Luận văn Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm: Đánh giá khả năng phân hủy propanil của dòng vi khuẩn phân lập từ đất đã sử dụng thuốc diệt cỏ

Mục đích của Luận văn là phân lập được chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy propanil từ đất và đánh giá ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến sự phân hủy propanil của chúng từ đó áp dụng vào thực tế trong nông nghiệp và xử lý môi trường. Mời các bạn cùng tham khảo!

H C VI N KHOA H C VÀ CÔNG NGH  Ọ Ệ Ọ Ệ

­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­

Đ u Th  H ng Ng cậ ị ồ ọ

ĐÁNH GIÁ KH  NĂNG PHÂN H Y PROPANIL C A DÒNGẢ Ủ Ủ  

VI KHU N PHÂN L P T  Đ TẨ Ậ Ừ Ấ  ĐàS  D NG THU C DI TỬ Ụ Ố Ệ  

CỎ

  H C VI N KHOA H C VÀ CÔNG NGHỌ Ệ Ọ Ệ

­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­

Đ u Th  H ng Ng cậ ị ồ ọ

ĐÁNH GIÁ KH  NĂNG PHÂN H Y PROPANIL C A DÒNGẢ Ủ Ủ  

VI KHU N PHÂN L P T  Đ TẨ Ậ Ừ Ấ  ĐàS  D NG THU C DI TỬ Ụ Ố Ệ  

CỎ

LU N VĂN TH C SĨ CÔNG NGH  SINH H CẬ Ạ Ệ Ọ

NGƯỜI HƯỚNG D N KHOA H CẪ Ọ

nh ng n i dung đữ ộ ược trình bày trong lu n văn này là hoàn toàn trung th c.ậ ự  

Nh ng s  li u, b ng bi u ph c v  cho vi c phân tích và d n d t đ  tài nàyữ ố ệ ả ể ụ ụ ệ ẫ ắ ề  

được thu th p t  các ngu n tài li u khác nhau đậ ừ ồ ệ ược ghi chú trong m c tài li uụ ệ  tham kh o ho c chú thích ngay bên dả ặ ưới các b ng bi u.ả ể  

Ngoài ra, đ i v i các tài li u di n gi i đ  làm rõ thêm các lu n đi m đã phânố ớ ệ ễ ả ể ậ ể  tích và trích d n trong ph n ph  l c cũng đẫ ầ ụ ụ ược chú thích ngu n g c d  li u.ồ ố ữ ệ

M i sao chép không h p l , quy ph m quy ch  đào t o hay gian trá tôi xin ch uọ ợ ệ ạ ế ạ ị  hoàn toàn trách nhi mệ

Hà N i, ngày 25 tháng 09 năm 2020ộ

Tác giả

Đ u Th  H ng Ng cậ ị ồ ọ

trình l a ch n và th c hi n đ  tài nghiên c u nàyự ọ ự ệ ề ứ  Th y và cô ầ đã t n tình ch  b oậ ỉ ả  

và hướng d n tôi tìm ra hẫ ướng nghiên c u,  ứ cách  ti p c n th c t , tìm ki m tàiế ậ ự ế ế  

li u, ệ tìm hi u và ể gi i quy t v n đả ế ấ ề, nh  đó tôi m i có th  hoàn thành lu n văn caoờ ớ ể ậ  

h c c a mình.ọ ủ

Tôi xin c m  n H c Vi n Khoa H c và Công ngh , phòng Đào t o các th yả ơ ọ ệ ọ ệ ạ ầ  giáo, cô giáo và cán b  thu c ộ ộ Khoa Công ngh  Sinh ệ h c t i H c Vi n Khoa ọ ạ ọ ệ h c vàọ  Công ngh  ­ Vi n Hàn Lâm Khoa h c và Công ngh  Vi t Nam đã nhi t tình gi ngệ ệ ọ ệ ệ ệ ả  

d y giúp đ  tôi trong quá trình h c t p t i trạ ỡ ọ ậ ạ ường. 

Ngoài ra, đ  nghiên c u và th c hi n đ  tài tôi còn nh n để ứ ự ệ ề ậ ược nhi u sề ự quan tâm, góp ý, h  tr  quý báu tỗ ợ ừ cô Nguy n Th  Oanh ễ ị và các anh ch  ịt i trạ ườ  ng

Đ i ạ h c Đ ng Thápọ ồ  và Trung tâm phân tích Hóa h c, ọ Đ i ạ h c Đ ng Tháp.ọ ồ

Trong bài lu n, ch c h n không th  tránh kh i nh ng h n ch  và thi u sót.ậ ắ ẳ ể ỏ ữ ạ ế ế  Tôi mong mu n s  nh n đố ẽ ậ ược nhi u đóng góp quý báu đ n t  các quý th y cô, banề ế ừ ầ  

c  v n đ  đ  tài đố ấ ể ề ược hoàn thi n h n n a và có ý nghĩa thi t th c áp d ng trongệ ơ ữ ế ự ụ  

th c ti n cu c s ng. ự ễ ộ ố

Tôi xin chân thành c m  n ả ơ  ! 

Danh m c b ngụ ả

M C L CỤ Ụ

M  Đ UỞ Ầ

Vi t Nam là m t nệ ộ ước nông nghi p, m i năm ngệ ỗ ười dân s  d ngử ụ  

m t lộ ượng l n thu c b o v  th c v t, trong đó có thu c ớ ố ả ệ ự ậ ố di tệ  c  Năm 2012ỏ  

lượng thu c b o v  th c v t đố ả ệ ự ậ ược s  d ng là 105.000 t n ử ụ ấ [1]. Theo C cụ  

B o v  th c v t ­ B  NN&PTNT, thu c tr  c  đả ệ ự ậ ộ ố ừ ỏ ượ ử ục s  d ng v i kho ngớ ả  19.000 t n m i năm. Do vi c l m d ng s  d ng thu c di t c  thấ ỗ ệ ạ ụ ử ụ ố ệ ỏ ườ  ngxuyên c a ngủ ười dân d n đ n các các ho t ch t c a chúng không nh ngẫ ế ạ ấ ủ ữ  

được phát hi n trong nệ ước b  m t, nề ặ ước ng m mà c  nầ ả ước u ng và cònố  

l ng đ ng trong các l p tr m tích ắ ọ ớ ầ [2­7]. Ngày nay, propanil là thành ph nầ  chính c a nhi u lo i thu c di t c  hi n đang l u hành   nủ ề ạ ố ệ ỏ ệ ư ở ước ta và trên 

th  gi i. ế ớ Thu c di t c ố ệ ỏ có ch a ho t ch tứ ạ ấ  propanil có tính ti p xúc, ch nế ọ  

l c cao dùng đ  di t các lo i c  mà không gây  nh họ ể ệ ạ ỏ ả ưởng đ n cây lúa nênế  

được người dân s  d ng nhi u. Propanil tr  c  ch  y u   giai đo n h uử ụ ề ừ ỏ ủ ế ở ạ ậ  

n y m m. Thu c tr  c  có ch a propanil n m trong s  20 lo i hóa ch tẩ ầ ố ừ ỏ ứ ằ ố ạ ấ  

được s  d ng ph  bi n nh t trong s  các lo i thu c b o v  th c v t sử ụ ổ ế ấ ố ạ ố ả ệ ự ậ ử 

d ng   Hoa K  cũng nh    nụ ở ỳ ư ở ước ta [8­9]. Propanil có công th c hóa h c làứ ọ  

C9H9Cl2NO, có đ  hòa tan trong nộ ước là 225 ppm   nhi t đ  25 ở ệ ộ oC. Propanil 

có đ c tính cao và khó phân h y trong t  nhiên. ộ ủ ự Các lo i thu c tr  c   nhạ ố ừ ỏ ả  

hưởng l n đ n s c kh e c ng đ ng, các loài sinh v t cũng nh  h  sinhớ ế ứ ỏ ộ ồ ậ ư ệ  thái. Đ c bi t, chúng  nh hặ ệ ả ưởng nghiêm tr ng đ n ngu n l i th y s n ọ ế ồ ợ ủ ả ở sông C u Long cũng nh  các n i khác trên th  gi i ử ư ơ ế ớ [10­11].   nhi u n i, cáỞ ề ơ  nuôi hay cá sông b  ch t do s  ô nhi m c a thu c tr  c  ị ế ự ễ ủ ố ừ ỏ Berg et al., 2001 

đã ti n hành ế kh o sát   Đ ng b ng sông C u Long ả ở ồ ằ ử cho th y, thu c tr  cấ ố ừ ỏ chi m 25% trong s  các lo i thu c b o v  th c v t đang đế ố ạ ố ả ệ ự ậ ượ ử ục s  d ng [8]

Vi c s  d ng hóa ch t này trong ho t đ ng s n xu t nông nghi p,ệ ử ụ ấ ạ ộ ả ấ ệ  

nh t là tr ng lúa d n đ n m t lấ ồ ẫ ế ộ ượng l n t n l u trong môi trớ ồ ư ường nước và trong đ t. Propanil đấ ược phát hi n trong 162 m u nệ ẫ ước tr ng lúa g o v iồ ạ ớ  

n ng đ  lên t i 0,03 mg/L. T i Brazil, lồ ộ ớ ạ ượng propanil trong nước được phát 

hi n lên đ n 3,6 g/L   khu v c s n xu t nông nghi p và nhi u n i khác cóệ ế ở ự ả ấ ệ ề ơ  

n ng đ  vồ ộ ượt xa m c cho phép ứ [12]. N ng đ  propanil trong nồ ộ ước ng mầ  sâu 20 dưới ru ng lúa   Italy cao nh t là ộ ở ấ 0,04 µg/L, và trong nước b  m tề ặ  dao đ ng t  0,1 đ n 0,228 µg/L  ộ ừ ế [2]  Ngoài ra, chúng còn được phát hi nệ  trong đ t ấ [13].   nỞ ước ta, năm 2013, nghiên c u c a ứ ủ Toan et al., (2013) đã 

phát hi n s  có m t c a propanil trong nệ ự ặ ủ ước ng m và nầ ước sinh ho t v iạ ớ  

n ng đ  0,05 và 0,02 μg/L ồ ộ [6]. M c dù n ng đ  này n m trong m c đ  choặ ồ ộ ằ ứ ộ  phép, nh ng ch a có kh o sát v  n ng đ  propanil trong nư ư ả ề ồ ộ ước b  m t cũngề ặ  

nh  nư ước u ng   nố ở ước ta. 

