Nghiên cứu xác một số trình tự AND cho xác định loài dó trầm aquilaria yunnaensis ở việt nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU XÁC MỘT SỐ TRÌNH TỰ AND CHO XÁC ĐỊNH LỒI DĨ TRẦM AQUILARIA YUNNANENSIS Ở VIỆT NAM NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Thơ Sinh viên thực : Phạm Thị Nhung Lớp : K59 – CNSH Khóa học : 2014 - 2020 Hà Nội, 2020 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.Tổng quan Dó Trầm 1.1.1.Phân loại học 1.1.2.Phân bố chi Aquilaria 1.1.3 Đặc điểm hình thái 10 1.1.4 Giá trị kinh tế sinh thái Dó Trầm 11 1.1.5 Một số nghiên cứu tạo Trầm Trầm hƣơng 12 1.1.6 Thực trạng thách thức giá trị Trầm Hƣơng thị trƣờng 13 1.2 Tổng quan DNA barcode (DNA mã vạch) 14 1.2.1 Giới thiệu AND mã vạch (DNA barcode) 14 1.2.2 Đặc điểm trình tự mã vạch 16 1.3 Những locus đƣợc sử dụng phƣơng pháp ADN mã vạch thực vật 17 1.3.1 Trình tự gen nhân 17 1.3.2 Trình tự gen luc lạp 17 1.3.3 Trình tự gen rbcL 19 1.3.4 Trình tự gen matK 19 1.3.5 Trình tự gen ycf5 19 1.3.6 Trình tự gen rpoB rpoC1 19 1.3.7 Trình tự hai gen trnH-psbA 20 1.3.8 Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA) 20 1.3.9 Vùng gen mã hóa ribosome 20 1.4 Ứng dụng mã vạch DNA 21 1.5 Những thành tựu nghiên cứu DNA thực vật 22 1.5.1 Những thành tựu nghiên cứu giới 22 1.5.3 Nghiên cứu Mã vạch ADN Dó Trầm Aquilaria 24 CHƢƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU, VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 26 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.3 Địa điểm tiến hành thí nghiệm 26 2.4 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 26 2.4.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.3.2 Hóa chất 27 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số 28 2.4.2 Phƣơng pháp điện di kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết 29 2.4.3 Phƣơng pháp PCR với mồi đặc hiệu 30 2.4.4 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR 32 2.4.5 Phƣơng pháp giải trình tự 32 2.4.6 Phƣơng pháp phân tích số liệu 32 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Tách chiết ADN tổng số 33 Giếng: 1: HBQN02; 2: TDC02; 3: TD03; TD05; TD07 33 3.2 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kỹ thuật PCR 33 3.2.1 Kết nhân đoạn gen matK 33 3.2.2 Kết nhân đoạn gen rbcL 34 3.2.3 Kết nhân đoạn gen trnH-psbA 35 3.2.4 Kết nhân đoạn gen ITS2 36 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thông tin số mồi ADN mã vạch thiết kế cho hệ gen lục lạp 17 Bảng 2.1: Mẫu kí hiệu mẫu nghiên cứu 27 Bảng 2.1: Thành phần nồng độ chất sử dụng phản ứng PCR 30 Bảng 2.2: Trình tự thơng tin cặp mồi 31 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR mồi ITS2 31 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Dó Trầm chụp từ dƣới lên 10 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen matK 34 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen trnH-psbA 36 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen rbcL 35 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu rèn luyện trường Đại học Lâm Nghiệp, để vượt qua khó khăn, thử thách đạt kết mong muốn học tập sống, ngồi cố gắng thân, tơi nhận quan tâm, giúp đỡ từ thầy cơ, gia đình bạn bè Nhân dịp này, cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo tận tình hướng dẫn, giảng dạy tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu rèn luyện trường Đại học Lâm Nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Nguyễn Thị Thơ trực tiếp hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Với kiến thức kỹ cô truyền dạy khơng giúp tơi hồn thành khóa luận mà cịn tài sản quý báu theo sau Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp trường Đại học Lâm Nghiệp tạo điều kiện thuận lợi cho tơi có môi trường tốt để học tập, nghiên cứu rèn luyện Cuối c ng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cơ, gia đình, bạn bè - người động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập, rèn luyện thực khóa luận tốt nghiệp Do q trình thực cịn có nhiều hạn chế mặt thời gian, kiến thức kinh nghiệm khơng tránh khỏi thiếu sót định Tơi mong nhận ý kiến đóng góp thầy bạn để khóa luận tốt nghiệp tơi hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2020 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Các từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Mẫu Dó Trầm TD03 TD03 HBQN02 Mẫu Dó Trầm HBQN02 TD07 Mẫu Dó Trầm TD07 TD05 Mẫu Dó Trầm TD05 TDC02 Mẫu Dó Trầm TDC02 F-Primer Mồi xi R- Primer Mồi ngược A yunnanensis Aquilaria yunnanensis A crassna Aquilaria crassna A baillonii Aquilaria baillonii A rugosa Aquilaria rugosa A malaccensis Aquilaria malaccensis A sinensis Aquilaria sinensis A banaensis Aquilaria banaensis TAE Tris-Acetate-EDTA DNA (ADN) Axit deoxyribonucleic ITS v ng DNA nằm gen NCBI Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học PCR Phản ứng chuỗi polymerase UV Tia cực tím CBOL Consortium for the Barcode of Life cpDNA