Nghiên cứu sản xuất cây giống khoai lang hoàng long ipomoea batatas l lam sạch bệnh đốm lông chim bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG ======== LÊ VĂN TÂM NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG KHOAI LANG HOÀNG LONG (IPOMOEA BATATAS L LAM.) SẠCH BỆNH ĐỐM LÔNG CHIM BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG KHĨA LUẬN TƠT NGHIỆP Đà Nẵng - Năm 2016 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG ======== NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG KHOAI LANG HOÀNG LONG (IPOMOEA BATATAS L LAM.) SẠCH BỆNH ĐỐM LÔNG CHIM BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG Ngành: Cơng nghệ sinh học Người hướng dẫn: ThS Trần Quang Dần Niên khóa: 2012 – 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn ThS Trần Quang Dần Các kết trình bày khóa luận trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Sinh viên thực Lê Văn Tâm LỜI CẢM ƠN Đến với Bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, việc trực tiếp tiến hành thí nghiệm mơi trường đầy đủ thiết bị đại, học hỏi thêm nhiều kiến thức bổ sung cho phần kiến thức lý thuyết Qua đó, thân tơi thêm u thích giới sinh học, có tư khoa học tốt trưởng thành nhiều Để hoàn thành khóa học thực đề tài, ngồi nỗ lực thân tơi cịn nhận giúp đỡ thầy giáo, gia đình, tập thể cá nhân bạn bè Nhân dịp cho phép bày tỏ lời cảm ơn tới: Th.S Trần Quang Dần, thầy giáo hướng dẫn khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ks Trần Thị Quỳnh Nga – Phịng thí nghiệm tổng hợp, Viện KHKT Nông nghiệp Bắc Trung Bộ, người giúp đỡ nhiều việc làm quen phát triển kĩ thực hành thí nghiệm suốt q trình tơi thực đề tài khố luận Tập thể thầy giáo, giáo khoa Sinh – Môi trường giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi hồn thành chương trình học tập hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, anh chị em động viên tạo điều kiện thời gian, kinh phí cơng sức để tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Dù có nhiều cố gắng khố luận tốt nghiệp tránh khỏi hạn chế thiếu sót Tơi mong nhận đóng góp ý kiến thầy bạn bè để khố luận hồn chỉnh Đà Nẵng, tháng năm 2016 Sinh viên thực Lê Văn Tâm DANH MỤC VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4 Diclorophenoxyacetic acid ABA : Abscisic acid ADN : Acid deoxiribonucleic BA : 6-benzyl adenine CIP : Trung tâm khoai quốc tế CMV : Cucumber mosaic virus Cs : Cộng CT : Công thức Ctv : Cộng tác viên ĐC : Đối chứng ĐNB : Đông Nam Bộ GA3 : Gibberellin A3 IAA : Acid β-indol-acetic KIN : Kinetin KT : Khử trùng KTST : Kích thích sinh trưởng KHKT : Khoa học Kỹ thuật MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid NST : Nhiễm sắc thể SPCV : Sweet potato caulimo virus SPFMV : Sweet potato feathery mottle virus SPLV : Sweet potato latent virus SPVMV : Sweet potato vein mosaic virus TDZ : Thidiazuron MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu khoai lang Hoàng Long 1.1.1 Đặc điểm sinh học 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng phát triển 1.1.4 Giá trị khoai lang Hoàng Long 1.2 Tổng quan nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.2 