ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG HỨA THỊ VY PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA SP GÂY BỆNH SƢƠNG MAI TRÊN CÂY CÀ CHUA Đà Nẵng – Năm 2019 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG HỨA THỊ VY PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA SP GÂY BỆNH SƢƠNG MAI TRÊN CÂY CÀ CHUA Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S LÊ VŨ KHÁNH TRANG Đà Nẵng – Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu, kết nêu luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Các thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Đà Nẵng, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Hứa Thị Vy LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc trước quan tâm, dìu dắt tận tình hướng dẫn Lê Vũ Khánh Trang suốt q trình thực đề tài hồn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn trước quan tâm tạo điều kiện giúp đỡ quý thầy, cô khoa Sinh – Môi trường Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè quan tâm, giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Đà Nẵng, ngày tháng năm2019 Tác giả luận văn Hứa Thị Vy MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học .8 3.2 Ý nghĩa thực tiễn .9 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .10 1.1 Tổng quan cà chua .10 1.1.1 Cây cà chua 10 1.1.2 Một số bệnh cà chua .11 1.1.3 Triệu chứng bệnh sương mai cà chua .12 1.2 Tổng quan nấm Phytophthora sp 14 1.2.1 Đặc điểm sinh thái nấm Phytophthora sp 14 1.2.2 Đặc điểm sinh học nấm Phytophthora sp gây hại trồng 14 1.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn đối kháng với nấm Phytophthora sp 15 1.3.1 Những nghiên cứu vi khuẩn đối kháng với nấm Phytophthora sp giới 15 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 18 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 21 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu .21 2.3.2.1 Phương pháp thu mẫu 21 2.3.2.2 Phương pháp phân lập nấm bệnh Phytophthora sp .22 2.3.2.3 Phương pháp lây bệnh nhân tạo 22 2.3.2.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn 22 2.3.2.5 Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn có khả đối kháng mạnh với nấm Phytophthora sp 23 2.3.2.6 Phương pháp xác định đặc tính sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn .24 2.3.2.7 Phương pháp định danh vi khuẩn sinh học phân tử Error! Bookmark not defined.25 2.3.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 256 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .27 3.1 Kết phân lập nấm Phytophthora sp gây bệnh mốc sương cà chua 27 3.2 Kết lây bệnh nhân tạo 29 3.3 Kết phân lập vi khuẩn .29 3.4 Kết tuyển chọn vi khuẩn có khả đối kháng mạnh với nấm Phytophthora sp 32 3.5 Kết nghiên cứu đặc tính sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn VK15 34 3.6 Kết định danh loài vi khuẩn kỹ thuật sinh học phân tử 36 3.6.1 Nuôi cấy sinh khối vi khuẩn Bacillus sp 36 3.6.2 Khuếch đại vùng gen 16S rRNA 36 3.6.3 Đọc trình tự sản phẩm PCR 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 Kết luận .42 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 1.1 Các bệnh phổ biến vsv gây cà chua 3.1 Kết phân lập mẫu bệnh mốc sương cà chua 21 3.2 Các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng trồng cà chua TP Đà Nẵng 24 3.3 Đặt điểm hình thái 21 chủng vi khuẩn phân lập từ vùng trồng cà chua TP Đà Nẵng 24 3.4 Khả đối kháng số vi khuẩn nấm Phytophthora sp 26 3.5 Đặc điểm dòng vi khuẩn VK15 29 3.6 Đường kính vịng phân giải enzyme ngoại bào 30 DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu hình Tên hình Trang 1.1 Hình ảnh mơ tả cà chua 1.2 Triệu chứng bệnh sương mai cà chua 1.3 Triệu chứng bệnh sương mai cành chua 1.4 Triệu chứng bệnh sương mai cà chua 3.1 Triệu chứng bệnh mốc sương nấm Phytophthora sp cà chua 22 3.2 Tản nấm Bào tử nang Phytophthora sp môi trường PDA 22 3.3 Kết lây bệnh nhân tạo cà chua 23 3.4 Hình ảnh bệnh lấy ngồi thực tế 23 3.5 Hình dạng khuẩn lạc số dịng vi khuẩn 25 3.6 Khả đối kháng chủng vi khuẩn VK15 với nấm Phytophthora sp 27 3.7 Bào tử chủng vi khuẩn VK15 28 3.8 Kết khảo sát chế đối kháng số dòng vi khuẩn 29 3.9 Sinh khối Bacillus sp 30 3.10 Khuếch đại vùng gen 16S rRNA (Bacillus sp.) 30 3.11 Trình tự vùng gen 16S rRNA 32 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CS : Cộng MT : Môi trường NB : Nấm bệnh STT : Số thứ tự TP : Thành phố VSV : Vi sinh vật VK : Vi khuẩn Hình 3.11 Trình tự vùng gen 16S rRNA Sử dụng công cụ Blast web NCBI để tìm kiếm trình tự tương đồng cho kết sau [15] 38 39 Trình tự tương đồng 99% với loài Bacillus velezensis, cho phép kết luận vi khuẩn Bacillus lồi Bacillus velezensis Bacillus velezensis mơ tả đầy đủ vi khuẩn Gram dương, hình que, kích thước tế bào vi khuẩn 0,7 – 0,9 x 1,6 – μm, có khả sinh acid từ aesculin, amygdalin, arbutin, (Wang cs., 2008)[48] Lồi cịn biết đến tác nhân phòng trừ sinh học bệnh hiệu với khả sản sinh tốt kháng sinh, enzyme phân giải vách tế bào nấm bệnh hợp chất kích thích sinh trưởng cho trồng (Mc Spadden, 2004) [41] Dòng vi khuẩn B.velezensis CNU114001 nghiên cứu Jivàcs (2013) [35] cho thấy khả đối kháng với tất 12 loài nấm 40 gây bệnh thực vật thử nghiệm Colletotrichum acutatum, Pyricularia grisea, Fusarium oxysporum Đến thời điểm chưa có báo cáo đề cập đến tác hại vi khuẩn Bacillus velezensis Cho thấy loài vi khuẩn tiềm để sản xuất chế phẩm sinh học 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua nghiên cứu rút số kết luận sau: - Đã phân lập nấm Phytophthora sp gây bệnh sương mai cà chua Phân lập tuyển chọn 21 chủng vi khuẩn có khả đối kháng với nấm Phytophthora sp gây bệnh sương mai từ vùng đất trồng cà chua thành phố Đà Nẵng Trong có chủng vi khuẩn có hiệu lực đối kháng với nấm gây bệnh dao động từ 55,56-88.89% sau 4-6 ngày chủng vi khuẩn Chủng VK15 có khả kháng mạnh với nấm Phytophthora sp 88,89% - Kết định danh VK15 việc giải trình tự gen 16S rRNA cho thấy chủng thuộc loài Bacillus velezensis Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu vi khuẩn đối kháng giải pháp khoa học công nghệ phòng trừ bệnh mốc sương cà chua, làm sở cho việc sản xuất chế phẩm sinh học từ vi khuẩn xây dựng quy trình phịng trừ tổng hợp bệnh hại cà chua áp dụng cho vùng trồng cà chua nước 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Đoàn Xuân Cảnh (2014) “Kết nghiên cứu chọn tạo giống cà chua lai F1 phục vụ nội tiêu xuất cho tỉnh phía Bắc” Tạp chí Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam Số 22a, 19pp [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục [3] Trần Hà cộng (2007), “Nghiên cứu xác định vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phân lập từ vùng rễ hồ tiêu Quảng Trị phương pháp PCR” Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội Khoa Sinh – KTNN [4] Trần Thị Thu Hà (2011), “Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas putida phòng trừ bệnh chết nhanh (Phytophthora capsici), Trường Đại học Huế [5] Phan Thúy Hiền, Burgess L V., Knight T E., Tesoriro L.