gen lục lạp Cytb Cytochrome b EDTA axit ethylenediamine tetraacetic IGS v ng liên gen kb 1000 cặp base bp Cặp base PVP Polyvinyl pyrrolidone RFLP Phân tích đa hình trình tự DNA RAPD Sự khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình RNA Axit ribonucleic rRNA ARN ribosome tRNA ARN vận chuyển ĐẶT VẤN ĐỀ Dó trầm (Aquilaria yunnanensis) thuộc chi Dó Trầm (Aquilaria), họ Trầm (Thymelaeaceae), loài biết đến đặc hữu Vân Nam, gần nhà khoa học Trường Đại học Lâm nghiệp tìm thấy chúng Quảng Ninh Về mặt hình thái hoa, số mẫu thu thập Quảng Ninh cho thấy chúng lồi Aquilaria yunnanensis Tuy nhiên để khẳng định xác việc mẫu tìm thấy Quảng Ninh có lồi A yunnanensis hay khơng việc phân tích DNA barcoding mang lại chứng phân tử có giá trị phân loại cao Mặt khác, A yunnanensis lồi Dó trầm khác thuộc chi Aquilaria có khả tạo trầm với giá trị kinh tế cao Trầm hương sản phẩm quý mặt hàng xuất đem lại lợi nhuận lớn Trong y học cổ truyền trầm d ng làm thuốc chữa bệnh, công nghiệp mỹ phẩm d ng chất định hương, hế biến dầu thơm, nước hoa, …Gỗ trầm d ng làm đồ d ng gia dụng Vì giá trị cao Trầm hương nên thị trường xuất trầm hương giả - sử dụng loại gỗ khơng có khả tạo trầm tẩm ướp loại hương liệu tổng hợp chí hóa chất có hại cho sức khỏe người Để phục vụ cho việc xác định nguồn gốc loài dược liệu, chủng loài vật liệu, kiểm nghiệm nguồn dược liệu xác Hiện nay, chuyên gia nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật mã vạch DNA- xác định đoạn DNA barcode phương pháp tiên tiến, sử dụng trình tự đoạn DNA ngắn đặc trưng nằm gen vi sinh vật nghiên cứu để nhận biết phân biệt loài Phương pháp mang lại hiệu cao thời gian ngắn, góp phần khơng nhỏ vào định danh bảo tồn loài thực vật giới Xuất phát từ nguyên nhân trên, thực nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu xác số trình tự ADN cho xác định lồi Dó Trầm Aquilaria yunnanensis Việt Nam" nhằm xây dựng sở liệu ADN mã vạch, phục vụ cho giám định loài quản lý nguồn tài nguyên sinh vật CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Dó Trầm 1.1.1 Phân loại học Tên khoa học: Aquilaria yunnanensis Phân loại: Giới: Plantae Bộ: Myrtales Họ: Thymelaeaceae Chi: Aquilaria Loài: yunnanensis Ở Việt Nam, Cây Dó Trầm cịn gọi cịn gọi Dó Bầu, Trầm Dó, Trầm hương hay Kỳ Nam 1.1.2 Phân bố chi Aquilaria Chi Aquilaria gồm 21 loại phân bố Châu Á khu vực rừng mưa Indonesia, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam, Malaysia, Bắc Ấn, Trung Quốc, Phiplipes, Borneo New Guinea Ở nước ta, Dó Trầm phát gồm loài chi trầm phân bố rải rác rừng rậm nhiệt đới, rừng ẩm nguyên sinh thuộc tỉnh Tuyên Quang, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, đặc biệt từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quãng Ngãi, Bình Định, Ninh Thuận, Bình Thuận đến Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang đảo Phú Quốc, Quảng Ninh: A crassna, A baillonii, A rugosa, A malaccensis, A sinensis, A banaensis, A yunnanensis Trong đó, lồi A yunnanensis S C Huang (Thymelaeacea) biết đến loài đặc hữu Tỉnh Vân Nam, Trung Quốc (Aquilaria yunnanensis SC Huang, Acta Bot Vân Nam 7: 277 1985.), ghi nhận lần từ khu bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn Kỳ Thượng, Tỉnh Quảng Ninh, Việt Nam (Aquilaria yunnanensis S.C Huang (Thymelaeaceae) 3.3 Kết phân tích trình tự gen 3.3.1 Kết so sánh trình tự gen matK Sản phẩm PCR đoạn gen matK sau giải trình tự xử lý số liệu thu đoạn gen có kích thước 815bp Trình tự giống mẫu nghiên cứu Kết giải trình tự đoạn gen matK sau: AGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATTTGAATTTGAAGAG TCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAAGATTCTTTTTTTT CCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTCTCCGTAACCAATC CTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCTATTTCTATGGAAA AATCGAACATCTTGTAGAAGTTTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACCTATCCTTGTTCAA GGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTGCTTCAAACGATAC GCCTCTTATGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGCAATATCATTTTTA TGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAATATTCTCTTGACTT TCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCAGTCAAATGCTAGA AAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAATGCCAATGATTTC TCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTCATCCTATTAGTAA GCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTTTGCGTATATGCAG AAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGTATCGAATAAAATA TATACTTCGGCTTTCTTGTCTTAAAACTTTGGCTC Các trình tự gen so sánh với số trình tự gen matK tương ứng số lồi c ng chi Aquilaria cơng bố ngân hàng gen giới để tìm khác biệt mức độ loài loài Một số trình tự gen ngân hàng gen giới sử dụng bảng 3.1 đây: Bảng 3.1 Một số lồi có trình tự gen matK (trên ngân hàng gen NCBI) tƣơng đồng với trình tự gen matK m u m u nghiên cứu Tỷ lệ tƣơng STT Tên loài Mã số đồng (%) AquilariA yunnanensis KY927340.1 