Propanil t n l u trong nồ ư ướ ảc  nh hưởng nghiêm tr ng đ n các loàiọ ế  

đ ng v t có xộ ậ ương s ng nh  chim, cá và các loài đ ng v t không xố ư ộ ậ ươ  ng

s ng ố [14]. Deuel et al., (1977) cho r ng,   trong nằ ở ước propanil gây ng  đ cộ ộ  

c p tính đ n sinh v t th y sinh, ngoài ra chúng còn gây tác đ ng m nh đ nấ ế ậ ủ ộ ạ ế  

t o và c  san hô ả ả [15]. Nghiên c u trứ ước đây c a Richardsủ  et al., (2001) cho 

th y, sau khi phun thu c tr  c , propanil có th  xâm nh p vào c  th  ngấ ố ừ ỏ ể ậ ơ ể ườ  iqua ti p xúc và hô h p ế ấ [16]. Đ c tính c a chúng gây  nh hộ ủ ả ưởng l n đ nớ ế  

s c kh e con ngứ ỏ ười cũng nh  các loài đ ng v t nh  gây t n h i t  bào ganư ộ ậ ư ổ ạ ế  

và th n, h  th ng tu n hoàn và mi n d ch ậ ệ ố ầ ễ ị [5, 17]

Chính vì tính đ c h i cũng nh  nh ng t n l u c a propanil trong môiộ ạ ư ữ ồ ư ủ  

trường,   vi c   tìm   ra   phệ ương   pháp   đ   phân   h y   chúng   là   c n   thi t.ể ủ ầ ế  

Konstantinou et al., (2001) cũng nh  González­Sánchez ư et al., (2014) đã sử 

d ng các bi n pháp hóa h c hay v t lý nh  s  d ng TiOụ ệ ọ ậ ư ử ụ 2 k t h p v i chi uế ợ ớ ế  

x  đ  phân h y propanil ạ ể ủ [18­19]. Tuy nhiên, các bi n pháp v t lý và hóa h cệ ậ ọ  

thường không th  hay khó áp d ng trong đ t. H n n a, bi n pháp đ t ti n,ể ụ ấ ơ ữ ệ ắ ề  

d  t o ta các ch t ô nhi m trung gian khác ễ ạ ấ ễ [20]. Trong khi đó, bi n phápệ  sinh h c, c  th  là s  d ng vi sinh v t là bi n pháp r  ti n, nhanh và hi uọ ụ ể ử ụ ậ ệ ẻ ề ệ  

qu  cao l i phân h y hoàn toàn đả ạ ủ ược propanil nên đượ ưc  a chu ng. Trênộ  

th  gi i đã có nh ng nghiên c u v  phân h y sinh h c c a h p ch tế ớ ữ ứ ề ủ ọ ủ ợ ấ  propanil cũng nh  các đ ng phân c a chúng ư ồ ủ [21­23]. Các vi sinh v t có thậ ể 

s  d ng ho t ch t này nh  là ngu n dinh dử ụ ạ ấ ư ồ ưỡng đ  sinh trể ưởng, qua đó 

gi m n ng đ  ho c phân h y hoàn toàn chúng trong môi trả ồ ộ ặ ủ ường

Xu t phát t  th c t  trên, ấ ừ ự ế lu n văn c a em ậ ủ đ  tài ề “Đánh giá kh  năngả  phân h y propanil c a dòng vi khu n phân l p t  đ tủ ủ ẩ ậ ừ ấ   đã s  d ngử ụ  thu c di t cố ệ ỏ” đ c ti n hànhượ ế  nh m ch nằ ọ  đ c các dòng vi khu n có khượ ẩ ả năng phân h y đủ ược propanil t t, góp ph n vào vi c gi m thi u ô nhi mố ầ ệ ả ể ễ  môi trường

M c tiêu nghiên c uụ ứ

Phân l p đậ ược ch ng vi khu n có kh  năng phân h y propanil t  đ tủ ẩ ả ủ ừ ấ  

và đánh giá  nh hả ưởng c a đi u ki n môi trủ ề ệ ường đ n s  phân h y propanilế ự ủ  

c a chúng t  đó áp d ng vào th c t  trong nông nghi p và x  lý môiủ ừ ụ ự ế ệ ử  

trường 

 Vi t Nam tuy s  d ng nhi u propanil nh ng chúng ta ch a s n xu t

được mà ph i nh p kh u đ  s n xu t thu c di t c  Hi n t i ch a th yả ậ ẩ ể ả ấ ố ệ ỏ ệ ạ ư ấ  

th ng kê nào v  s n lố ề ả ượng s n xu t hi n nay nh ng chúng là lo i thu cả ấ ệ ư ạ ố  

tr  c  đừ ỏ ược s  d ng nhi u nh t trong nhóm thu c di t c  có g c anilideử ụ ề ấ ố ệ ỏ ố  [9]

Quá trình s n xu t b ng t ng h p hóa h c nhân t o. Trong quy trìnhả ấ ằ ổ ợ ọ ạ  công nghi p, propanil đệ ượ ổc t ng h p qua các giai đo n b t đ u t  1,2­ợ ạ ắ ầ ừdichlorobenzene,   đ n   1,2­dichloro­4­nitrobenzene   1,2­dichloro­4­ếnitrobenzene được hydrogen hóa nhóm nitro v i s  xúc tác c a nickel t oớ ự ủ ạ  thành 3,4­dichloroaniline. Quá trình acyl hóa nhóm amine b ng propanoylằ  chloride t o thành propanil ạ [25]. Quá trình này được được th  hi n   hìnhể ệ ở  1.1. 

Hình 1  Các giai đo n bao g m các hóa ch t t o thành trong quá trình t ng ạ ồ ấ ạ ổ

h p propanil ợ [25]

1.1.2. Tính ch t v t lý và hóa h c c a propanilấ ậ ọ ủ

 Propanil có công th c hóa h c là Cứ ọ 9H9Cl2NO, và công th c hóa h cứ ọ  

được th  hi n   hình 1.2.   đi u ki n thể ệ ở Ở ề ệ ường, propanil là nh ng tinh thữ ể 

màu tr ng ho c n i nâu. Propanil ít hòa tan trong nắ ặ ơ ước nh ng hòa tan nhi uư ề  trong m t s  dung môi h u c  Chúng ít b c h i trong không khí và có mùiộ ố ữ ơ ố ơ  

s c. Các tính ch t v t lý khác đố ấ ậ ược mô t    b ng 1.1.ả ở ả

Hình 1  C u t o hóa h c c a propanil.ấ ạ ọ ủ

B ng 1. . Tính ch t v t lý c a propanil ả ấ ậ ủ [24]

Đ c tínhặ Đ n vơ ị S  li uố ệ

Kh i lố ượng phân tử g/mol  218,08

Áp su t b c h iấ ố ơ mPa   25ở  oC 0,0193

H  s  phân tán octanol/nệ ố ước logKOC   25ở  oC 2,29

H ng s  Henryằ ố Pa m3/mol 4,4×10­4

carbohydrate, t  đó kìm hãm s  phát tri n c a th c v t [26, 27].ừ ự ể ủ ự ậ

Cây lúa g n nh  không b   c ch  ho c  c ch  không đáng k  v iầ ư ị ứ ế ặ ứ ế ể ớ  propanil, nh ng h u h t các lo i c  d i đ u d  b  tiêu di t khi b  tác đ ngư ầ ế ạ ỏ ạ ề ễ ị ệ ị ộ  

c a propanil. S  ch n l c thu c tr  c  propanil là do ho t đ ng và phânủ ự ọ ọ ố ừ ỏ ạ ộ  

c  d i tr  nên kháng propanil.ỏ ạ ở

1.1.4. Các lo i thu c di t c  s  d ng propanilạ ố ệ ỏ ử ụ

Propanil là thành ph n chính c a nhi u lo i thu c di t c  hi n đangầ ủ ề ạ ố ệ ỏ ệ  

l u hành   nư ở ước ta và trên th  gi i  ế ớ Thu c di t cố ệ ỏ có ch a ho t ch tứ ạ ấ  

propanil có tính ti p xúc, ch n l c cao dùng đ  di t các lo i c  mà khôngế ọ ọ ể ệ ạ ỏ  gây  nh hả ưởng đ n cây lúaế  Các lo i thu c di t c  ch a ho t ch t propanilạ ố ệ ỏ ứ ạ ấ  đang l u hành   nư ở ước ta đượ trình bày   b ng 1.2.c  ở ả

B ng 1. . Các lo i thu c di t c  có ho t ch t propanil đang l u hành ả ạ ố ệ ỏ ạ ấ ư ở 