(2009), Cẩm nang chẩn đoán bệnh Việt Nam, Chuyên khảo ACIAR số 129a, 210pp [6] Phạm Thị Thuý Hoài (2014) “Nghiên cứu sản xuất sử dụng số chế phẩm sinh học nhằm nâng cao suất hồ tiêu Quảng Trị” Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm KHCNVN [7] Trầ n Ng ọc Hùng, “Nghiên cứu chọn tạo giống cà chua lai (f ) chống chịu bệnh sương mai (phytophthora infestans de bari) bệnh xoăn vàng (TYLCV) thị phân tử”, Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ Viện Nghiên Cứu Rau Quả [8] Nguyễn Quang Huy, Trần Thúy Hằng (2012) “Phân lập chủng bacillus có hoạt tính tạo màng sinh vật (biofilm) tác dụng kháng khuẩn chúng” Tạp Chí Sinh Học - Trường đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội Số 34(1): 99-106 [9] Trần Ngọc Khánh & cộng (2015) “Nghiên cứu ứng dụng số vi sinh vật đối kháng nấm phytophthora infestans gâybệnh mốc sương cà chua”, 43 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp [10] Đỗ Thị Huỳnh Mai, Nguyễn Thị Liên (2018) “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn đối kháng nấm neoscytalidium sp gây bệnh đốm trắng lan ngọc điểm” Tạp chí khoa học & công nghệ nông nghiệp, Viện Nghiên Cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ Tập (1) [11] Ngeolqd (2010), Đặc tính thực vật cà chua, NXB Giáo dục, 67-80 [12] Đinh Hồng Thái Lê Minh Tường (2016), “Khảo sát khả đối kháng xạ khuẩn nấm phytophthora sp gây bệnh cháy lá, thối thân sen”, Tạp chí khoa học trường đại học Cần Thơ Số 3: 20-27 [13] Mai Văn Trị Nguyễn Thị Thúy Bình (2003), “Ảnh hưởng phân bón hữu sinh trưởng, suất bệnh Phytophthora sầu riêng”, Kỷ yếu Hội thảo khoa học BVTV phục vụ chuyển đổi cấu trồng tỉnh phía Nam Tây Nguyên [14] Viện Bảo vệ thực vật (1999), “Phương pháp nghiên cứu bệnh tập I”, Nhà xuất nông nghiệp, 100tr [15] Viện BVTV Lester W Burgess cộng sự, “Phương pháp thu thập VSV gây hại theo phương pháp nghiên cứu BVTV”, I, ấn hành 1997, 1998 TÀI LIỆU TIẾNG ANH [16] Altschul SF, Gish W, et al (1990), “Basic local alignment search tool”, J Mol Biol (215), 403-410 [17] Anandaraj M & Sarma Y R.(2003),“The potential of IISR-6 in disease management of spice crops”, Sixth International Workshop on Plant Growth Promoting Rhizobacteria, Oral Presentation, Calicut (pp 2739), Indian Institute of Spices Research, Calicut [18] Andre D and David I.G.(2004), Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia Autralian Centre for International Agricultural Research Canberra 235 pp [19] Antonio N Moretti(2009), “Taxonomy of Fusarium genus, a continuous fight between lumpers and splitters”, Proc Nat Sci, MaticaSrpska Novi Sad, No 117, 7—13, 2009 44 [20] Baker, K F., and Cook, R J (1974), Biological Control of Plant Pathogens,W H Freeman & Company, San Francisco, pp 200-205 [21] Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol.4 (1989) [22] Brian C Sutton (1998), “The Coelomycetes Fungi Imperfecti with Pycnidia Acervuli and Stromata”, CABI Publishing, p 526 – 529 [23] Cook, R J., and Baker, K F (1983), “The Nature and Practice of Biological Control of Plant Pathogens”, American Phytopathological Society, St Paul, MN, pp 445-460 [24] Claus, D and Berkeley, RCW (1986) Genus Bacillus Cohn, 1872 In: Sneath, PHA, Mair, NS, Sharpe, ME and Holt JG, Eds., Bergey's Manual of Systematic Bac-teriology, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, 2, 11051139 [25] Diby P., Kumar A., Anadaraj M., Sarma, Y.R (2001),“Studies on the suppressive action of fluorescent pseudomonas on Phytophthora capsici, the foot rot pathogen of black pepper”, Indian Phytopath., 54 (4): 515 [26] Dong H.C, Rong.D.J, Hoon.H, Yong.W.K, Yong.C