo Dầu đậu nành, USP Các muối Na+, K+, Ca2+ Choline Bitartrate Các vitamin A, B D Dye, Yellow FD&C #5, Alum Lake 35-42% Khối lượng (g) 200 354 315 35 50 20 25 50 0,05 Tổng cộng: 1055,05 Bảng Hàm lượng chất chế độ ăn D12492 D12450J Protein (% kcal) 20 20 Carbohydrate (% kcal) 20 70 Fat (% kcal) 60 10 Năng lượng cung cấp (kcal/g) 5,2 3,8 Thí nghiệm tuân thủ theo nguyên tắc thí nghiệm động vật số lượng động vật thí nghiệm nhỏ sử dụng biện pháp gây chết nhanh chóng, tránh gây đau đớn kéo dài trường hợp cần thu mẫu 2.3 Đánh giá mơ hình dựa cân nặng chuột lƣợng thức ăn tiêu thụ ngày Lượng thức ăn tiêu thụ (g/ngày) ghi nhận ngày Tổng lượng calo nhận nhóm tính dựa lượng thức ăn tiêu thụ ngày Bên cạnh đó, khối lượng ghi nhận tương ứng cho cá thể chuột vào tuần suốt trình thí nghiệm (24 tuần) 2.4 Đánh giá mơ hình dựa số sinh hóa Sau thí nghiệm cho ăn tương ứng với nhóm, chuột bỏ đói 12 gây mê với thành phần thuốc mê bảng Bảng Thành phần thuốc gây mê Ketamine Xylazine PBS 1X Tổng thể tích Nồng độ stock (mg/mL) 100 20 Thể tích pha trộn (mL) 0,5 3,5 Liều dùng (mg/kg) 100 10 Liều tiêm cho chuột 0,05 mL/10 g Liều lượng 0,05 mL cho 10 g thể trọng để tiến hành thu máu (n=3) vào tuần 8, 12, 16 24 Máu bảo quản 40C, sau tiến hành ly tâm tốc độ 5000 vịng 10 phút để thu huyết Mẫu huyết thu tiến hành phân tích máy sinh hóa bán tự động Erba Chem 5v3 để đo số sau: triglyceride (TG) [19], cholesterol toàn phần (TC) [3], cholesterol lipoprotein tỉ trọng cao (HDL-c) [12], nồng độ enzyme Alanine-amino transferase (ALT) [1] Aspartate-amino transferase (AST) [2], acid uric [21] Chỉ số cholesterol lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL-c) tính theo cơng thức: © 2019 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ MƠ HÌNH CHUỘT NHẮT TRẮNG (SWISS ALBINO) BÉO PHÌ DO KHẨU PHẦN ĂN GIÀU CHẤT BÉO 184 LDL-c = TC – HDL-c – TG/5 (1) 2.5 Đánh giá mơ hình dựa tỉ lệ mỡ đánh giá mơ học gan Sau thí nghiệm thu máu, cá thể chuột giải phẫu thu nhận tổng lượng mô mỡ mô gan Việc thu mỡ gồm hai công đoạn thu mỡ nâu mỡ trắng, ghi nhận khối lượng mỡ tương ứng hai nhóm chuột Trong đó, mỡ nâu phần mỡ thu phần lưng gần chi chuột, dễ dàng thấy sau cắt lớp da sau lưng Phần mỡ nội tạng tập trung chủ yếu vùng ổ bụng, xung quanh nội quan Sau mở màng bụng chuột, thấy thu nhận cách dùng kéo lọc mỡ Tổng lượng mỡ thu (gồm mỡ nâu mỡ nội tạng) chia cho khối lượng chuột theo công thức ghi nhận giá trị trung bình: ( ) ( ) Sau đó, mẫu gan thu cân trực tiếp để ghi nhận khối lượng Cuối cùng, mẫu gan sau cắt lát cố định formaldehyde 10% 24 giờ, sau đúc khối parafin, cắt lát nhuộm màu với hematoxylin eosin để đánh giá hình thái tế bào Mẫu nhuộm chụp độ phóng đại 20X 40X để đánh giá tình trạng nhiễm mỡ gan Vùng tế bào mỡ tính tốn phần mềm ImageJ với độ lặp lại ba lần 2.6 Xử lý thống kê Tất liệu hiển thị dạng giá trị trung bình độ lệch chuẩn giá trị trung bình với độ lặp lại ba lần Số liệu xử lý phần mềm Graphpad để vẽ đồ thị Tất so sánh thống kê thực cách sử dụng phép thử ANOVA hai nhóm tham số nhóm thời điểm khác Giá trị P