Tên thu cố Ho t ch tạ ấ Đ c tr  lo i c  d iặ ị ạ ỏ ạ Th i ờ đi mể  sử 

d ngụ

Pataxim 

55EC

Butachlor 27.5   %   + Propanil   27.5 

Hi u   qu   cao   trênệ ả  các lo i c  khó tr :ạ ỏ ị  

c  ỏ chác,  c  ỏ cháo, 

c  ỏ l ng   v c,  ồ ự cỏ đuôi   ph ng,   c   láụ ỏ  

r ngộ

Thu c   có   tác   d ngố ụ  

di t   m m   và   h uệ ầ ậ  

n y   m m   c ẩ ầ ỏ

Tên thu cố Ho t ch tạ ấ Đ c tr  lo i c  d iặ ị ạ ỏ ạ Th i ờ đi mể  sử 

lá   r ng   nh  ộ ư l ngồ  

v c, c  đuôi ph ng,ự ỏ ụ  

c   cháo,   c   chácỏ ỏ , 

cỏ  lác  voi, rau b ,ợ  rau mác bao, c  xàỏ  bông

Phun khi lúa s  có 2ạ  

­ 2.5 lá (8 ­ 11 ngày sau s ) . Lúa c y: 7ạ ấ  

­   10   ngày   sau   khi 

c  xà bông.ỏ

Lúa s : Lúc cây lúaạ  

có 2­2,5 lá (kho ngả  8­10 ngày sau s )ạLúa   c y:   Sau   khiấ  cây   lúa   đã   h i   s cồ ứ  (kho ng   7­10   ngàyả  sau c y)ấ

Tên thu cố Ho t ch tạ ấ Đ c tr  lo i c  d iặ ị ạ ỏ ạ Th i ờ đi mể  sử 

d ngụ

Satunil 60EC Propanil 200g/l   + 

Thiobencarb 400g/l

Satunil   60EC   là thu c   tr   c   h uố ừ ỏ ậ  

Di t tr  cùng lúc 3ệ ừ  nhóm   c   hòa   b n,ỏ ả  chác lác và lá r ngộ  trên ru ng lúa nh :ộ ư  

C   g o,   c   đuôiỏ ạ ỏ  

ph ng,   c   l ngụ ỏ ồ  

v c,   c   cháo,   cự ỏ ỏ chác,   rau   b ,   rauợ  mác bao, c  lác, cỏ ỏ năn

Tr   c   t   lúc   cừ ỏ ừ ỏ 

m i   m c   cho   đ nớ ọ ế  khi   c   4   lá   (4­12ỏ  ngày sau s )ạ

Tên thu cố Ho t ch tạ ấ Đ c tr  lo i c  d iặ ị ạ ỏ ạ Th i ờ đi mể  sử 

d ngụ

TECOGOLD 

610EC

Butachlor 400g/l   + Pretilachlor 10g/l   + Propanil 

200g/l

Tecogold 610EC  Phòng   tr   cùng   1ừ  lúc   c   3   nhóm   cả ỏ hòa b n, lá ch c vàả ắ  

lá   r ng   nh  ộ ư l ngồ  

v c, c  đuôi ph ng,ự ỏ ụ  

c   cháo,   c   chácỏ ỏ , 

cỏ  lác  voi, rau b ,ợ  rau mác bao, c  xàỏ  bông

nước ta. N ng đ  propanil đồ ộ ược phát hi n trong môi trệ ường thường không cao   vì   chúng   d   phân   h y   thành   3,4­dichloroaniline,   nh ng   3,4­ễ ủ ưdichloroaniline   tích   lũy   lâu   dài   trong   môi   trường   N ng   đ   3,4­ồ ộdichloroaniline được phát hi n sau khi s  d ng propanil th m chí còn caoệ ử ụ ậ  

h n propanil ơ [24]

Trong  môi   trường  nước,  propanil   được  phát   hi n   nhi u   h n  c ệ ề ơ ả  Trong nước ng m, propanil đầ ược phát hi n   gi ng khoan trong ru ng lúaệ ở ế ộ  [2], n i d n và ch a nơ ẫ ứ ướ [3], gi ng khoan nc  ế ước ph c v  s n xu t ụ ụ ả ấ [30] 

v i n ng đ  cao nh t là 1,6 μg/L ớ ồ ộ ấ [3].   nỞ ước m t, propanil đặ ược phát hi nệ  

t  các khu v c nông nghi p Colorado (Hoa K ) ừ ự ệ ỳ [31] sông su i   Arkansasố ở  (Hoa K ) v i n ng đ  cao nh t là 2,7 μg/L ỳ ớ ồ ộ ấ [3]. G n đây, nhi u lo i thu cầ ề ạ ố  

tr  c  trong đó có propanil đừ ỏ ược phát hi n trong nệ ước m t   Costa Rica v iặ ở ớ  

n ng đ  propanil lên đ n 30,6 μg/L ồ ộ ế [32]

Propanil tích lũy trong th c ph m đã đự ẩ ược phát hi n, ch  y u trongệ ủ ế  rau v i n ng đ  0,003­0,006 ppm ớ ồ ộ [33]. Ngoài ra, propanil còn tích lũy c  ả ở trong trái cây [34]

Các ngu n nồ ước được phát hi n trên đây nhi u n i có n ng đ  vệ ề ơ ồ ộ ượ  tqua ngưỡng cho phép là 0,1 μg/L theo quy đ nh c a  y ban an toàn th cị ủ Ủ ự  

ph m Châu Âu ẩ [35]. 

1.1.6. Đ c tính c a propanil ộ ủ

1.1.6.1. Đ c tính c a propanil trên th c v t ộ ủ ự ậ

Propanil kìm hãm s  v n chuy n đi n t  trong quang h p và là thu cự ậ ể ệ ử ợ ố  

di t c  ti p xúc, ch  gây h i cho th c v t   nh ng n i thu c có ti p xúcệ ỏ ế ỉ ạ ự ậ ở ữ ơ ố ế  

v i c  và thớ ỏ ường ch  di t nh ng ph n trên m t đ t c a c  d i.ỉ ệ ữ ầ ặ ấ ủ ỏ ạ

Nghiên c u  nh hứ ả ưởng c a bèo cám nh  (ủ ỏ Lemna minor) cho th yấ  propanil  c ch  s  sinh trứ ế ự ưởng c a chúng và gây ch t khi tăng n ng đủ ế ồ ộ [36]. Khi b  nhi m propanil, bèo cám nh  không t o đị ễ ỏ ạ ược enzyme phân h yủ  propanil làm hóa ch t này tích lũy trong t  bào c a chúng, làm vàng úa lá vàấ ế ủ  gây ch t ế [36]

M c dù cây lúa ch a enzyme AAA có th  phân hu  propanil thànhặ ứ ể ỷ  3,4­dicloroaniline và acidaxid propionic nên gi m đả ược đ c tính, nh ng n uộ ư ế  

trước hay sau phun propanil trong vòng 1 tu n mà có s  d ng các lo i thu cầ ử ụ ạ ố  

tr  sâu b nh thu c các nhóm lân h u c  và cacbamate thì propanil s  gâyừ ệ ộ ữ ơ ẽ  

đ c cho m i lo i cây tr ng, k  c  lúa ộ ọ ạ ồ ể ả [29]

1.1.6.2. Đ c tính c a propanil trên đ ng v t ộ ủ ộ ậ

Propanil có đ c tính tộ ương đ i th p   đ ng v t có vú. Tuy v y,ố ấ ở ộ ậ ậ  chúng có ti m năng gây ung th    các đ ng v t làm thí nghi m nh  g mề ư ở ộ ậ ệ ư ặ  

nh m, mèo và m t s  loài khác ấ ộ ố [28]. Các nghiên c u trứ ước đây cho th y,ấ  

li u gây ch t trung bình m t n a s  cá th  thí nghi m (LD50) khi s  d ngề ế ộ ử ố ể ệ ử ụ  propanil khác nhau tùy t ng loài và cách x  lý. Theo Lewis (2004), LD50ừ ử  

c a propanil đ i v i th  khi x  lý qua da là 4830 mg/kg, đ i v i chó b ngủ ố ớ ỏ ử ố ớ ằ  

đường tiêu hóa là 1217 mg/kg, đ i v i chu t b ng đố ớ ộ ằ ường tiêu hóa 360 mg/kg [37]. 