K, Ro D P, Hari.B K and Kil Y K (2006), “Control of late blight (Phytophthora capsici ) in pepper plant with a compost containing multitude of chitinase - producing bacteria” BioControl 51: 339–351 [27] Erwin, D.C and Riberrio O.K (1996), “Phytophthora diseases worldwide”, St Paul, Minnessota, USA, American Phytopathological Society Press, p 562 [28] Halsted BD A new anthracnose of pepper Bulletin of the Torrey Botanical Club 1890;18:14–15 [29] Han, J H., Shim, H., Shin, J H., & Kim, K S., (2015) Antagonistic activities of Bacillus spp strains isolated from tidal flat sediment towards anthracnose pathogens Colletotrichum acutatum and C gloeosporioides in South Korea The plant pathology journal, 31(2), 165 [30] Hsu, S C., & Lockwood, J L., (1975) Powdered chitin agar as a selective medium for enumeration of actinomycetes in water and soil Applied microbiology, 29(3), 422-426 45 [31] Galindo JJ, Kenane PJ, editor, Putter CAJ (1992), Prospects for biological control of black pod of cacao Cocoa pest and disease management in Southeast Asia and Australasia FAO plant production and protection paper 112:3136 [32] Ghorbel, B., Sellami-Kamoun, A., & Nasri, M., (2003) Stability studies of protease from Bacillus cereus BG1 Enzyme and Microbial Technology, 32(5), 513-518 [33] Goodwin, S B., and Fry, W E (1994),Genetic analyses of interspecific hybrids between Phytophthora infestans and Phytophthora mirabilis Exp Mycol 18:20 [34] Jensen S, et al (2002) Spatial regulation of the guanine nucleotide exchange factor Lte1 in Saccharomyces cerevisiae J Cell Sci115 (Pt 24): 4977-91 [35] Ji, S H., Paul, N C., Deng, J X., Kim, Y S., Yun, B S., & Yu, S H., (2013) Biocontrol activity of Bacillus amyloliquefaciens CNU114001 against fungal plant diseases Mycobiology, 41(4), 234-242 [36] J Taylor (2007), “Characterization and pathogenicity of Colletotrichum species associated with anthracnose on chilli (Capsicum spp.) in Thailand”, Plant Pathology, p 1365 – 3059.90 [37] J Zhejiang Univ SciB (2008 October); (10): 764–778: 10.1631/jzus B0860007.Chilli anthracnose disease caused by Colletotrichum species Copyright © 2008, Journal of Zhejiang University Science [38] Lee, H.B.Y.Kim, Y.C.Kim, K.S.Park (2008), “Activity of some aminoglycoside antibiotics against true fungi Phytophthora and Colletotrichum species on tomato”, Pathology Journal, the Korean Society of Plant Pathology, Volume 55, Number 3, 131-139, 6/2008 [39] Letter W Burgess (2008), Diagnostic manual for plant diseases in Vietnam Australian Center for International Agricultural Research [40] Liu Z, Lozupone C, Hamady M, Bushman FD, Knight R (2007), Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis Nucleic Acids Res 35: e120 46 [41] Mc Spadden Gardener, B B., (2004) Ecology of Bacillus and Paenibacillus spp in agricultural systems Phytopathology, 94(11), 1252-1258 [42] Multhukrishman C.R., T.Thangaraj and R Chatterjee (1986) chilli and Capsicum Vegetable crops in India, T.K Bose & M.G Som Published B.Mitra NAYA Prokash 206 Bidhan Sarani Calcutta 700006 India, P343378 [43] Narayan Chandra Paul, Jian Xin Deng, Hyun Kyu Sang, Young Phil Choi and Seung Hun Yu (2012), “Distribution and Antifungal Activity of Endophytic Fungi in Different Growth Stages of Chili Pepper (Capsicum annuum L.) in Korea”, Plant Pathol J.28 (1): 10-19 (2012) [44] S B Mathur Olga Kongsdal (2000), “Manual on common Laboratory Seed health Testing Methods for Dectecting Fungi”, Plant Diseases Report [45] Stephan