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 1.2.3 Điề u kiê ̣n nuôi cấy 13 1.2.4 Môi trường nuôi cấ y 14 1.3 Giới thiệu bệnh vi-rút đốm lông chim 18 1.3.1 Giới thiệu vi-rút đốm lông chim 18 1.3.2 Nguyên nhân gây bệnh triệu chứng bệnh 18 1.3.2 Hiện trạng nhiễm bệnh vi-rút khoai lang 19 1.3.3 Biện pháp phòng trừ 20 1.4 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 20 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 20 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 23 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Chọn vật liệu nuôi cấy 26 2.2.2 Khử trùng mẫu cấy 26 2.2.3 Tái sinh nhân nhanh chồi từ đỉnh sinh trưởng 27 2.2.4 Sàng lọc bệnh (trước chuyể n sang giai đoa ̣n nhân nhanh chồ i) 27 2.2.5 Tạo hoàn chỉnh 28 2.3 Xử lý thống kê 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 29 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng (HgCl2 0,1%) đến mẫu cấy 29 3.2 Ảnh hưởng nồng độ GA3 đến khả tái sinh nhân nhanh chồi 30 3.3 Sàng lọc dòng khoai lang bệnh 33 3.4 Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả tạo hoàn chỉnh 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 DANH MỤC BẢNG BIỂU Tên bảng Bảng 3.1 Trang Ảnh hưởng thời gian khử trùng (HgCl2 0,1%) đến mẫu cấy 28 Khả tái sinh nhân nhanh chồi 3.2 mơi trường có bổ sung GA3 nồng độ khác 30 3.3 Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả rễ chồi in vitro 34 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 2.1 Khoai lang Hồng Long 25 2.2 Chồi khoai dùng để vào mẫu 25 2.3 Sơ đồ thí nghiệm 25 Chồi tái sinh từ đỉnh sinh trưởng môi trường MS 3.1 (A): Đỉnh sinh trưởng vào mẫu; Sự tái sinh chồi từ đỉnh 30 sinh trưởng sau tuần (B) 10 tuần (C) Chồi tái sinh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy môi 3.2 trường bổ sung GA3 nồng độ khác A: không bổ 32 sung GA3; B: 0,5 ppm; C: 1,0 ppm; D:1,5 ppm; E: 2,0 ppm Sự nhân chồi từ mẫu đoạn thân chứa mắt chồi môi 3.3 trường bổ sung GA3 nồng độ khác sau tuần nuôi 33 cấy CT0: không bổ sung GA3; CT1: 0,5 ppm; CT2: 1,0 ppm; CT3: 1,5 ppm; CT4: 2,0 ppm Sự nhân chồi từ mẫu đoạn thân chứa mắt chồi môi trường 3.3 bổ sung GA3 nồng độ khác sau tuần CT0: không 33 bổ sung GA3; CT1: 0,5 ppm; CT2: 1,0 ppm; CT3:1,5 ppm; CT4: 2,0 ppm Phát vi-rút SPFMV RT-PCR (HL1), (HL2) dòng 3.4 bệnh; (HL3) dòng bị nhiễm vi-rút; (M) Marker; (ĐC-) 34 đối chứng âm; (ĐC+) đối chứng dương Chồi khoai lang in vitro cho rễ tạo hồn chỉnh 3.5 mơi trường bổ sung IAA nồng độ khác sau tuần CT1: không bổ sung IAA; CT2: 0,3 ppm; CT3: 0,5 ppm; CT4: 0,7 ppm; CT5: 1,0 ppm 36 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Giống khoai lang Hoàng Long (Ipomoea batatas L Lam.) giống khoai lang trồng phổ biế n Việt Nam du nhập từ Trung Quố c vào Viê ̣t Nam năm 1968 Giố ng trường Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm TP Hồ Chí Minh tuyể n cho ̣n, giới thiê ̣u Bô ̣ Nông nghiê ̣p và Phát triể n Nông thôn công nhâ ̣n giố ng vào năm 1981 [11] Khoai lang Hồng Long khơng lương thực quan trọng cho người, thức ăn cho gia súc mà sản phẩm mặt hàng công nghiệp thực phẩm, như: chế biến rượu, cồn… Tinh bột khoai lang cịn dùng cơng nghiệp thực phẩm nguồn nguyên