 Đ i v i m t s  loài chim, propanil gây đ c   các m c đ  khác nhau.ố ớ ộ ố ộ ở ứ ộ  LD50 c a v t c  xanh (ủ ị ổ Anas platyrhynchos) 10 ngày tu i qua đổ ường tiêu hóa 

là 5627 ppm trong 8 ngày, chim cút Virginia (Colinus virginianus) 11 ngày 

tu i qua đổ ường tiêu hóa là 2861 ppm trong 8 ngày [38]

Đ i v i sinh v t dố ớ ậ ướ ưới n c nh  vi khu n lam và t o, chúng d  ti pư ẩ ả ễ ế  xúc v i propanil t  các ngu n th i, nh t là t  ru ng lúa. Loài vi khu n lamớ ừ ồ ả ấ ừ ộ ẩ  

Nostoc calcicola b   c ch  sinh trị ứ ế ưởng khi có propanil trong môi trường và 

b  ch t khi n ng đ  đ n 30 μg/mL nị ế ồ ộ ế ướ [39]. Propanil  c ch  ho t đ ng cc  ứ ế ạ ộ ố 

đ nh đ m c a khu n lam do chúng b   c ch  enzyme nitrogenase ị ạ ủ ẩ ị ứ ế [40]. Đ iố  

v i   t o,   LD50   c a   propanil   đ i   v i   b n   loài   t o  ớ ả ủ ố ớ ố ả Scenedesmus   acutus, 

đ ng t  0,29 đ n 5,98 mg/L trong kho ng 12 gi  ộ ừ ế ả ờ [41]

Các đ ng v t s ng   nộ ậ ố ở ước nh  đ ng v t phù du, lư ộ ậ ưỡng c , giáp xácư  

và cá d  ti p xúc và ng  đ c v i propanil. LD50 c a m t s  loài nh  loàiễ ế ộ ộ ớ ủ ộ ố ư  

giáp xác Daphnia magna là 24,4 mg/L, cá h i vân (ồ Oncorhynchus mykiss) là 

6,20 mg/L,  ch có vu t châu Phi (ế ố Xenopus laevis) là 8,17 mg/L, cóc nhái  (Rana limnocharis) là 13,1 mg/L [24].

ng, h  huy t áp và b  tím tái. T  vong x y ra   nh ng b nh nhân này sau

khi h  huy t áp. Các m u máu đạ ế ẫ ược ghi nh n là có màu nâu đ , tình tr ngậ ỏ ạ  thi u oxygen mô và nhi m acid lactic do ch ng methaemoglobinaemia. Doế ễ ứ  

đó, methaemoglobin huy t dế ường nh  là m t bi u hi n quan tr ng c a ngư ộ ể ệ ọ ủ ộ 

đ c propanil c p tính ộ ấ [9]. Ăn ph i propanil có th  d n đ n c m giác nóngả ể ẫ ế ả  rát và kích thích mi ng, c  h ng và ru t, kèm theo ho, bu n nôn ho c nôn.ệ ổ ọ ộ ồ ặ  

Nu t ph i propanil cũng có th  gây choáng, chóng m t, s t, bu n ng , môiố ả ể ặ ố ồ ủ  

và móng tay màu xanh. Hít ph i h i có th  gây kích  ng mũi và c  h ng vàả ơ ể ứ ổ ọ  gây bu n ng , nói ch m, đau đ u, bu n nôn, chóng m t, choáng váng vàồ ủ ậ ầ ồ ặ  

b t t nh ấ ỉ [28]. Li u gây ch t kho ng trên 1,0 g/kg/ngày ề ế ả [28]. Trong s  431ố  

b nh nhân ng  đ c propanil thì có 42 b nh nhân ch t ệ ộ ộ ệ ế [9]

1.1.6.4. Đ c tính c a propanil trên vi sinh v t ộ ủ ậ

  Ảnh hưởng c a propanil đ n vi sinh v t trong đ t và trong nủ ế ậ ấ ước đã 

được   nghiên   c u  ứ Theo  Crecchio  et   al.,(2001),   propanil   không   làm   nhả  

hưởng   ho c   ít   nh   hặ ả ưởng   đ n   thành   ph n   vi   sinh   v t   đ tế ầ ậ ấ   [42].  3,4­dichloroaniline thường là s n ph m chính c a quá trình chuy n hóa propanilả ẩ ủ ể  

và ch t chuy n hóa này cũng gây ra tác d ng ph  đ i v i s c kh eấ ể ụ ụ ố ớ ứ ỏ  sinh v tậ  

và đ c tính sinh thái. Propanil và 3,4­dichloroaniline có th  xâm nh p vàoộ ể ậ  

h  th ng th y sinh t  nhiên và ti p c n ngu n nệ ố ủ ự ế ậ ồ ước ho c tích lũy trongặ  

đ t, trong đó các ch t n n khó b  phân h y sinh h c vì đi u ki n môiấ ấ ề ị ủ ọ ề ệ  

trường không thích h p cho vi sinh v tợ ậ  sinh trưởng và phát tri n nên  c chể ứ ế 

và làm suy gi m lả ượng vi khu n t n t i trong môi trẩ ồ ạ ường b  nhi m đ cị ễ ộ  propanil

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN C U V  PHÂN H Y PROPANIL   NGOÀIỨ Ề Ủ Ở  

S  kh o sát v  phân h y propanil c a các vi sinh v t t  nhiên có m tự ả ề ủ ủ ậ ự ặ  

trong nước được th c hi n b i Dahchourự ệ ở  et al. (1986) cho th y, quá trìnhấ  phân h y 50 ppm m t kho ng 120 giủ ấ ả ờ  [21]. M t nghiên c u khác v  sộ ứ ề ự phân  huỷ  propanil  t   nhiên   trong   nự ước   tr ng  lúa   g o    đi u   ki n   thíồ ạ ở ề ệ  nghi m đệ ược ti n hành b iế ở  Ekanayake (2010) [5].

M t s  nghiên c u v  s  phân h y propanil cũng nh  m t s  dòng viộ ố ứ ề ự ủ ư ộ ố  khu n phân h y chúng trong môi trẩ ủ ường l ng đã đỏ ược phân l p. Ch ngậ ẳ  

h n, 5 dòng vi khu n phân h y propanil trong môi trạ ẩ ủ ường l ng đã đỏ ượ  c

đ nh danh b i Correa và Steen bao g m ị ở ồ Aerobacter aerogenes, Aeromonas  hydrophila, Acinetobacter calcoaceticus, Proteus mirabilis và A. salmonicida  [44]  Zhang  et al., (2011) đã phân l p và mô t  phậ ả ương th c phân h yứ ủ  propanil c a ủ Sphingomonas sp. Y57 cũng nh  nh n di n gene prpH mã hóaư ậ ệ  

enzyme propanil hydrolase [22]. Roehrs et al., (2012) đã phân l p đậ ược dòng 

vi khu n ẩ Enterobacter cloacae có kh  năng phân h y 100% lả ủ ượng propanil 

 n ng đ  ban đ u là 3,6 mg/L sau 14 đ n 28 ngày 

Đ i v i s  phân h y propanil đố ớ ự ủ ược th c hi n b i vi n m, ự ệ ở ấ Lanzilotta 

và Pramer (1970) đã phân l p đậ ược n m ấ Fusarium solani  có th  s  d ngể ử ụ  propanil nh  là ch t carbon duy nh tư ấ ấ  [48]. Hai dòng n m khác có kh  năngấ ả  phân h y propanil đã đủ ược phân l p là ậ Aspergillus nidulans b i ở  Pelsy et al.,  (1987) và F.  oxysporum b i Reichel ở et al., (1991) Các enzyme liên quan để 

phân h y propanil c a 2 dòng n m này đã đủ ủ ấ ược xác đ nh. N m ị ấ A. nidulans 

v i enzyme th y phân ho t đ ng trong kho ng pH là 7,8 và 10,2  ớ ủ ạ ộ ả [49]. 

Enzyme phân h y propanil là amidase c a n m  ủ ủ ấ F.  oxysporum  b   c chị ứ ế 

ho t đ ng khi có m t m t s  ho t ch t c a thu c tr  c  khác nh  linuron,ạ ộ ặ ộ ố ạ ấ ủ ố ừ ỏ ư  diuron và monuron [50]

Trong đi u ki n k  khí, ch  có vài công b  v  s  phân h y propanil.ề ệ ỵ ỉ ố ề ự ủ  

Zhang  et   al.,   (2012)   đã   phân   l p   đậ ược   dòng   k   khí   không   b t   bu cỵ ắ ộ  

Catellibacterium nanjingense sp. Y12T t  n i x  lý nừ ơ ử ước th i có th  phânả ể  

h y 90% propanil (100 mg/L) trong vòng 3 ngàyủ  [51]. M t nghiên c u khácộ ứ  

được th c hi n trong đi u ki n k  khí do các vi sinh v t trong đ t choự ệ ề ệ ỵ ậ ấ  

th y, propanil b  phân h y t i 81% sau 100 ngày ấ ị ủ ớ [52]

Đ i v i s  phân h y propanil trong đ t, ch  m t s  tác gi  đã ti nố ớ ự ủ ấ ỉ ộ ố ả ế  hành nghiên c u. Chisako và Kearney (1970) kh o sát s  phân h y c a h pứ ả ự ủ ủ ợ  

ch t này trong 5 lo i đ t khác nhau cho th y, quá trình phân h y g n nhấ ạ ấ ấ ủ ầ ư hoàn toàn trong kho ng 15­45 ngày   n ng đ  ban đ u là 850 ppmả ở ồ ộ ầ  [53]. Sự phân h y propanil và s  hình thành các h p ch t trung gian trong các lo iủ ự ợ ấ ạ  

đ t khác nhau (đ t cát­mùn, đ t phù sa, đ t sét, đ t sét­mùn) đã đấ ấ ấ ấ ấ ược th cự  

hi n b i Burgeệ ở  et al., (1972). K t qu  cho th y ế ả ấ Arthrobacter và Nocardia 

sp. là nh ng nhóm vi khu n ch  y u trong đ t phân h y propanil và t o raữ ẩ ủ ế ấ ủ ạ  3,4­dichloroaniline và 3,3’,4,4’­tetrachloroazobenzene [54]. M t nghiên c uộ ứ  khác cho th y, s  có m t c a  ấ ự ặ ủ Pseudomonas  sp. G trong đ t đã phân h yấ ủ  

được 25­50% propanil   n ng đ  10 ppm trong 5 ngày ở ồ ộ [55]

Đa s  các nghiên c u cho th y, s n ph m trung gian c a s  phân h yố ứ ấ ả ẩ ủ ự ủ  sinh h c propanil là 3,4­dichloroaniline ọ [22, 44, 45, 47, 52, 56]. Tuy nhiên, quá trình phân h y ti p theo còn ch a đủ ế ư ược làm sáng t  ỏ