100 Aquilaria sinensis KY927333.1 100 Aquilaria crassna KY927337.1 99,51 HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac AGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATTTGAATTTGAAGAG AGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATTTGAATTTGAAGAG AGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATTTGAATTTGAAGAG AGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATTTGAATTTGAAGAG AGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATTTGAATTTGAAGAG AGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATTTGAATTTGAAGAG AGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATTTGAATTTGAAGAG AGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATTTGAATTTGAAGAG HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac TCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAAGATTCTTTTTTTT TCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAAGATTCTTTTTTTT TCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAAGATTCTTTTTTTT TCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAAGATTCTTTTTTTT TCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAAGATTCTTTTTTTT TCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAAGATTCTTTTTTTT TCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAAGATTCTTTTTTTT TCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAAGATTCTTTTTTTT 37 HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac CCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTCTCCGTAACCAATC CCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTCTCCGTAACCAATC CCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTCTCCGTAACCAATC CCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTCTCCGTAACCAATC CCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTCTCCGTAACCAATC CCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTCTCCGTAACCAATC CCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTCTCCGTAACCAATC CCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTCTCCGTAACCAATC HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac CTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCTATTTCTATGGAAA CTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCTATTTCTATGGAAA CTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCTATTTCTATGGAAA CTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCTATTTCTATGGAAA CTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCTATTTCTATGGAAA CTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCTATTTCTATGGAAA CTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCTATTTCTATGGAAA CTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCTATTTCTATGGAAA HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac 262 291 AATCGAACATCTTGTAGAAGTTTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACCTATCCTTGTTCAA AATCGAACATCTTGTAGAAGTTTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACCTATCCTTGTTCAA AATCGAACATCTTGTAGAAGTTTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACCTATCCTTGTTCAA AATCGAACATCTTGTAGAAGTTTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACCTATCCTTGTTCAA AATCGAACATCTTGTAGAAGTTTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACCTATCCTTGTTCAA AATCGAACATCTTGTAGAAGTTTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACCTATCCTTGTTCAA AATCGAACATCTTGTAGAAGTTTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACCTATCCTTGTTCAA AATCGAACATCTTGTAGAAGTCTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACCTATGCTTGTTCAA HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac GGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTGCTTCAAACGATAC GGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTGCTTCAAACGATAC GGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTGCTTCAAACGATAC GGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTGCTTCAAACGATAC GGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTGCTTCAAACGATAC GGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTGCTTCAAACGATAC GGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTGCTTCAAACGATAC GGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTGCTTCAAACGATAC HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac 368 GCCTCTTATGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGCAATATCATTTTTA GCCTCTTATGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGCAATATCATTTTTA GCCTCTTATGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGCAATATCATTTTTA GCCTCTTATGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGCAATATCATTTTTA GCCTCTTATGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGCAATATCATTTTTA GCCTCTTATGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGCAATATCATTTTTA GCCTCTTATGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGCAATATCATTTTTA GCCTCTTCTGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGCAATATCATTTTTA HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac TGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAATATTCTCTTGACTT TGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAATATTCTCTTGACTT TGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAATATTCTCTTGACTT TGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAATATTCTCTTGACTT TGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAATATTCTCTTGACTT TGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAATATTCTCTTGACTT TGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAATATTCTCTTGACTT TGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAATATTCTCTTGACTT HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay TCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCAGTCAAATGCTAGA TCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCAGTCAAATGCTAGA TCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCAGTCAAATGCTAGA TCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCAGTCAAATGCTAGA TCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCAGTCAAATGCTAGA TCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCAGTCAAATGCTAGA 38 KY927333.1As KY927337.1Ac TCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCAGTCAAATGCTAGA TCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCAGTCAAATGCTAGA HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac 589 AAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAATGCCAATGATTTC AAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAATGCCAATGATTTC AAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAATGCCAATGATTTC AAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAATGCCAATGATTTC AAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAATGCCAATGATTTC AAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAATGCCAATGATTTC AAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAATGCCAATGATTTC AAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAATTCCAATGATTTC HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac TCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTCATCCTATTAGTAA TCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTCATCCTATTAGTAA TCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTCATCCTATTAGTAA TCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTCATCCTATTAGTAA TCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTCATCCTATTAGTAA TCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTCATCCTATTAGTAA TCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTCATCCTATTAGTAA TCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTCATCCTATTAGTAA HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac GCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTTTGCGTATATGCAG GCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTTTGCGTATATGCAG GCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTTTGCGTATATGCAG GCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTTTGCGTATATGCAG GCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTTTGCGTATATGCAG GCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTTTGCGTATATGCAG GCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTTTGCGTATATGCAG GCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTTTGCGTATATGCAG HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac AAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGTATCGAATAAAATA AAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGTATCGAATAAAATA AAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGTATCGAATAAAATA AAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGTATCGAATAAAATA AAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGTATCGAATAAAATA AAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGTATCGAATAAAATA AAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGTATCGAATAAAATA AAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGTATCGAATAAAATA HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac TATACTTCGGCTTTCTTGTCTTAAAACTTTGGCTC TATACTTCGGCTTTCTTGTCTTAAAACTTTGGCTC TATACTTCGGCTTTCTTGTCTTAAAACTTTGGCTC TATACTTCGGCTTTCTTGTCTTAAAACTTTGGCTC TATACTTCGGCTTTCTTGTCTTAAAACTTTGGCTC TATACTTCGGCTTTCTTGTCTTAAAACTTTGGCTC TATACTTCGGCTTTCTTGTCTTAAAACTTTGGCTC TATACTTCGGCTTTCTTGTCTTAAAACTTTGGCTC 39 Hình 3.6 Kết so sánh trình tự gen matK m u nghiên cứu với trình tự matK số trình tự gen đƣợc công bố NCBI Từ bảng 3.1 hình 3.6 ta thấy, mẫu nghiên cứu có trình tự gen matK giống tương đồng 100% so với trình tự gen matK lồi A yunnanensis A sinensis Chúng khác với loài A crassna với mức độ khác biệt nhỏ 0,49% Cụ thể khác biệt nằm vị trí: 262, 291, 368 589 (như hình 3.6) Như vậy, trình tự đoạn gen matK chưa đủ sở làm ADN mã vạch việc phân biệt loài thuộc c ng chi Aquilaria 3.3.2 Kết so sánh trình tự gen rbcL Trình tự đoạn gen rbCL thu khơng có khác biệt mẫu nghiên cứu với kích thước 569bp Trình tự đoạn gen thu sau: AACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGAGTATAAATTGACTTA TTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCC TCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGG TACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGGCGATG CTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTATGTAGCTTACCC CTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTTGGTAATGTA TTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAATCCCTACTTCTTATA TTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGT ACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAAAACT ACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTAC Những trình tự so sánh với sở liệu NCBI qua số đoạn gen cụ thể như: KY927296.1 (A yunnanensis), KY927292.1 (A sinensis) KY927293.1 (Acrassna) thu kết mức độ tương đồng 100% mẫu nghiên cứu với loài A yunnanensis (KY927296.1), A sinensis (KY927292.1) so sánh Các mẫu nghiên cứu có khác biệt nhỏ (duy nucleotit) vị trí số 31 đoạn gen nghiên cứu so với A crassna Cụ thể: vị trí 31 nucleotit loại A mẫu nghiên cứu loài A crassna loại G Điều cho thấy, trình tự đoạn gen rbcL khuếch đại cặp mồi rP1F rP1R chưa đủ giá trị việc giám định lồi Dó trầm thuộc chi Aquilaria HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927296.1 KY927292.1 KY927293.1 31 -AACAGAGAC TAAAGCAAGT GTTGGATTCA AAGCTGGTGT -AACAGAGAC TAAAGCAAGT GTTGGATTCA AAGCTGGTGT -ACAGAGAC TAAAGCAAGT GTTGGATTCA AAGCTGGTGT CCC CAACAGAGAC TAAAGCAAGT GTTGGATTCA AAGCTGGTGT ATGTCACCAC AAACAGAGAC TAAAGCAAGT GTTGGATTCA AAGCTGGTGT ATGTCACCAC AAACAGAGAC TAAAGCAAGT GTTGGATTCA AAGCTGGTGT ATGTCACCAC AAACAGAGAC TAAAGCAAGT GTTGGATTCA AAGCTGGTGT ATGTCACCAC AAACAGAGAC TAAAGCAAGT GTTGGATTCA AGGCTGGTGT HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927296.1 KY927292.1 KY927293.1 TAAAGAGTAT AAATTGACTT ATTATACTCC TGAATATGAA ACCAAAGATA TAAAGAGTAT AAATTGACTT ATTATACTCC TGAATATGAA ACCAAAGATA TAAAGAGTAT AAATTGACTT ATTATACTCC TGAATATGAA ACCAAAGATA TAAAGAGTAT AAATTGACTT ATTATACTCC TGAATATGAA ACCAAAGATA TAAAGAGTAT AAATTGACTT ATTATACTCC TGAATATGAA ACCAAAGATA TAAAGAGTAT AAATTGACTT ATTATACTCC TGAATATGAA ACCAAAGATA TAAAGAGTAT AAATTGACTT ATTATACTCC TGAATATGAA ACCAAAGATA TAAAGAGTAT AAATTGACTT ATTATACTCC TGAATATGAA ACCAAAGATA HQBN02 CTGATATCTT GGCAGCATTC CGAGTAACTC CTCAACCTGG AGTTCCGCCT 40 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927296.1 KY927292.1 KY927293.1 CTGATATCTT GGCAGCATTC CGAGTAACTC CTCAACCTGG AGTTCCGCCT CTGATATCTT GGCAGCATTC CGAGTAACTC CTCAACCTGG AGTTCCGCCT CTGATATCTT GGCAGCATTC CGAGTAACTC CTCAACCTGG AGTTCCGCCT CTGATATCTT GGCAGCATTC CGAGTAACTC CTCAACCTGG AGTTCCGCCT CTGATATCTT GGCAGCATTC CGAGTAACTC CTCAACCTGG AGTTCCGCCT CTGATATCTT GGCAGCATTC CGAGTAACTC CTCAACCTGG AGTTCCGCCT CTGATATCTT GGCAGCATTC CGAGTAACTC CTCAACCTGG AGTTCCGCCT HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927296.1 KY927292.1 KY927293.1 GAGGAAGCAG GGGCTGCGGT AGCTGCTGAA TCTTCTACTG GTACATGGAC GAGGAAGCAG GGGCTGCGGT AGCTGCTGAA TCTTCTACTG GTACATGGAC GAGGAAGCAG GGGCTGCGGT AGCTGCTGAA TCTTCTACTG GTACATGGAC GAGGAAGCAG GGGCTGCGGT AGCTGCTGAA TCTTCTACTG GTACATGGAC GAGGAAGCAG GGGCTGCGGT AGCTGCTGAA TCTTCTACTG GTACATGGAC GAGGAAGCAG GGGCTGCGGT AGCTGCTGAA TCTTCTACTG GTACATGGAC GAGGAAGCAG GGGCTGCGGT AGCTGCTGAA TCTTCTACTG GTACATGGAC GAGGAAGCAG GGGCTGCGGT AGCTGCTGAA TCTTCTACTG GTACATGGAC HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927296.1 KY927292.1 KY927293.1 AACTGTGTGG ACCGACGGGC TTACCAGCCT TGATCGTTAC AAAGGGCGAT AACTGTGTGG ACCGACGGGC TTACCAGCCT TGATCGTTAC AAAGGGCGAT AACTGTGTGG ACCGACGGGC TTACCAGCCT TGATCGTTAC AAAGGGCGAT AACTGTGTGG ACCGACGGGC TTACCAGCCT TGATCGTTAC AAAGGGCGAT AACTGTGTGG ACCGACGGGC TTACCAGCCT TGATCGTTAC AAAGGGCGAT AACTGTGTGG ACCGACGGGC TTACCAGCCT TGATCGTTAC AAAGGGCGAT AACTGTGTGG ACCGACGGGC TTACCAGCCT TGATCGTTAC AAAGGGCGAT AACTGTGTGG ACCGACGGGC TTACCAGCCT TGATCGTTAC AAAGGGCGAT HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927296.1 KY927292.1 KY927293.1 GCTACCACAT CGAGCCCGTT GCTGGGGAAG AAAATCAATA TATATGTTAT GCTACCACAT CGAGCCCGTT GCTGGGGAAG AAAATCAATA TATATGTTAT GCTACCACAT CGAGCCCGTT GCTGGGGAAG AAAATCAATA TATATGTTAT GCTACCACAT CGAGCCCGTT GCTGGGGAAG AAAATCAATA TATATGTTAT GCTACCACAT CGAGCCCGTT GCTGGGGAAG AAAATCAATA TATATGTTAT GCTACCACAT CGAGCCCGTT GCTGGGGAAG AAAATCAATA TATATGTTAT GCTACCACAT CGAGCCCGTT GCTGGGGAAG AAAATCAATA TATATGTTAT GCTACCACAT CGAGCCCGTT GCTGGGGAAG AAAATCAATA TATATGTTAT HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927296.1 KY927292.1 KY927293.1 GTAGCTTACC CCTTAGACCT TTTTGAAGAG GGTTCTGTTA CTAACATGTT GTAGCTTACC CCTTAGACCT TTTTGAAGAG GGTTCTGTTA CTAACATGTT GTAGCTTACC CCTTAGACCT TTTTGAAGAG GGTTCTGTTA CTAACATGTT GTAGCTTACC CCTTAGACCT TTTTGAAGAG GGTTCTGTTA CTAACATGTT GTAGCTTACC CCTTAGACCT TTTTGAAGAG GGTTCTGTTA CTAACATGTT GTAGCTTACC CCTTAGACCT TTTTGAAGAG GGTTCTGTTA CTAACATGTT GTAGCTTACC CCTTAGACCT TTTTGAAGAG GGTTCTGTTA CTAACATGTT GTAGCTTACC CCTTAGACCT TTTTGAAGAG GGTTCTGTTA CTAACATGTT HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927296.1 KY927292.1 KY927293.1 TACTTCCATT GTTGGTAATG TATTTGGGTT CAAAGCCCTG CGCGCTCTAC TACTTCCATT GTTGGTAATG TATTTGGGTT CAAAGCCCTG CGCGCTCTAC TACTTCCATT GTTGGTAATG TATTTGGGTT CAAAGCCCTG CGCGCTCTAC TACTTCCATT GTTGGTAATG TATTTGGGTT