liệu tốt cho cơng nghiệp sản xuất enzyme amylase Ngồi ra, khoai lang cịn vị thuốc có tác dụng nhuận tràng, bổ tì vị [10] Tuy nhiên, sản lượng chất lượng khoai lang thấp bấp bênh, nhiều ngun nhân, như: sử dụng giống thối hố, quan tâm đến biện pháp canh tác, điều kiện tự nhiên khắc nghiệt thời tiết phá hoại sâu bệnh hại [9] Giống khoai lang nhiều vùng canh tác địa phương đối mặt với nguy nhiễm bệnh vi-rút kí sinh, làm ảnh hưởng đến nguồn giống suất trồng Hiện bệnh vi-rút chủ yếu khoai lang, như: đốm lông chim (SPFMV), khảm tĩnh mạch (SPVMV), tiềm ẩn (SPLV) [13] Theo kết điều tra trường ĐH Nông nghiệp I Viện KHKT Nông nghiệp Việt Nam (1994), nước ta xuất bệnh vi-rút đốm lông chim (SPFMV), loại vi-rút gây bệnh thuộc nhóm Poty-virút [4] Triệu chứng bệnh thể rõ lá, bệnh có màu xanh nhạt xen kẽ vết khảm xanh sẫm, gân có màu vàng sáng, phiến co hẹp mép có màu xanh vàng Bệnh vi-rút đốm lơng chim nhiễm giống khoai Lim, Hoàng Long Muồng đỏ với tỷ lệ 10-18% [15] Trong năm vừa qua, diện tích sản lượng khoai lang Việt Nam có xu hướng giảm dần, phần lớn giống khoai lang nước ta bị nhiễm bệnh vi-rút gây làm cho suất củ khoai lang chưa cải thiện nhiều [8] Diện tích trồng khoai lang nước liên tục giảm, từ 181.200 (năm 2006) đến 31 Bảng 3.2 Khả tái sinh nhân nhanh chồi mơi trường có bổ sung GA3 nồng độ khác Tái sinh chồi Nồng độ Kí hiệu GA3 (ppm) Số chồi tái sinh (chồi) Nhân nhanh chồi Chiều Số cao trung trung bình/chồi bình (lá) thân Chiều Hệ số nhân chồi Số cao trung trung bình/chồi bình (lá) thân (cm) (cm) CT0 - 2,67c 4,20c 3,07c 4,07e 6,00e 2,80d CT1 0,5 4,47b 6,00b 4,90b 7,27b 9,00b 6,17b CT2 1,0 5,80a 7,53a 6,33a 11,07a 12,73a 9,67a CT3 1,5 2,80c 4,40c 3,10c 5,67c 7,47c 4,63c CT4 2,0 1,73d 3,33d 2,07d 4,80d 6,67d 3,17d Ghi chú: Các chữ cột thể sai khác có ý nghĩa thống kê nhỏ giá trị trung bình theo Duncan’s test (p < 0,05) Kết từ Bảng 3.2 cho thấy, kết hợp GA3 nồng độ khác với 0,3 ppm IAA mang lại ảnh hưởng đáng kể đến khả tái sinh nhân chồi khoai lang Hoàng Long so với môi trường không bổ sung chất KTST (Bảng 3.2) Số chồi tái sinh hệ số nhân chồi thay đổi phụ thuộc vào nồng độ GA3 Đối với tái sinh chồi, tăng nồng độ GA3 từ đến 1,0 ppm (CT2) khả tái sinh tăng dần đạt hiệu tốt nồng độ 1,0 ppm (5,80 chồi); nhiên, nồng độ GA3 tiếp tục tăng số chồi tái sinh lại giảm, đạt thấp nồng độ 2,0 ppm (1,73 chồi), khả tái sinh thấp mẫu nuôi cấy môi trường CT0 Quy luật thay đổi diễn tương tự giai đoạn nhân nhanh chồi môi trường khảo sát (Bảng 2) Hệ số nhân chồi đạt cao mơi trường CT2: 11,07 với số trung bình/chồi đạt 12,73 chiều cao trung bình thân đạt 9,67 cm; đó, khả nhân nhanh chồi thấp thu môi trường CT0 với hệ số nhân chồi đạt 4,07 Từ kết giải thích 32 GA3 có tác dụng kích thích kéo dài tế bào Nhưng nồng độ GA3 tăng lên cao ức chế sinh trưởng tế bào, làm giảm hiệu nhân nhanh [37], [47], [52] B A D C E Hình 3.2 Chồi tái sinh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy môi trường bổ sung GA3 nồng độ khác sau tuần (A): không bổ sung GA3; (B): 0,5 ppm; (C): 1,0 ppm; (D):1,5 ppm; (E): 2,0 ppm Đã có cơng trình nghiên cứu khác đối tượng khoai lang sử dụng môi trường MS chất