Olson, M., Stall, G.E., Webb, S.A., Simonne, E.H (2010), Tomato production in Florida Vegetable production hanbook for Florida 20102011.UF University of Florida, 2010, Chapter 23, P295-316 Citrus & Vegetable manazine [46] Teather, R M., & Wood, P J., (1982) Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen Applied and environmental microbiology, 43(4), 777780 [47] Weller, D.M (2007), “Pseudomonas biocontrol agents of soilborne pathogens: lookingback over 30years”, The American Phytopathologycal Society, 97:p.250–256 [48] Wang, L T., Lee, F L., Tai, C J., & Kuo, H P., (2008) Bacillus velezensis is a later heterotypic synonym of Bacillus amyloliquefaciens International journal of systematic and evolutionary microbiology, 58(3), 671-675 [49] William W Kirk, Firas Abu-El Samen, Pavani Tumbalam, Phillip Wharton, David Douches, Christian A Thill, Asunta Thompson(2009),“Impact of Different US Genotypes of Phytophthora infestans on Potato Seed Tuber Rot and Plant Emergence in a Range of Cultivars and Advanced Breeding Lines” Potato Research DOI 10.1007/s11540-009-9125-6 47 [50] Woo Jin Jung,Yu Lan Jin, Kil Yong Kim, Ro Dong Park and Tae Hwan Kim (2005),“Changes in Pathogenesis- related protein in pepper plants with regard to biological control of Phytophthora blight with Paenibacillus illinoisensis”, Pathology Journal, the Korean Pathology,Volume 50, Number 1, 165-178, 2/2005 48 Society of Plant PHỤ LỤC 01 MỘT SỐ MƠI TRƢỜNG PHÂN LẬP, NI CẤY VÀ VẬT LIỆU HĨA CHẤT TRONG TEST SINH HÓA VI KHUẨN A MỘT SỐ MƠI TRƢƠNG PHÂN LẬP, NI CẤY - Mơi trƣờng WA (Water Agar medium) Thành phần môi trường: - Nước cất: 1000 ml - Agar : 20g - Môi trƣờng PDA (Potato Dextrose Agar) Thành phần môi trường: - Nước cất: 1000 ml - Glucose : 20g - Khoai tây: 200g - Agar : 20g - Môi trƣờng LB (Luria-Bertani) Thành phần môi trường: - Nước cất : 1000 ml - Peptone : 10g - Yeast Extract: 5g - Muối NaCl : 10g B VẬT LIỆU HÓA CHẤT TRONG TEST SINH HĨA VI KHUẨN Vật liệu, hố chất nhuộm bào tử - Dung dịch A: 10 ml dung dịch Fuchsin kiềm bão hoà ethanol (khoảng 10%) 100 ml dung dịch acid carbolic (phenol) 5% (trong nước) Trộn với (chuẩn bị trước dùng) - Dung dịch B: 100 ml Etanol 95%, ml HCl đậm đặc 49 PHỤ LỤC 02 MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ CÁC CHI NẤM MỐC GÂY BỆNH TRÊN CÂY CÀ CHUA VÀ HÌNH ẢNH KHÁNG NẤM CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN Hình Các chủng nấm phân lập đƣợc từ mẫu bệnh cà chua Hình khuẩn lạc bào tử chi Phytophtora mơi trƣờng PDA Hình khuẩn lạc bào tử chi Curvularia môi trƣờng PDA 50 Hình khuẩn lạc bào tử chi Fusarium mơi trƣờng PDA Hình Hình ảnh đối kháng nấm Phytophthora sp chủng VK10 Hình Hình ảnh đối kháng nấm Phytophthora sp chủng VK2 VK8 51 MỘT SỐ HÌNH ẢNH THỬ HOẠT TÍNH SINH LÝ, SINH HĨA CỦA CHỦNG VK15 Hình Khả di động thử nghiệm VP chủng VK15 Hình Thử nghiệm Oxidase Catalase 52 ... sp gây bệnh sương mai cà chua Phân lập tuyển chọn 21 chủng vi khuẩn có khả đối kháng với nấm Phytophthora sp gây bệnh sương mai từ vùng đất trồng cà chua thành phố Đà Nẵng Trong có chủng vi khuẩn. .. Bacillus spp vào lĩnh vực nông nghiệp, tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Phân lập tuyển chọn vi khuẩn đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh sƣơng mai cà chua? ?? Mục tiêu Phân lập chủng nấm gây bệnh Phytophthora. .. mơ tả cà chua 1.2 Triệu chứng bệnh sương mai cà chua 1.3 Triệu chứng bệnh sương mai cành chua 1.4 Triệu chứng bệnh sương mai cà chua 3.1 Triệu chứng bệnh mốc sương nấm Phytophthora sp cà chua