CAAAGCCCTG CGCGCTCTAC TACTTCCATT GTTGGTAATG TATTTGGGTT CAAAGCCCTG CGCGCTCTAC TACTTCCATT GTTGGTAATG TATTTGGGTT CAAAGCCCTG CGCGCTCTAC TACTTCCATT GTTGGTAATG TATTTGGGTT CAAAGCCCTG CGCGCTCTAC TACTTCCATT GTTGGTAATG TATTTGGGTT CAAAGCCCTG CGCGCTCTAC HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927296.1 KY927292.1 KY927293.1 GTCTAGAAGA TCTGCGAATC CCTACTTCTT ATATTAAAAC TTTCCAAGGT GTCTAGAAGA TCTGCGAATC CCTACTTCTT ATATTAAAAC TTTCCAAGGT GTCTAGAAGA TCTGCGAATC CCTACTTCTT ATATTAAAAC TTTCCAAGGT GTCTAGAAGA TCTGCGAATC CCTACTTCTT ATATTAAAAC TTTCCAAGGT GTCTAGAAGA TCTGCGAATC CCTACTTCTT ATATTAAAAC TTTCCAAGGT GTCTAGAAGA TCTGCGAATC CCTACTTCTT ATATTAAAAC TTTCCAAGGT GTCTAGAAGA TCTGCGAATC CCTACTTCTT ATATTAAAAC TTTCCAAGGT GTCTAGAAGA TCTGCGAATC CCTACTTCTT ATATTAAAAC TTTCCAAGGT 41 HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927296.1 KY927292.1 KY927293.1 CCGCCTCATG GCATCCAAGT TGAAAGAGAT AAATTGAACA AGTACGGCCG CCGCCTCATG GCATCCAAGT TGAAAGAGAT AAATTGAACA AGTACGGCCG CCGCCTCATG GCATCCAAGT TGAAAGAGAT AAATTGAACA AGTACGGCCG CCGCCTCATG GCATCCAAGT TGAAAGAGAT AAATTGAACA AGTACGGCCG CCGCCTCATG GCATCCAAGT TGAAAGAGAT AAATTGAACA AGTACGGCCG CCGCCTCATG GCATCCAAGT TGAAAGAGAT AAATTGAACA AGTACGGCCG CCGCCTCATG GCATCCAAGT TGAAAGAGAT AAATTGAACA AGTACGGCCG CCGCCTCATG GCATCCAAGT TGAAAGAGAT AAATTGAACA AGTACGGCCG HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927296.1 KY927292.1 KY927293.1 TCCCCTATTG GGATGTACTA TTAAACCTAA ATTGGGGTTA TCCGCTAAAA TCCCCTATTG GGATGTACTA TTAAACCTAA ATTGGGGTTA TCCGCTAAAA TCCCCTATTG GGATGTACTA TTAAACCTAA ATTGGGGTTA TCCGCTAAAA TCCCCTATTG GGATGTACTA TTAAACCTAA ATTGGGGTTA TCCGCTAAAA TCCCCTATTG GGATGTACTA TTAAACCTAA ATTGGGGTTA TCCGCTAAAA TCCCCTATTG GGATGTACTA TTAAACCTAA ATTGGGGTTA TCCGCTAAAA TCCCCTATTG GGATGTACTA TTAAACCTAA ATTGGGGTTA TCCGCTAAAA TCCCCTATTG GGATGTACTA TTAAACCTAA ATTGGGGTTA TCCGCTAAAA HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927296.1 KY927292.1 KY927293.1 ACTACGGTAG AGCGGTTTAT GAATGTCTAC ACTACGGTAG AGCGGTTTAT GAATGTCTAC ACTACGGTAG AGCGGTTTAT GAATGTCTAC ACTACGGTAG AGCGGTTTAT GAATGTCTAC ACTACGGTAG AGCGGTTTAT GAATGTCTAC ACTACGGTAG AGCGGTTTAT GAATGTCTAC ACTACGGTAG AGCGGTTTAT GAATGTCTAC ACTACGGTAG AGCGGTTTAT GAATGTCTAC Hình 3.7 Kết trƣơng đồng trình tự đoạn gen rbcL m u nghiên cứu với đoạn gen tƣơng ứng NCBI 3.3.3 Kết so sánh trình tự gen trnH-psbA Đoạn gen trnH-psbA mẫu nghiên cứu thu sau xử lý số liệu có kích thước 416 bp khơng có khác biệt nhận mẫu nghiên cứu Trình tự đoạn gen cụ thể sau: ATTCACAATCCACTGCCTTAATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCACTTTTATGAATATT AGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGAACTTCACAAAAGATT GG\AAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAGACCACCTTTTCCTATT TTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGTAAATAAAAGACTACT AAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAACAAGAAATTGGTTA TTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACACTAAGACAAAAGTCTTATCCA TTTGTAGATGGAGCTTCAATAGCAGCTAGGTCTAGGGGGAAGTTATGAGCATTACG 42 Trình tự gen trnH-psbA thu được, so sánh với số trình tự gen trnH-psbA tương ứng công bố NCBI KY927208.1 (A yunnanensis), KY927204.1 (A sinensis) KY927202.1 (A crassna) Khơng có khác biệt trình tự đoạn gen trnH-psbA mẫu nghiên cứu với ba lồi so sánh (hình 3.8) Điều cho thấy đoạn gen trnH-psbA nhân lên cặp mồi trnPF1 psbPR1 có ý nghĩa cơng tác giám định lồi nghiên cứu phát sinh chủng loại loài Aquilaria HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac ATTCACAATCCACTGCCTTAATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCACTTTTATGAATAT ATTCACAATCCACTGCCTTAATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCACTTTTATGAATAT ATTCACAATCCACTGCCTTAATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCACTTTTATGAATAT ATTCACAATCCACTGCCTTAATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCACTTTTATGAATAT ATTCACAATCCACTGCCTTAATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCACTTTTATGAATAT ATTCACAATCCACTGCCTTAATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCACTTTTATGAATAT ATTCACAATCCACTGCCTTAATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCACTTTTATGAATAT ATTCACAATCCACTGCCTTAATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCACTTTTATGAATAT HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac TAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGAACTTCACAAAAGAT TAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGAACTTCACAAAAGAT TAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGAACTTCACAAAAGAT TAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGAACTTCACAAAAGAT TAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGAACTTCACAAAAGAT TAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGAACTTCACAAAAGAT TAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGAACTTCACAAAAGAT TAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGAACTTCACAAAAGAT HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac TGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAGACCACCTTTTCCTA TGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAGACCACCTTTTCCTA TGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAGACCACCTTTTCCTA TGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAGACCACCTTTTCCTA TGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAGACCACCTTTTCCTA TGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAGACCACCTTTTCCTA TGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAGACCACCTTTTCCTA TGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAGACCACCTTTTCCTA HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac TTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGTAAATAAAAGACTAC TTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGTAAATAAAAGACTAC TTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGTAAATAAAAGACTAC TTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGTAAATAAAAGACTAC TTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGTAAATAAAAGACTAC TTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGTAAATAAAAGACTAC TTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGTAAATAAAAGACTAC TTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGTAAATAAAAGACTAC HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac TAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAACAAGAAATTGGTTA TAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAACAAGAAATTGGTTA TAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAACAAGAAATTGGTTA TAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAACAAGAAATTGGTTA TAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAACAAGAAATTGGTTA TAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAACAAGAAATTGGTTA TAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAACAAGAAATTGGTTA TAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAACAAGAAATTGGTTA HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay TTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACACTAAGACAAAAGTCTTATCC TTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACACTAAGACAAAAGTCTTATCC TTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACACTAAGACAAAAGTCTTATCC TTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACACTAAGACAAAAGTCTTATCC TTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACACTAAGACAAAAGTCTTATCC TTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACACTAAGACAAAAGTCTTATCC 43 KY927333.1As KY927337.1Ac TTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACACTAAGACAAAAGTCTTATCC TTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACACTAAGACAAAAGTCTTATCC HQBN02 TDC02 DT03 DT05 DT07 KY927340.1Ay KY927333.1As KY927337.1Ac ATTTGTAGATGGAGCTTCAATAGCAGCTAGGTCTAGGGGGAAGTTATGAGCATTACG ATTTGTAGATGGAGCTTCAATAGCAGCTAGGTCTAGGGGGAAGTTATGAGCATTACG ATTTGTAGATGGAGCTTCAATAGCAGCTAGGTCTAGGGGGAAGTTATGAGCATTACG ATTTGTAGATGGAGCTTCAATAGCAGCTAGGTCTAGGGGGAAGTTATGAGCATTACG ATTTGTAGATGGAGCTTCAATAGCAGCTAGGTCTAGGGGGAAGTTATGAGCATTACG ATTTGTAGATGGAGCTTCAATAGCAGCTAGGTCTAGGGGGAAGTTATGAGCATTACG ATTTGTAGATGGAGCTTCAATAGCAGCTAGGTCTAGGGGGAAGTTATGAGCATTACG ATTTGTAGATGGAGCTTCAATAGCAGCTAGGTCTAGGGGGAAGTTATGAGCATTACG Hình 3.8 Kết so sánh trình tự đoạn gen trnH-psbA m u nghiên cứu với trình tự NCBI 3.3.4 Kết so sánh trình tự gen ITS2 Kết xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen ITS2 nhân có kích thước 390bp, có điểm khác biệt tìm thấy hai mẫu DT05 DT07 với mẫu cịn lại vị trí: 74, 322 363 (hình 3.9) Ngồi ra, mẫu DT07 cịn có thêm điểm sai khác với mẫu cịn lại vị trí 160 Mặt khác, so sánh trình tự thu đoạn gen ITS2 với trình tự gen tương ứng loài A yunnanensis (MH134148.1), A crassna (LC384009.1) A sinensis (GQ891956.1) ngân hàng gen giới cho kết quả: Ba mẫu HBQN02, TDC02 DT03 có tương đồng 100% với lồi A yunnanensis (MH134148.1) hai mẫu DT05 DT07 khác với A yunnanensis (MH134148.1)4 vị trí bảng 3.2 Khi so sánh với hai loài A sinensis A crassna, tìm thấy điểm khác biệt vị trí: 160, 282, 301 322 Qua bảng 3.2 hình 3.9 thấy, sử dụng đoạn ITS2 khuếch đại cặp mồi ITS2PF ITS2PR sử dụng để phân biệt mẫu Aquilaria mức độ loại chí lồi 44 Bảng 3.2: Các vị trí sai khác dùng để phân loại vùng gen ITS2 Aquilaria Vị trí 74 160 282 301 322 363 HBQN02 C C T G C C TDC02 C C T G C C DT03 C C T G C C DT05 T C T G T T Loài/mẫ DT07 T T T G T T u NC A yunnanensis C C T G C C C G C A T C C G C A T C (MH134148.1) A sinensis (GQ891956.1) A crassna (LC384009.1) Như vậy, dựa vào bảng 3.2 ta thấy trình tự gen ITS2 ba mẫu HBQN02, TDC02 DT03 giống 100% so với trình tự đoạn gen lồi A yunnanensis ((MH134148.1) Trong khi, hai mẫu DT05 DT07 có khác biệt với ba loài so sánh HBQN02 HBQN02 DT03 DT05 DT07 MH134148.1 LC384009.1 GQ891956.1 TATG CGATACTTGG TGTGAATTGC AGAATCCCGT GAACCATCGA -TATG CGATACTTGG TGTGAATTGC AGAATCCCGT GAACCATCGA -ATG CGATACTTGG TGTGAATTGC AGAATCCCGT GAACCATCGA ATG CGATACTTGG TGTGAATTGC AGAATCCCGT GAACCATCGA -TATG CGATACTTGG TGTGAATTGC AGAATCCCGT GAACCATCGA TAGCGAAATG CGATACTTGG