KTST để khảo sát khả tái sinh chồi Chẳng hạn, nghiên cứu Nguyễn Lý Anh cộng (2003) đối tượng khoai lang Chiêm dâu cho thấy môi trường MS bổ sung 1,0 ppm BA 0,5 ppm IAA cho hiệu tái sinh chồi cao [1] Kiểu tái sinh khơng thơng qua q trình tạo phơi soma số công bố trước [39] Tương tự, nghiên cứu Geleta Dugassa cộng (2011) giống khoai Awassa-83 cho thấy, chồi tái sinh từ đỉnh sinh trưởng tốt môi trường chứa 1,0 ppm GA + 0,01 ppm NAA với tỉ lệ mẫu cảm ứng đạt 66,67% [37] 33 CT0 CT1 CT2 CT3 CT4 Hình 3.3 Sự nhân chồi từ mẫu đoạn thân chứa mắt chồi môi trường bổ sung GA3 nồng độ khác sau tuần nuôi cấy CT0: không bổ sung GA3; CT1: 0,5 ppm; CT2: 1,0 ppm; CT3: 1,5 ppm; CT4: 2,0 ppm CT0 CT1 CT2 CT3 CT4 Hình 3.4 Sự nhân chồi từ mẫu đoạn thân chứa mắt chồi môi trường bổ sung GA3 nồng độ khác sau tuần nuôi cấy CT0: không bổ sung GA3; CT1: 0,5 ppm; CT2: 1,0 ppm; CT3: 1,5 ppm; CT4: 2,0 ppm 3.3 Sàng lọc dòng khoai lang bệnh Kỹ thuật RT-PCR ứng dụng rộng rãi lĩnh vực chẩn đoán phát tác nhân gây bệnh có vật chất di truyền RNA [18] Để sàng lọc dòng khoai lang vi-rút, tiến hành thực phản ứng khuếch đại RT-PCR sử dụng cặp mồi (CI-F/R) dò tìm gen đặc hiệu vi-rút đốm lơng 34 chim Sau kết thúc phản ứng tiến hành điện di agarose 1% cho kết hình 3.4 Kết phản ứng khuếch đại RT-PCR (Hình 3.4) cho thấy, mẫu khoai lang (HL1, HL2, HL3) giám định có mẫu HL1, HL2 khơng xuất band mẫu HL3 có xuất band có kích thước 700 bp ứng với vạch band mẫu đối chứng dương, chứng tỏ mẫu khoai lang HL3 có xuất virút đốm lơng chim (SPFMV) Nghiên cứu Kokkinos cs (2006) đối tượng khoai lang sử dụng cặp mồi CI-F/R để xác định bệnh vi-rút đốm lông chim tiến hành thực phản ứng RT-PCR sản phẩm phản ứng sau điện di cho vạch band có kích thước 700 bp [42] Kết nghiên cứu chúng tơi tương tự Hình 3.4 Phát vi-rút SPFMV RT-PCR (HL1), (HL2) dòng bệnh; (HL3) dòng bị nhiễm vi-rút; (M) Marker; (ĐC-) đối chứng âm; (ĐC+) đối chứng dương 3.4 Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả hình thành rễ Auxin nhóm hc mơn thực vật nồng độ cao kích thích tạo sơ khởi rễ có ảnh hưởng kích thích mạnh kéo dài tế bào chồi [ 44] Để lựa chọn nồng độ IAA thích hợp cho giai đoạn rễ chồi in vitro, bổ sung chất KTST nồng độ khác (0 ppm; 0,3 ppm; 0,5 ppm; 0,7 ppm 35 ppm) vào môi trường nuôi cấy Kết đánh giá sau tuần ni cấy trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả rễ chồi in vitro Các tiêu theo dõi Kí hiệu IAA (ppm) Số chồi rễ (chồi) Số rễ trung bình/chồi (rễ) Chiều dài rễ trung bình(cm) CT0 - 36 2,20d 1,67d CT1 0,3 45 3,93c 5,80c CT2 0,5 45 6,27a 12,70a CT3 0,7 45 4,73b 6,53b CT4 1,0 45 3,47c 6,27bc Ghi chú: Các chữ cột thể sai khác có ý nghĩa thống kê nhỏ giá trị trung bình theo Duncan’s test (p < 0,05) Kết từ bảng 3.3 cho thấy, kết hợp 1,0 ppm GA3 với IAA nồng độ khác mang lại ảnh hưởng đáng kể đến khả tạo rễ khoai lang Hoàng Long so với môi trường không bổ sung chất KTST (Bảng 3.3) Chiều dài rễ trung bình số rễ trung bình/cây thay đổi phụ thuộc vào nồng độ IAA Khi tăng nồng độ IAA từ đến 0,5 ppm (CT2) khả rễ tăng dần đạt hiệu tốt nồng độ 0,5 ppm (số rễ trung bình 6,27 rễ chiều dài rễ trung bình 12,7 cm); nhiên, nồng độ IAA tiếp tục tăng số rễ trung bình lại giảm đạt giá trị thấp nồng độ 1,0 ppm (3,47 rễ) cao mẫu nuôi cấy môi trường CT0 Từ kết giải thích IAA có tác dụng kích thích tạo rễ Nhưng nồng độ IAA tăng lên cao ức chế sinh trưởng tế bào, làm giảm hiệu tạo rễ [37], [47], [52] Một số nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả tạo rễ khoai lang Theo nghiên cứu Romuald Doliński cộng (2013) cơng bố mơi trường MS có bổ sung ppm GA3 0,1 ppm KIN 36 cho 5,85 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình 22,6 cm cịn mơi trường 0,5 ppm IAA cho 1,65 rễ/chồi chiều dài rễ trung bình 18,1 cm Điều chứng tỏ GA3 ngồi tác dụng kéo dài thân cịn tăng chiều dài rễ [50] Hình 3.5 Chồi khoai lang in vitro cho rễ tạo hoàn chỉnh môi trường bổ sung IAA nồng độ khác sau tuần nuôi cấy CT0: không bổ sung IAA; CT1: 0,3 ppm; CT2: 0,5 ppm; CT3: 0,7 ppm; CT4: 1,0 ppm 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu trên, rút số kết luận sau: 1.1 Khử trùng chồi khoai lang Hoàng Long với dung dịch HgCl2 0,1 % thời gian 10 phút lần 1; phút lần cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao 73,33% 1.2 Phản ứng khuếch đại RT-PCR cặp mồi (CI-F/R) dị tìm gen đặc hiệu vi-rút đốm lơng chim sử dụng để sàng lọc dịng khoai lang vi-rút 1.3 Mơi trường phù hợp cho trình tái sinh nhân nhanh chồi khoai lang môi trường bổ sung 1,0 ppm GA3 (số chồi tái sinh 5,8 chồi, hệ số nhân chồi 11,07) 1.4 Môi trường phù hợp sử dụng để tạo khoai lang hoàn chỉnh mơi trường có bổ sung 1,0 ppm GA3 0,5ppm IAA ( cho số rễ trung binh/chồi 6,27 rễ chiều dài rễ: 12,7 cm) Kiến nghị 2.1 Tiếp tục khảo sát thêm số điều kiện mơi trường ni cấy in vitro khác để hồn thiện quy trình nhân giống in vitro giống khoai lang Hồng Long kỹ thuật ni cấy đỉnh sinh trưởng 2.2 Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển khoai lang đưa vườn ươm 2.3 Thí nghiệm đưa đồng ruộng để so sánh giống in vitro giống địa phương 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch (2003), Nghiên cứu tái sinh in vitro số giống khoai lang Việt Nam, Báo cáo khoa học hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc 2003, Nxb Khoa học kỹ thuật, tr.735-739 [2] Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Cơng nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội [3] Ngơ Xn Bình, Bùi Bảo Hồn, Nguyễn Thị Th Hà (2003), Giáo trình cơng nghệ sinh học, NXB Nông nghiệp [4] Hà Việt Cường (2010), Virus thực vật, phytoplasma viroid, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, NXB Nông nghiệp [5] Mai Vũ Duy, Nguyễn Chí Dũng, Võ Thị Huyền Trân (2015), Khảo sát ảnh hưởng Benzyadenine, Kinetin, Gibberelic acid đến tái sinh chồi nhân chồi khoai lang tím Nhật (Ipomoea batatas(L.) Lam) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Tạp chí Khoa học đại học An Giang Quyển [6] Ưng Định (1995), Tăng suất khoai lang, NXB Nông nghiệp [7] Mai Thạch Hoành, Nguyễn Thị Lan (2003), Kết nghiên cứu số giống khoai lang vùng đất cát biển Thanh Hóa vụ Đơng, vụ Xn 2000-2001, Tuyển tập cơng trình khoa học kỹ thuật Nơng nghiệp, Viện KHNN Việt Nam, NXB nông nghiệp, Hà Nội [8] Trịnh Thị Thanh Hương (2013), "Kết bước đầu phục tráng