Đ i v i các phố ớ ương pháp phân h y v t lý và hóa h c, đã có m t sủ ậ ọ ộ ố 

kh o sát v  s  phân h y propanil b ng chi u sáng và TiOả ề ự ủ ằ ế 2. Vi c k t h pệ ế ợ  

gi a chi u x  b ng tia UV và s  d ng TiOữ ế ạ ằ ử ụ 2 đã phân h y propanil (10 mg/L)ủ  thành CO2 và nước trong vòng 240 phút [18]. Vi c b  sung Fenton nh  làệ ổ ư  

ch t xúc tác vào quá trình này làm tăng t c đ  phân h y propanil lên g p 4ấ ố ộ ủ ấ  

l n ầ [19]. Nhìn chung, phương pháp này tương đ i hi u qu  trong vi c phânố ệ ả ệ  

hu  propanil có m t trong nỷ ặ ước, tuy nhiên r t khó th c hi n trong đ t.ấ ự ệ ấ

T  nh ng nghiên c u trên cho th y,   nừ ữ ứ ấ ở ước ta ch a có công b  nào vư ố ề 

s  phân h y propanil b ng bi n pháp sinh h c m c dù đã có nh ng nghiênự ủ ằ ệ ọ ặ ữ  

c u v  s  phân h y các ho t ch t tr  c  khác. Trên th  gi i đã có nh ngứ ề ự ủ ạ ấ ừ ỏ ế ớ ữ  nghiên c u nh t đ nh. M t khác, s  phân h y propanil ch  y u th c hi nứ ấ ị ặ ự ủ ủ ế ự ệ  khi không có s  tác đ ng c a các ch t hóa h c đ c h i khác và ch a cóự ộ ủ ấ ọ ộ ạ ư  nhi u kh o sát v  tác đ ng c a môi trề ả ề ộ ủ ường đ n t c đ  phân h y.ế ố ộ ủ

1.3  TÌNH HÌNH NGHIÊN C U V  PHÂN H Y PROPANIL  TRONGỨ Ề Ủ  

Pseudomons fluorescens HH phân h y g n nh  100% 2,4­D   n ng đ  banủ ầ ư ở ồ ộ  

đ u là 1,0 mM sau 24 giầ ờ [57]. M t nghiên c u khác độ ứ ược th c hi n   đi uự ệ ở ề  

ki n k  khí b i Haệ ỵ ở  Danh Duc (2018) cho th y, dòng vi khu n ấ ẩ Thauera sp. 

DKT có th  s  d ng 2,4­D nh  là ngu n carbon và năng lể ử ụ ư ồ ượng mà không 

c n b  sung thêm ch t dinh dầ ổ ấ ưỡng nào khác [58]. Đ i v i phố ớ ương pháp hóa 

h c, s  d ng TiOọ ử ụ 2 nh  là ch t xúc tác quang cho quá trình oxi hoá nâng caoư ấ  

đ  phân h y m t s  ho t ch t c a thu c tr  c  ể ủ ộ ố ạ ấ ủ ố ừ ỏ [59]

S  có m t c a propanil (hay còn g i là 3,4­dichloropropananilide) trongự ặ ủ ọ  

nước ng m và nầ ước m t đã đặ ược xác đ nh, nh ng ch a có nghiên c u nàoị ư ư ứ  

v  s  phân h y propanil đề ự ủ ược th c hi n   nự ệ ở ước ta. Ch  có m t s  nghiênỉ ộ ố  

c u phân h y h p ch t trung gian c a propanil là 3,4­dichloroaniline và cácứ ủ ợ ấ ủ  chloroaniline khác b i vi khu n  ở ẩ Acinetobecter baumannii GFJ1 được th cự  

hi n b i Hà Danh Đ c (2015 và 2016)ệ ở ứ  K t qu  cho th y,  ế ả ấ Acinetobecter  baumannii GFJ1 có kh  năng hình thành mả àng sinh h cọ  và có th   ng d ngể ứ ụ  màng   sinh   h c   đ   phân   h y   m t   s   lo i   chloroaniline,   nh t   là   3,4­ọ ể ủ ộ ố ạ ấdichloroaniline. Ngoài ra, dòng vi khu n này còn có th  ch u m n t t và cóẩ ể ị ặ ố  

th  phân h y propanil ngay   n ng đ  mu i NaCl lên đ n 4,5% ể ủ ở ồ ộ ố ế [56, 60]

CHƯƠNG 2. NGUYÊN V T LI U VÀ PHẬ Ệ ƯƠNG PHÁP NGHIÊN C UỨ

­ Thí nghi m sinh h c phân t  đ nh danh vi khu n đệ ọ ử ị ẩ ược ti n hành t iế ạ  

Vi n Công ngh  sinh h c, Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh  VN, Hàệ ệ ọ ệ ọ ệ  

N i.ộ

2.1.1.3. Đ i t ố ượ ng nghiên c u ứ

­ Các dòng vi khu n có kh  năng phân h y propanil phân l p t  đ t.ẩ ả ủ ậ ừ ấ

Nguyen và Ha (2019) bao g m: 1419,6 mg/L Naồ 2HPO4, 1360,9 mg/L KH2PO4, 98,5 mg/L MgCl2, 5,88 mg/L CaCl2∙2H2O, 8,4 mg/L NaHCO3, 1,16 mg/L 

H3BO4,   1,15   mg/L   ZnSO4∙7H2O,   0,38   mg/L   CuSO4∙5H2O,   và   0,24   mg/L CoCl2∙6H2O, 1,0 g/L (NH4)2SO4 và 1,0 g/L succinate. 

Môi trường Luria­Bertani (LB) thành ph n g m peptone 10 g/L, Yeastầ ồ  Extract 5 g/L, mu i NaCl 10 g/L. Môi trố ường đ c dùng đ  đ m vi khu n cóặ ể ế ẩ  

b  sung thêm 2% agar.ổ

pH c a môi trủ ường được đi u ch nh đ n 7,0. Sau đó môi trề ỉ ế ườ  ng

được đem đi kh  trùng   121 ử ở oC trong 15 phút trước khi s  d ng.ử ụ

Propanil được pha trong c n tuy t đ i thành dung d ch stock v i n ngồ ệ ố ị ớ ồ  

đ  0,1 M. Các hóa ch t c a hãng Sigma­Aldrich, Merck (Đ c) v i đ  tinhộ ấ ủ ứ ớ ộ  khi t đế ược dùng trong các thí nghi m.ệ

2.1.2.2. D ng c  và thi t b ụ ụ ế ị

­ N i kh  trùng KT­40LDP (Nh t B n)ồ ử ậ ả

­ T  c y vi khu n (Esco, ủ ấ ẩ Singapore)

­ Máy s c ký l ng hi u năng cao (HPLC) hãng Thermo, ắ ỏ ệ

2.2.1. Phương pháp phân l p và đ nh danh các dòng vi khu n phân h yậ ị ẩ ủ  propanil t  đ từ ấ

B ướ c 1. Thu m u đ t ẫ ấ

Các m u đ t khô (đ   m kho ng 20 ­ 30%) đẫ ấ ộ ẩ ả ược thu th p t  m t sậ ừ ộ ố 

đ a đi m tr ng lúa và ngô t i huy n Cao Lãnh,   t nh Đ ng Tháp. Các m uị ể ồ ạ ệ ở ỉ ồ ẫ  

được thu ng u nhiên   đ  sâu không quá 20 cm. Các m u đ t đẫ ở ộ ẫ ấ ược tr nộ  vào nhau và rây qua l p sàng đ  lo i các kh i đ t đá có kích thớ ể ạ ố ấ ướ ớc l n h nơ  0,5 cm. 

B ướ c 2.   m u đ t có b  sung propanil Ủ ẫ ấ ổ

500 g đ t đấ ược chuy n vào m t khay nh a v i chi u dài×chi uể ộ ự ớ ề ề  

r ng×chi u sâu tộ ề ương  ng là 15×25×15 cm. Các m nh đá và r  cây l n h nứ ả ễ ớ ơ  

2 cm (r ng ho c dài) đ u độ ặ ề ược lo i ra b ng tay. Nạ ằ ước c t đấ ược thêm vào 

đ  đ t đ   m 40%. Propanil để ạ ộ ẩ ược b  sung v i n ng đ  10 mg/kg đ t. Cácổ ớ ồ ộ ấ  

h p độ ược đ y b ng m t n p nh a và đậ ằ ộ ắ ự ượ ủc   trong 1 tháng   phòng thíở  nghi m. C  5 ngày đ t, n p đệ ứ ấ ắ ược m  ch ng 5 phút và khay đ t đở ừ ấ ượ ắ  c l c

nh  b ng tay đ  tr n đ u và vi sinh v t l p đ t dẹ ằ ể ộ ề ậ ớ ấ ưới có thêm oxygen

Hình 2. . Khay nh a dùng đ    m u đ t trự ể ủ ẫ ấ ước khi phân l p vi khu n.ậ ẩ

B ướ c 3. Phân l p vi khu n phân h y propanil ậ ẩ ủ

M u đ t (5 g) đẫ ấ ược chuy n sang bình tam giác có dung tích 500 mLể  

ch a 200 mL môi trứ ường l ng MM có b  sung propanil v i n ng đ  0,1ỏ ổ ớ ồ ộ  

mM. Bình đượ ủ ở ốc     t c đ  150 vòng/phút trong 1 tháng và propanil độ ượ  c

b  sung theo chu k  5 ngày/l n v i cùng n ng đ  0,1 mM. T t c  các thíổ ỳ ầ ớ ồ ộ ấ ả  nghi m đệ ược th c hi n   nhi t đ  phòng. ự ệ ở ệ ộ