giống khoai lang Hồng long Ninh Bình", Tạp chí sở khoa học cơng nghệ Ninh Bình 01-2013 [9] Nguyễn Thị Trương Huyền (2009), Nghiên cứu bổ sung Chitosan oligomer nuôi cấy mô khoai lang cao sản Nhật Bản, Đại học Tây Nguyên [10] Hoàng Kim (2009), Bài giảng lương thực, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh [11] Đinh Thế Lộc (1977), Kỹ thuật canh tác Khoai lang, NXB Nông nghiệp, Hà Nội [12] Đinh Thế Lộc (1984), Cây Khoai lang, NXB Nơng nghiệp 39 [13] Nguyễn Hồng Lộc (2007), Nhập môn Công nghệ sinh học, NXB Đại học Huế [14] Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào Nxb Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh [15] Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình Bệnh chuyên khoa, Trường Đại học Nông nghiệp 1, Hà Nội [16] Dương Minh (1999), Giáo trình hoa màu, Khoa nông nghiệp, Đại học Cần Thơ [17] Trịnh Xuân Ngọ Đinh Thế Lộc (2006), Cây có củ kỹ thuật thâm canh Khoai lang, NXB Lao động xã hội [18] Dương Tấn Nhựt (2011), Công nghệ sinh học thực vật, Tập 1: Nghiên cứu ứng dụng, Vol 1, TP Hị Chí Minh, NXB Nơng nghiệp [19] Dai Peter, Tơn Phan Hữu, Hồng Mai Thạch cs (2001), Hướng dẫn sử dụng khoai lang trồng khác chăn nuôi lợn miền Bắc, miền Trung Việt Nam, NXB Nông nghiệp [20] Tổng cục thống kê (2014), Kết tổng điều tra nông thôn, nông nghiệp thủy sản năm 2014, NXB thống kê [21] Nguyễn Sỹ Tuấn, Hứa Mỹ Ngọc (2008), "Sự phát sinh phơi vơ tính Khoai lang (Ipompea batatas L.) ống nghiệm", Tạp chí khoa học 1(12) [22] Nguyễn Mỹ Uyên (2007), "Khảo sát tăng trưởng in vitro Khoai lang (Ipompea batatas L.) điều kiện chiếu sáng tự nhiên", Hội nghị khoa học cơng nghệ 2007 [23] Bùi Trang Việt (2000), Sinh lí thực vật đại cương, Phần - Phát triển, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [24] Đỗ Năng Vịnh (2002), Công nghệ sinh học trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội [25] Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 40 B Tài liệu tiếng Anh [26] Alconero, R., Castro, O (1975), "Culture method and apical and heat treatment to eliminate the sweet potato virus", Tropical Pest Management, 27(4), pp 452-454 [27] Belarmino, MM., Abe, T., Sasahara, T (1993), "Shoot formation from protoplast-derived calli of sweet potato and its wild relatives and the initiation of somatic hybrid.", Japan J Breed, 43 (Suppl 2), pp 15-19 [28] Benisheikh, A., G, A., Zainab, M., Aliyu, Zainab Tamus., Audu, Abdullahi., Mala, Modu (2013), Virus free plantlets production of sweet potato (ipomea batata (l.) lam) through tissue cultivation and meristem culture, Journal of Biological Sciences and Bioconservation, Vol 5, No 2, 2013, pp 1-7 [29] Castro, O., De Andrade, AG (1995) Meristem culture of sweet potato (Ipomoea batatas), Pesquisa Agropecuária Brasileira Brasília, No 30, pp 917922 [30] Dense S., Dagnino, Maria, Luiza (1991), Effect of gibberellic acid on Ipomoea batatas regeneration from meristem culture, Peaq, agropec, bras, No 26(2), pp 259-262 [31] Dessai AP., Gousukonda, RM., Blay, E (1995), Plant regeneration of sweetpotato (Ipomoea batatas L.) from leaf explants in vitro using a two-stage protocol, Sci Hortic, Vol 62(4), pp 217-224 [32] Hettiarachchi, A (1988), Tissue culture and meristem culture in sweet potato (Ipomea batatas (L.) Lam.) A report by ARC, pp 1–7 [33] Hwang, L., Skirvin, M., Casyao, J., Bouwkamp, J (1983), Adventitous shoot formation from sections of sweet potato grown in vitro, Scientia Horticulturae 20, pp 119-129 [34] Haberlandt, G (1902), Culturversuche mit isolierten Pflanzenzellen, Sitz-Ber Mat Nat Kl Kais Akad Wiss Wien, Vol 111, pp 69–92 [35] Hakkaart F.A., Quak, F (1964), Effect of heat treatment of young plants On freeing chrysanthemums from virus b by means of meristem culture, Neth J Plant Path 70 (1964): 154-157 41 [36] Gibson, R.W.; Mpembe, I.; Alicai, T.; Carey, E.E.; Mwanga, R.O.M.; Seal, S.E.; Vetten, H.J (February 1998) "Symptoms, aetiology and serological analysis of sweet potato virus disease in Uganda" Plant Pathology, 47 (1): 95–102 [37] Geleta, Dugassa., Tileye, Feyissa (2011), ” In vitro production of virus-free sweet potato [ipomoea batatas (l.) Lam] by meristem culture and thermotherapy” , Ethiop J Sci., Vol 34(1), pp 17–28, 2011 [38] Goodwin P.B (1966), An improve medium for the rapid of isolated potato buds, J Exp Bot., No 17, pp 590-595 [39] Gupta, P.K., Mascarenhas, A.F., Jagannathan, V (1981), Tissue culture of forest trees–clonal propagation of mature trees of Eucalyptus citriodora Hook by tissue culture, Plant Sci Lett, 20,pp 195–201 [40] Iftekhar, Alam , Shamima, Akhtar Sharmin., Mst Kamrun, Naher., Jahangir M., Anisuzzaman M., Firoz Alam, Mohammad (2010), Effect of growth regulators on meristem culture and plantlet establishment in sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam.], POJ, Vol 3(2), pp 35-39(2010) [41] Jones, O:P., Zimmerman, R.H., Fordham, I.M., Hopgood, M.E (1985), Propagation in vitro of some dwarf apple trees J Hort Sci 60: 141–144 [42] Kokkinos, CD., Clark, CA (2006), “Real-time PCR assays for detection and quantification of sweet potato viruses”, Plant Disease, Vol 90, pp 783-788 [43] Liu, J.R., Cantliffe, D.J (1984), Somatic embryogenesis and plant regeneration in tissue cultures of sweet potato (Ipomoea batatas Poir.), Plant Cell Rep, No 3, pp 112-115 [44] Liu, Q C (1998) “An efficiency system of embryogenenic suspension culture and plant regeneration in sweetpotato, Impact on a changing world” Iternational potato center program report, 1997-1998, pp 265-267 [45] Mervat, M., El Far, M., Ashoub, A (2009), Utility of Thermotherapy and meristem Tip for Freeing Sweetpotato from Viral Infection, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, Vol 3(1), pp 153-159 [46] Miller, CO., Skoog, F., Okumura, FS., von Saltza, MH., Strong, FM (1955) Structure and synthesis of kinetin, J Am Chem Soc, Vol 78, pp 2662–2663 42 [47] Murashige T., Skoog F A (1962), “A revised medium for rapid growth and biossays with tobaco tissue culture”, Physiol Plant, Vol 15, pp 473-479 [48] Otani, M., T Shimada (1996), Efficient embryogenic callus formation in sweet potato (Ipomoea batatas L Lam.), Breed Sci., Vol 46, pp 257-260 [49] Over De Linden, A.J & Elliott, R.F (1971), Virus infection in Ipomoea batatas and a