Dung d ch   này đị ủ ược pha loãng kho ng 10ả ­5 l n. Sau khi pha loãng,ầ  propanil được b  sung v i n ng đ  0,1 mM ổ ớ ồ ộ [22]. 0,2 mL dung d ch đị ượ  c

tr i đ u trên môi trả ề ường MM th ch agar trong đĩa Petri. Đĩa đạ ượ ủ ởc     nhi tệ  

đ  phòng sau kho ng 2 ngày đ  xu t hi n các khu n l c. Các khu n l cộ ả ể ấ ệ ẩ ạ ẩ ạ  

được làm ròng và ki m tra kh  năng phân h y propanil trong môi trể ả ủ ườ  ng

l ng. Quá trình này nh  sau:ỏ ư

Vi khu n đẩ ược c y vào đĩa agar, 1 khu n l c đấ ẩ ạ ược chuy n vào môiể  

trường l ng MM v i 0,1 mM propanil. Môi trỏ ớ ường đượ ủ ởc     nhi t đệ ộ phòng trên máy l c v i t c đ  150 vòng/phút. Sau m i 5 gi , 1,0 mL dungắ ớ ố ộ ỗ ờ  

d chị  được hút ra b ng micropipette đ  xác đ nh n ng đ  propanil còn l iằ ể ị ồ ộ ạ  trong dung d ch b ng HPLC. M u đị ằ ẫ ược tr    4 ữ ở oC và sau 30 gi  thì m uờ ẫ  

đượ ử ục s  d ng đ  ch y HPLC. Các m u có n ng đ  propanil gi m xu ngể ạ ẫ ồ ộ ả ố  

ch ng t  vi khu n có kh  năng phân h y hóa ch t này.ứ ỏ ẩ ả ủ ấ

M t dòng vi khu n có kh  năng phân h y propanil m nh nh t độ ẩ ả ủ ạ ấ ượ  c

l a ch n và sau khi đ nh danh s  đự ọ ị ẽ ược dùng trong các thí nghi m ti p theo. ệ ế

B ướ c 4. Đ nh danh vi khu n  ị ẩ

Ch n 1 dòng có kh  năng phân h y propanil t t nh t đ  xác đ nh loài.ọ ả ủ ố ấ ể ị  

Vi c đ nh danh này d a vào trình t  16S rệ ị ự ự RNA. Dùng mũi đ u côn thu 1 v tầ ệ  

t  bào t  1 khu n l c đ n đi n hình, hòa tan vào 0,2 ml TE, tr n đ u nhi uế ừ ẩ ạ ơ ể ộ ề ề  

l n b ng micropipet, sau đó voltex nh  nhàng trong 15s, u   37ầ ằ ẹ ̉ ở oC trong 5 phút. S  d ng d ch trong phía trên làm khuôn cho ph n  ng PCR khu chử ụ ị ả ứ ế  

đ i gen.ạ

Phương pháp PCR khu ch đ i đo n genế ạ ạ  đ c hi uặ ệ

 Các thông tin v  thành ph n và chu trình nhi t c a PCR đề ầ ệ ủ ược trình bày trong b ng 2.1 và b ng 2.2. Thông tin v  kích thả ả ề ướ ảc s n ph m PCR, nhi tẩ ệ  

đ  g n m i trình bày trong b ng 2.3.      ộ ắ ồ ả

Bang 2.1. Thành ph n PCR̉ ầThanh phâǹ ̀ Sô ĺượng (µL)

Th i gianờ  (min)

kỳ Kéo dài m chạ 72 1,0

3 Hoàn   t t   kéo   dàim chạ ấ   72 7,0

B ng 2.3. Thông tin v  kích thả ề ướ ảc s n ph m PCR, nhi t đ  g n m i.ẩ ệ ộ ắ ồ

M iồ Trình t  m i ự ồ (5’­3’) Ta [oC]  Kích thước 

ở oC trong th i gian 5 min đê agarose hoa tan hoan toan trong đêm.ờ ̉ ̀ ̀ ̀ ̣  Rot nhe nhang dung dich gel vao khay điên di v i đô day khoang 5­6 mm,́ ̣ ̀ ̣ ̀ ̣ ớ ̣ ̀ ̉  tranh xuât hiên bot khi, nhe nhang cai ĺ ́ ̣ ̣ ́ ̣ ̀ ̀ ược vao ban điên di.̀ ̉ ̣

Tra m u: Khi ban điên di nguôi hoan toan, nhe nhang chuyên vaoẫ ̉ ̣ ̣ ̀ ̀ ̣ ̀ ̉ ̀ buông điên di, nhâc l̀ ̣ ́ ược ra khoi khay. M u DNA đ̉ ẫ ược tr n v i đ m traộ ớ ệ  

m u (loading buffer) theo t  l  th  tích là 5:1, sau đó h n h p này đẫ ỷ ệ ể ỗ ợ ượ  c

nh  vào các gi ng trên gel. Ti n hành đi n di các m u DNA cùng v iỏ ế ế ệ ẫ ớ  các thang DNA chu n đ  ẩ ể ướ ược l ng kích thước phân t  DNA.ử

Ch y đi n di: S  d ng hi u đi n th : U = 100V; dung d ch đ m TBEạ ệ ử ụ ệ ệ ế ị ệ  1X. Sau đó nhu m gel trong dung dich Ethidium Bromide và soi ban điênộ ̣ ̉ ̣  

di dươi anh sang t  ngoai 254 nm.́ ́ ́ ử ̣

Đ c trình t  gen 16S rọ ự RNA

­ S n ph m PCR đả ẩ ược làm s ch theo hạ ướng d n c a Kit tinh s ch s nẫ ủ ạ ả  

ph m PCR  QIAGEN Kit, gi i trình t  gen 2 chiêu đẩ ả ự ̀ ược tiên hanh trên máý ̀  

đ c   trinh   t   gen   ABI   3730XL   DNA   Analyzer,   Applied   Biosystemsọ ̀ ự  (Macrogen, Korea)

Đ nh danh vi khu n:ị ẩ

Trình t  16S rự RNA thu được được x  lý b ng ph m m m BioEditử ằ ầ ề  7.2.5 (Hall, 1999) [67], sau đó được so sánh v i trình t  gene 16S rớ ự RNA trong   cơ   sở   dữ   li u   NCBI   b ng   công   cệ ằ ụ   BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi); và D  án c  s  d  li u Ribosomalự ơ ở ữ ệ  (RDP; http: //rdp.cme.msu.edu). 

Xây d ng cây ph  h  (cây phát sinh ch ng lo i) đự ả ệ ủ ạ ược th c hi nự ệ  

b ng ph n m m MEGA 5.1 v i phằ ầ ề ớ ương pháp Construct/Test Neighbor­Joining Tree, Boothstrap Method v i 1000 l n l p l i.ớ ầ ặ ạ

2.2.3. Các thí nghi mệ

2.2.3.1. Chu n b  vi khu n đ   ẩ ị ẩ ể b  sung ổ

Vi khu n đẩ ược nuôi c y trong môi trấ ường LB trong 18 gi  đờ ượ  cdùng đ  b  sung sang môi trể ổ ường khác đ  th c hi n các thí nghi m. Trongể ự ệ ệ  các thí nghi m v  phân h y propanil trong môi trệ ề ủ ường l ng, 0,5 mL dungỏ  

d ch nuôi c y đị ấ ược b  sung vào bình tam giác (th  tích 250 mL) ch a 100ổ ể ứ  

mL dung d ch MM. ị

2.2.3.2. Các thí nghi m phân h y propanil trong môi tr ệ ủ ườ ng khoáng l ng  ỏ

Quá trình phân h y propanil đủ ược th c hi n trong các bình tam giác.ự ệ  

M i bình tam giác có th  tích 250 mL, ch a 100 mL môi trỗ ể ứ ường. Vi khu nẩ  

được nuôi c y trong môi trấ ường LB nh  đã mô t  trên đư ả ược b  sung vàoổ  môi trường MM đ  có s  lể ố ượng ban đ u là 10ầ 6 CFU/mL và áp d ng cho t tụ ấ  

c  các thí nghi m, tr  thí nghi m  nh hả ệ ừ ệ ả ưởng c a s  lủ ố ượng vi khu n banẩ  

đ u đ n s  phân h y propanil. ầ ế ự ủ

Propanil được dùng dướ ại d ng stock, được b  sung vào môi trổ ườ  ngthí nghi m b ng micropipette. Bình tam giác đệ ằ ược đ y l i b ng nút bông,ậ ạ ằ  

và sau đó đượ ủ ởc     nhi t đ  phòng (30 ệ ộ oC) v i t c đ  l c là 150 vòng/phút. ớ ố ộ ắ

Trong th i gian  , môi trờ ủ ường đượ ấc l y ra sau m t kho ng th i gianộ ả ờ  

nh t đ nh đ  xác đ nh n ng đ  propanil còn l i và s  sinh trấ ị ể ị ồ ộ ạ ự ưởng c a viủ  khu n trong môi trẩ ường. M i l n l y m u, 1,0 mL dung d ch đỗ ầ ấ ẫ ị ược hút ra 

b ng micropipette, ch a trong 1,5­mL eppendorf và tr    nhi t đ  4 ằ ứ ữ ở ệ ộ oC n uế  

ch a phân tích ngay. N ng đ  propanil trong dung d ch đư ồ ộ ị ược xác đ nh d aị ự  vào k t qu  ch y HPLC (mô t    m c 2.2.4). S  sinh trế ả ạ ả ở ụ ự ưởng c a vi khu nủ ẩ  

được xác đ nh thông qua s  tăng lên v  s  vi khu n trong môi trị ự ề ố ẩ ường, đượ  c

đ m d a trên s  khu n l c xu t hi n trên đĩa agar (mô t    m c 2.2.5). ế ự ố ẩ ạ ấ ệ ả ở ụ

T t c  các thí nghi m đã đấ ả ệ ược th c hi n ít nh t ba l n l p l i trongự ệ ấ ầ ặ ạ  cùng m t đi u ki n môi trộ ề ệ ường. Các thí nghi m nh  ch ng vi khu n, l yệ ư ủ ẩ ấ  môi trường t  bình tam giác ra đ u đừ ề ược ti n hành   đi u ki n vô trùngế ở ề ệ  trong t  c y (Laminar). ủ ấ Ở ác nghi m th c đ i ch ng không đ c ệ ứ ố ứ ược b  sungổ  thêm vi khu nẩ  trong quá trình thí nghi mệ  S  phân h y propanil trong môiự ủ  

trường l ng bao g m các thí nghi m sau:ỏ ồ ệ

a)  nh h Ả ưở ng c a n ng đ  propanil đ n s  phân h y c a vi khu n ủ ồ ộ ế ự ủ ủ ẩ

Thí nghi m  nh hệ ả ưởng c a n ng đ  propanil đ n s  phân h y c a viủ ồ ộ ế ự ủ ủ  khu n đẩ ược th c hi n tự ệ ương t  nh  thí nghi m trên. Vi khu n đự ư ệ ẩ ược kh oả  sát kh  năng phân h y   các n ng đ  là 0,1, 0,4, 0,6 và 1,0 mM trong môiả ủ ở ồ ộ  

trường MM, s  d ng propanil nh  là ngu n carbon và nitrogen duy nh t.ử ụ ư ồ ấ  Bình tam giác đượ ủc   trên máy l c trong 30 gi , và môi trắ ờ ường đượ ấ ừ c l y tcác bình tam giác sau 2, 5, 10, 15 và 20 gi  đ  xác đ nh n ng đ  propanilờ ể ị ồ ộ  còn l i b ng k  thu t HPLC nh  mô t    m c m c 2.2.4.ạ ằ ỹ ậ ư ả ở ụ ụ

b) Thí nghi m  nh h ệ ả ưở ng c a ch t dinh d ủ ấ ưỡ ng b  sung đ n s  phân h y  ổ ế ự ủ propanil và sinh tr ưở ng c a vi khu n  ủ ẩ

Thí nghi m đệ ược ti n hành nh  đã mô t    trên, nh ng môi trế ư ả ở ư ườ  ngkhoáng được b  sung thêm ngu n dinh dổ ồ ưỡng đ  kích thích s  phát tri nể ự ể  

c a vi khu n. Ngu n dinh dủ ẩ ồ ưỡng này là succinate và ammonium sulfate, là 

nh ng ngu n carbon và nitrogen đữ ồ ược b  sung v i n ng đ  1,0 g/L vào môiổ ớ ồ ộ  

trường l ng đ  đánh giá vai trò c a ch t dinh dỏ ể ủ ấ ưỡng đ n t c đ  sinhế ố ộ  

trưởng c a vi khu n và s  phân h y propanil. Bình tam giác đủ ẩ ự ủ ượ ủc   trên máy l c trong 30 gi , và m u (1,0 mL) đắ ờ ẫ ượ ấ ừc l y t  các bình tam giác để xác đ nh n ng đ  propanil còn l i b ng k  thu t HPLC nh  mô t    m cị ồ ộ ạ ằ ỹ ậ ư ả ở ụ  

m c 2.2.4.ụ

c) Thí nghi m  nh h ệ ả ưở ng c a pH đ n s  phân h y propanil và sinh tr ủ ế ự ủ ưở   ng

c a vi khu n  ủ ẩ

Đ  đánh giá  nh hể ả ưởng c a pH, vi khu n đủ ẩ ược nuôi c y trong môiấ  

trường MM có ch a 0,1 mM propanil t i pH môi trứ ạ ường được đi u ch nh ề ỉ ở 

m c 5, 6, 8 và 9 b ng HCl và NaOH. Các bình tam giác đứ ằ ượ ủc   trên máy l cắ  trong 10 gi , và m u (1,0 mL) đờ ẫ ượ ấ ừc l y t  các bình tam giác đ  xác đ nhể ị  

n ng đ  propanil còn l i b ng k  thu t HPLC nh  mô t    m c m c 2.2.4.ồ ộ ạ ằ ỹ ậ ư ả ở ụ ụ

d) Thí nghi m  nh h ệ ả ưở ng c a đ  m n đ n s  phân h y propanil và sinh ủ ộ ặ ế ự ủ  

tr ưở ng c a vi khu n ủ ẩ

Thí nghi m đệ ược ti n hành trong các bình tam giác nh  đã mô t  ế ư ả ở trên. NaCl v i n ng đ  1 ­ 5% đớ ồ ộ ược b  sung vào môi trổ ường MM có ch aứ  0,1 mM propanil. Vi khu n sau đó đẩ ược ch ng vào môi trủ ường đ  đánh giáể  

nh h ng c a đ  m n đ n s  phân h y propanil và sinh tr ng c a vi

khu n.ẩ

Các bình tam giác đượ ủc   trên máy l c, và môi trắ ường đượ ấ ừc l y t  các bình tam giác sau 10 gi    đ  xác đ nh n ng đ  propanil còn l i b ng kờ ủ ể ị ồ ộ ạ ằ ỹ thu t HPLC nh  mô t    m c m c 2.2.4.ậ ư ả ở ụ ụ

e) Thí nghi m  nh h ệ ả ưở ng c a s  l ủ ố ượ ng vi khu n ban đ u đ n s  phân h y ẩ ầ ế ự ủ   propanil

Vi khu n đẩ ược nuôi c y trong môi trấ ường LB nh  đã mô t    trên.ư ả ở  Sau 18 gi , 100 mL môi trờ ường này được ly tâm   t c đ  10000 rpm trong 5ở ố ộ  phút. Vi khu n thu đẩ ược sau ly tâm được chuy n sang 1,0 mL và tr  nênể ở  môi trường đ m đ c vi khu n dùng đ  b  sung. Vi khu n đậ ặ ẩ ể ổ ẩ ược b  sungổ  vào các bình tam giác v i n ng đ  ban đ u l n lớ ồ ộ ầ ầ ượt 105, 106, 107  và 108 CFU/mL. Các bình tam giác có ch a 100 mL môi trứ ường MM và 0,1 mM 

propanil nh  đã mô t    trên. Sau 0, 2, 5, 8, 10 và 15 gi , 1,0 mL dung d chư ả ở ờ ị  

được hút ra đ  xác đ nh n ng đ  propanil còn l i d a vào k t qu  ch yể ị ồ ộ ạ ự ế ả ạ  HPLC

f) Đánh giá kh  năng phân h y propanil trong môi tr ả ủ ườ ng n ướ c đ ượ c thu  

th p t  sông và kênh r ch b  ô nhi m ậ ừ ạ ị ễ

Đ  xác đ nh s  phân h y propanil trong nể ị ự ủ ướ ự ước t  n c sông, các m uẫ  

nước đượ ấ ừc l y t  sông Ti n (m t nhánh c a sông Mekong), thành ph  Caoề ộ ủ ố  Lãnh và nước nhi m b n đễ ẩ ược thu th p t  m t rãnh trong vậ ừ ộ ườn trái cây ở huy n L p Vò, t nh Đ ng Tháp, n i nông dân đã s  d ng thu c tr  c  baoệ ậ ỉ ồ ơ ử ụ ố ừ ỏ  

g m propanil. Các thành ph n hóa h c c a các m u nồ ầ ọ ủ ẫ ước đó được phân tích t i Trung tâm phân tích Hóa h c, ĐH Đ ng Tháp (do các k  thu t viênạ ọ ồ ỹ ậ  

đ m nh n) theo phả ậ ương pháp c a Hi p h i S c kh e C ng đ ng Hoa Kủ ệ ộ ứ ỏ ộ ồ ỳ (American Public Health Association, APHA) [61]

M u nẫ ước thu v  đề ượ ử ục s  d ng đ  ti n hành thí nghi m ngay trongể ế ệ  ngày. Thí nghi m này đệ ược ti n hành tế ương t  nh  phân h y propanil trongự ư ủ  môi trường MM được mô t    trên, nh ng môi trả ở ư ường MM được thay thế 

b i nở ước thu v  M u nề ẫ ước này được đ a vào các bình tam giác, m i bìnhư ỗ  

100 mL. Các m u nẫ ước đ u không đề ược kh  trùng. Propanil đử ược b  sungổ  vào m u nẫ ướ ở ồc   n ng đ  0,1 mM. Các bình tam giác độ ượ ủ ởc     nhi t đệ ộ phòng (kho ng 30 ả oC) v i t c đ  quay 150 vòng/phút. Sau 0, 2, 5, 8, 10 vàớ ố ộ  