method for its elimination, New Zealand Journal of Agricultural Research Volume 14, Issue 3, pp: 720-724 [50] Romuald, D., Olek, A (2013), “Micropropagation of sweet potato (Ipomoea batatas (l.) lam.) from node explants”, Acta Sci Pol., Hortorum Cultus, Vol 12(4) 2013, pp 117-127 [51] Sihachakr, D., Haïcour R., Cavalcante Alves J.M., Umboh I., Nzoghé D., Servaes A., and Ducreux G (1997), Plant regeneration in sweet potato (Ipomoea batatas L., Convolvulaceae), Euphytica, No 96, pp 143-152 [52] Thorpe, Trevor A (1994), “Morphogenesis and regeneration”, Plant cell and tissue culture Springer, pp 17-36 [53] Vieitez, A.M., Carmen San-Jose, M and Vieitez, E (1985), In vitro plantlet regeneration from juvenile and mature Ouercus robur L., J Hort Sci, 60:99– 106 [54] Vine, S.J., Jones, 0.P (1969), The culture of shoot tips of hop (Humulus lupulus L.) to eliminate viruses, Journal of Horticultural Science 50(1): 151160 [55] Yamaguchi, A (1974), Somatic embryogenesis and plant regeneration in tissue cultures of sweet potato (Ipomea batatas Poir.), Plant Cell Reports., Vol 3(3), pp 112-115 [56] Walls, R., Egnin M., Prakash CS (1996), Genetic transformation of sweetpotato with chitinase and glucanase genes for fungal resistance, World Congress on In Vitro Biology, June 22-27, 1996 San Francisco PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Hình Đỉnh sinh trưởng nuôi cấy môi trường MS Hình Chồi đươc tái sinh mơi Hình Chồi đươc nhân nhanh trường MS + ppm GA3 + 0,3 ppm IAA môi trường MS + ppm GA3 + 0,3 ppm IAA Hình Chồi khoai lang rễ môi trường MS + ppm GA3 + 0,5 ppm IAA Hình Chồi khoai lang in vitro cho rễ tạo hồn chỉnh mơi trường bổ sung IAA nồng độ khác sau tuần nuôi cấy CT0: không bổ sung IAA; CT1: 0,3 ppm; CT2: 0,5 ppm; CT3: 0,7 ppm; CT4: 1,0 ppm BẢNG THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN MURASHIGE – SKOOG (MS, 1962) Stock MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 Hóa chất Thành phần (mg/L) KNO3 1900 KH2PO4 170 NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 CaCl2.2H2O 440 H3BO3 6,2 MnSO4.4H2O 22,3 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4 5H2O 0,025 ZnSO4.4H2O 8,6 Na2MoO4.2H2O 0,25 KI 0,83 FeSO4.7H2O 27,8 Na2-EDTA 37,3 Glycine Thiamine HCl 0,1 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Dung tích dùng cho lít mơi trường 20 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml ... KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG ======== NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG KHOAI LANG HOÀNG LONG (IPOMOEA BATATAS L LAM. ) SẠCH BỆNH ĐỐM L? ?NG CHIM BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG Ngành: Công nghệ sinh. .. ̣nh đốm l? ?ng chim kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng? ?? Mục tiêu đề tài Tạo nguồn giớ ng khoai lang Hồng Long sa ̣ch bê ̣nh đốm l? ?ng chim kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nội dung nghiên cứu. .. liệu nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu khoai lang Hoàng Long (Ipomoea batatas L Lam. ) - Vật liệu nghiên cứu chồi chứa đỉnh sinh trưởng l? ?́ y từ củ giố ng Hoàng Long (sau 12 – 15 tuần ủ) đã