15 gi , 1,0 mL dung d ch đờ ị ược hút ra đ  xác đ nh n ng đ  propanil còn l iể ị ồ ộ ạ  

d a vào k t qu  ch y HPLC nh  mô t    m c 2.2.4.ự ế ả ạ ư ả ở ụ

2.2.3.3. Đánh giá kh  năng phân h y propanil trong đ t ả ủ ấ

M u đ t đẫ ấ ược thu th p t  đ  sâu 10 ­ 50 cm trên m t cánh đ ng ngôậ ừ ộ ộ ồ  

n i nông dân đôi khi s  d ng thu c tr  c  (đ t b  ô nhi m). M t m u đ tơ ử ụ ố ừ ỏ ấ ị ễ ộ ẫ ấ  khác được thu th p t  vùng Núi C m, t nh An Giang, n i không s  d ngậ ừ ấ ỉ ơ ử ụ  thu c di t c  (đ t không b  nhi m thu c tr  c ). Đ t đố ệ ỏ ấ ị ễ ố ừ ỏ ấ ược đ p v  v n,ậ ỡ ụ  sàng qua lưới có đường kính 2 mm. Trước khi ti n hành thí nghi m, cácế ệ  thành ph n đ t đầ ấ ược xác đ nh theo tam giác k t c u đ t. Thành ph n c aị ế ấ ấ ầ ủ  

đ t đấ ược phân tích t i Trung tâm Phân tích Hóa h c, ĐH Đ ng Tháp. Cácạ ọ ồ  tính ch t hóa lý khác đấ ược phân tích b ng phằ ương pháp APHA. Đ  pH c aộ ủ  

đ t cũng đấ ược xác đ nh b ng pH k  hi u HI981030 (Công ty TNHH Hannaị ằ ế ệ  Instruments Vi t Nam). Thành ph n cát, phù sa và sét trong đ t đệ ầ ấ ược phân tích d a trên kích thự ướ ủc c a chúng [62]

Đ t đấ ược thu và mang v  trong ngày, b o qu n   4 ề ả ả ở oC qua đêm (12 

gi ) r i ti n hành thí nghi m ngay. Quá trình thí nghi m đờ ồ ế ệ ệ ược th c hi nự ệ  trong các  khay nh a có  chi u dài×chi u  r ng×chi u sâu  tự ề ề ộ ề ương  ng làứ  15×25×15 cm. Đ i v i đ t thu v  t  núi C m, m i khay ch a 1125 g đ t cóố ớ ấ ề ừ ấ ỗ ứ ấ  

đ   m ban đ u là 20% (đ   m c a đ t khi thu m u), t c là 900 g đ t khô.ộ ẩ ầ ộ ẩ ủ ấ ẫ ứ ấ  

Đ i v i đ t thu v  t  ru ng ngô, đ   m là 27%, khay đ t ch a 1233 g đ tố ớ ấ ề ừ ộ ộ ẩ ấ ứ ấ  

m i thu đớ ược. 

15 mg propanil tinh khi t đế ược pha vào 200 mL nước c t đã khấ ử trùng r i tr n đ u cho đ n khi propanil tan h t. Dung d ch này đồ ộ ề ế ế ị ượ ướ  c t i

tr c ti p vào đ t r i tr n đ u. Sau đó, nự ế ấ ồ ộ ề ướ ấc c t đã kh  trùng đử ược ti p t cế ụ  

tưới vào đ  có 1,5 kg trong khay. Cu i cùng, khay đ t này ch a 1,5 kg đ tể ố ấ ứ ấ  

v i đ   m 40% và 15 mg propanil. Đ t đớ ộ ẩ ấ ược tr n đ u m t l n n a, r iộ ề ộ ầ ữ ồ  chia ba ph n đ u nhau cho vào ba khay nh a (ba l n l p l i). ầ ề ự ầ ặ ạ

Các h p độ ược đ y b ng m t n p nh a và đậ ằ ộ ắ ự ượ ủc   trong bóng t i.ố  

M u đ t kh  trùng không b  sung vi khu n đẫ ấ ử ổ ẩ ượ ử ục s  d ng làm đ i ch ng.ố ứ  

Đ t không kh  trùng và không b  sung vi khu n đấ ử ổ ẩ ượ ử ục s  d ng đ  xác đ nhể ị  

s  phân h y do các vi sinh v t t  nhiên trong đ t. Sau 2, 5, 8, 10 và 15 ngày,ự ủ ậ ự ấ  

10 g m u đ t m i khay đẫ ấ ỗ ượ ấc l y ra đ  xác đ nh n ng đ  propanil còn l i.ể ị ồ ộ ạ  

Trước khi l y m u, khay đ t đấ ẫ ấ ượ ắc l c b ng tay ch ng 3 phút đ  tr n đ u.ằ ừ ể ộ ề

M u đ t   trẫ ấ ủ ước h t đế ược xác đ nh đ   m r i trích ly propanil.ị ộ ẩ ồ  Propanil trong đ t đấ ược trích ly b ng methanol. 5 g đ t đằ ấ ược cho vào  ngố  

nh a có th  tích 30 mL, b  sung thêm 10 mL methanol r i l c b ng máy l cự ể ổ ồ ắ ằ ắ  

 500 vòng/phút trong 30 phút, và cu i cùng là vortex trong 5 phút. Dung

d ch   đị ược   đ   yên   trong   10   phút   đ   các   h t   l   l ng   chìm   xu ng   đáy.ể ể ạ ơ ử ố  Methanol được hút ra b ng micropipette đ  xác đ nh n ng đ  propanil trongằ ể ị ồ ộ  dung d ch. Methanol đị ược hút ra h t, r i l i trích ly thêm m t l n n a.ế ồ ạ ộ ầ ữ  Dung D ch methanol này đị ược dùng đ  xác đ nh n ng đ  propanil còn l iể ị ồ ộ ạ  trong đ t. N ng đ  propanil trong đ t đấ ồ ộ ấ ược tính sau c  hai l n trích ly.ả ầ

Trước khi ti n hành, s  trích ly đế ự ược th c hi n   n ng đ  propanilự ệ ở ồ ộ  

đã bi t (10 mg/kg đ t) đ  xác đ nh t  l  % propanil có th  trích ly đế ấ ể ị ỷ ệ ể ượ  c

K t qu  cho th y, hi u qu  trích ly t  đ t thu v  ru ng ngô và đ t núiế ả ấ ệ ả ừ ấ ề ộ ấ  

C m tấ ương  ng là 92,0% và 94,6%ứ

2.2.4. Phương pháp phân tích n ng đ  propanil và đ   m đ tồ ộ ộ ẩ ấ

N ng đ  propanil đồ ộ ược xác đ nh b ng s c ký l ng hi u năng caoị ằ ắ ỏ ệ  (HPLC), hi u  Ultimate 3000,  đệ ược  s n  xu t  b i  hãng  Dionex, Thermoả ấ ở  Scientific, Hoa K  Acetonitrile (100%) làm pha đ ng v i t c đ  b m là 1,0ỳ ộ ớ ố ộ ơ  mL/phút. S  phát hi n c  ch t trong dung d ch đự ệ ơ ấ ị ược th c hi n nh  UVự ệ ờ  detector   240 nm, ho t đ ng đở ạ ộ ược đi u ch nh   nhi t đ  40 ề ỉ ở ệ ộ oC. 

Môi trường MM và h n h p methanol trích ly t  đ t có ch a propanilỗ ợ ừ ấ ứ  

là đ i tố ượng dùng đ  ch y HPLC. 0,5 mL môi trể ạ ường được chuy n sangể  1,0 mL­eppendorf, ly tâm v i t c đ  10000 rpm trong 5 phút đ  lo i b  viớ ố ộ ể ạ ỏ  khu n và t p ch t trong dung d ch. 0,08 mL ch t l ng sau khi ly tâm đẩ ạ ấ ị ấ ỏ ượ  chút   b ng   micropipette   chuy n   sang   eppendorf   khác   có   ch a   0,320   mLằ ể ứ  acetonitrile. H n h p này đỗ ợ ượ ọc l c qua màng l c nylon 0,45 µm trọ ước khi 

ch y HPLC.ạ

HPLC s  nh n di n propanil v i ẽ ậ ệ ớ s  xu t hi n c a đ nh có th i gianự ấ ệ ủ ỉ ờ  

xu t hi n (th i gian l u) là 3,9 phút. ấ ệ ờ ư D a vào đ  l n c a đ nh (peak height)ự ộ ớ ủ ỉ  

và so sánh v i đớ ường chu n đ  tính ra n ng đ  propanil trong dung d ch. ẩ ể ồ ộ ị

Đ   m c a đ t (%) độ ẩ ủ ấ ược xác đ nh b ng công th c: ị ằ ứ  

Trong đó Ma và Mk tương  ng là kh i lứ ố ượng đ t  m và đ t khô. Đ tấ ẩ ấ ấ  khô là đ t đấ ượ ủc   trong t  s y   nhi t đ  75 ủ ấ ở ệ ộ oC trong 48 gi  Sau khi  , đ tờ ủ ấ  

tr  nên khô và không ch a nở ứ ướ ực t  do

2.2.5. Phương pháp đ m vi khu n trong đ t và dung d chế ẩ ấ ị

Đ i v i s  vi khu n trong đ t, 1,0 g đ t nghi n nh , đố ớ ố ẩ ấ ấ ề ỏ ược cho vào 

100 mL nước mu i kh  trùng (0,85%) r i l c b ng máy l c   t c đ  500ố ử ồ ắ ằ ắ ở ố ộ  rpm trong 10 phút. 0,5 mL dung d ch đị ược chuy n sang  ng ch a 4,5 mLể ố ứ  dung d ch nị ước mu i khác. H n h p đố ỗ ợ ượ ắc l c đ u b ng máy tr n trong haiề ằ ộ