TGTGAATTGC AGAATCCCGT GAACCATCGA TAGCGAAATG CGATACTTGG TGTGAATTGC AGAATCCCGT GAACCATCGA TAGCGAAATG CGATACTTGG TGTGAATTGC AGAATCCCGT GAACCATCGA HBQN02 HBQN02 DT03 DT05 DT07 MH134148.1 LC384009.1 GQ891956.1 74 GTCTTTGAAC GCAAGTTGCG CCCCAAGCCT TTGGGCCGAG GGCACGTCTG GTCTTTGAAC GCAAGTTGCG CCCCAAGCCT TTGGGCCGAG GGCACGTCTG GTCTTTGAAC GCAAGTTGCG CCCCAAGCCT TTGGGCCGAG GGCACGTCTG GTCTTTGAAC GCAAGTTGCG CCCTAAGCCT TTGGGCCGAG GGCACGTCTG GTCTTTGAAC GCAAGTTGCG CCCTAAGCCT TTGGGCCGAG GGCACGTCTG GTCTTTGAAC GCAAGTTGCG CCCCAAGCCT TTGGGCCGAG GGCACGTCTG GTCTTTGAAC GCAAGTTGCG CCCCAAGCCT TTGGGCCGAG GGCACGTCTG GTCTTTGAAC GCAAGTTGCG CCCCAAGCCT TTGGGCCGAG GGCACGTCTG HBQN02 HBQN02 CCTGGGTGTC ACGCATTGTA GCCCCCCACC CTCGTGGTAA TGTCTGTGAG CCTGGGTGTC ACGCATTGTA GCCCCCCACC CTCGTGGTAA TGTCTGTGAG 45 DT03 DT05 DT07 MH134148.1 LC384009.1 GQ891956.1 CCTGGGTGTC ACGCATTGTA GCCCCCCACC CTCGTGGTAA TGTCTGTGAG CCTGGGTGTC ACGCATTGTA GCCCCCCACC CTCGTGGTAA TGTCTGTGAG CCTGGGTGTC ACGCATTGTA GCCCCCCACC CTCGTGGTAA TGTCTGTGAG CCTGGGTGTC ACGCATTGTA GCCCCCCACC CTCGTGGTAA TGTCTGTGAG CCTGGGTGTC ACGCATTGTA GCCCCCCACC CTCGTGGTAA TGTCTGTGAG CCTGGGTGTC ACGCATTGTA GCCCCCCACC CTCGTGGTAA TGTCTGTGAG HBQN02 HBQN02 DT03 DT05 DT07 MH134148.1 LC384009.1 GQ891956.1 160 GGCTGTGTGC GGCTGATACT GGCCTTCCCG TATGCACAGC AATGCGGTTG GGCTGTGTGC GGCTGATACT GGCCTTCCCG TATGCACAGC AATGCGGTTG GGCTGTGTGC GGCTGATACT GGCCTTCCCG TATGCACAGC AATGCGGTTG GGCTGTGTGC GGCTGATACT GGCCTTCCCG TATGCACAGC AATGCGGTTG GGCTGTGTGT GGCTGATACT GGCCTTCCCG TATGCACAGC AATGCGGTTG GGCTGTGTGC GGCTGATACT GGCCTTCCCG TATGCACAGC AATGCGGTTG GGCTGTGTGG GGCTGATACT GGCCTTCCCG TATGCACAGC AATGCGGTTG GGCTGTGTGG GGCTGATACT GGCCTTCCCG TATGCACAGC AATGCGGTTG HBQN02 HBQN02 DT03 DT05 DT07 MH134148.1 LC384009.1 GQ891956.1 GCCCAAATGG AGGAACCCAG GGCGGTGTAT GCCATGATGA GCGGTGGTGT GCCCAAATGG AGGAACCCAG GGCGGTGTAT GCCATGATGA GCGGTGGTGT GCCCAAATGG AGGAACCCAG GGCGGTGTAT GCCATGATGA GCGGTGGTGT GCCCAAATGG AGGAACCCAG GGCGGTGTAT GCCATGATGA GCGGTGGTGT GCCCAAATGG AGGAACCCAG GGCGGTGTAT GCCATGATGA GCGGTGGTGT GCCCAAATGG AGGAACCCAG GGCGGTGTAT GCCATGATGA GCGGTGGTGT GCCCAAATGG AGGAACCCAG GGCGGTGTAT GCCATGATGA GCGGTGGTGT GCCCAAATGG AGGAACCCAG GGCGGTGTAT GCCATGATGA GCGGTGGTGT HBQN02 HBQN02 DT03 DT05 DT07 MH134148.1 LC384009.1 GQ891956.1 282 GTGCTTAGCC TGCCGTCGTT AGAGCATCAT GTGCATCATG CCCTTGAGGT GTGCTTAGCC TGCCGTCGTT AGAGCATCAT GTGCATCATG CCCTTGAGGT GTGCTTAGCC TGCCGTCGTT AGAGCATCAT GTGCATCATG CCCTTGAGGT GTGCTTAGCC TGCCGTCGTT AGAGCATCAT GTGCATCATG CCCTTGAGGT GTGCTTAGCC TGCCGTCGTT AGAGCATCAT GTGCATCATG CCCTTGAGGT GTGCTTAGCC TGCCGTCGTT AGAGCATCAT GTGCATCATG CCCTTGAGGT GTGCTTAGCC TGCCGTCGTT AGAGCATCAT GCGCATCATG CCCTTGAGGT GTGCTTAGCC TGCCGTCGTT AGAGCATCAT GCGCATCATG CCCTTGAGGT HBQN02 HBQN02 DT03 DT05 DT07 MH134148.1 LC384009.1 GQ891956.1 301 322 GTGTTTCGTG GACAACCCCG ACGCAATCAT AGCGCGCATC GCGACCCCAG GTGTTTCGTG GACAACCCCG ACGCAATCAT AGCGCGCATC GCGACCCCAG GTGTTTCGTG GACAACCCCG ACGCAATCAT AGCGCGCATC GCGACCCCAG GTGTTTCGTG GACAACCCCG ATGCAATCAT AGCGCGCATC GCGACCCCAG GTGTTTCGTG GACAACCCCG ATGCAATCAT AGCGCGCATC GCGACCCCAG GTGTTTCGTG GACAACCCCG ACGCAATCAT AGCGCGCATC GCGACCCCAG ATGTTTCGTG GACAACCCCG GTGCAATCAT AGCGCGCATC GCGACCCCAG ATGTTTCGTG GACAACCCCG GTGCAATCAT AGCGCGCATC GCGACCCCAG HBQN02 HBQN02 DT03 DT05 DT07 MH134148.1 LC384009.1 GQ891956.1 363 GTCAGGCGGG AGCACCCGCT GAGTTTAAGC ATATCAAT -GTCAGGCGGG AGCACCCGCT GAGTTTAAGC ATATCAATAA GCGGAGG GTCAGGCGGG AGCACCCGCT GAGTTTAAGC ATATCAATA- -GTCAGGCGGG AGTACCCGCT GAGTTTAAGC ATATCAAT -GTCAGGCGGG AGTACCCGCT GAGTTTAAGC ATATCAATAA GCGGA GTCAGGCGGG AGCACCCGCT GAGTTTAAGC ATATCAATAA GCGGAGGAAA GTCAGGCGAG AGCACCCGCT GAGTTTAAGC ATA - -GTCAGGCGGG AGCACCCGCT GAGTTTAAGC ATATC - Hình 3.9 Kết so sánh trình tự đoạn gen ITS2 m u NC loài NCBI 46 Chƣơng IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã tách chiết 05 mẫu ADN tổng số mẫu Aquilaria - Đã nhân gen thành công đoạn gen matK, rbcL, ITS2, trnHpbsA kỹ thuật PCR từ ADN tổng số - Đã xác định trình tự nucleotide đoạn gen matK, rbcL, ITS2, trnH-pbsA - Đoạn gen ITS2 khuếch đại cặp mồi ITS2PF ITS2PR sử dụng làm ADN mã vạch việc giám định loài thuộc chi Aquilaria - Ba mẫu HBQN02, TDC02 DT02 có tương đồng 100% đoạn gen nhân so với lồi A yunnanensis, nên khẳng định ba mẫu thuộc loài A yunnanensis 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu đoạn gen khác mẫu Aquilaria để xác định cách xác vị trí phân loại mẫu nghiên cứu thuộc loài A yunnanensis hay loài Aquilaria khác 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Hồ Huỳnh Th y Dương (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục – Hà Nội, trang 191-198 Hoàng Cảnh (2006), Trầm hương loại tạo trầm hương, lợi ích, thách thức triển vọng Hội trầm hương Việt Nam Danh lục loài thực vật Việt Nam, tập II, Viện sinh thái tài nguyên sinh vật, Trung tâm nghiên cứu tài nguyên môi trường, NXB Nông nghiệp B i Công Khánh (2007), Bước đầu tìm hiểu chất tạo trầm nhân tạo dó bầu Aquilaria crassnatại Việt Nam, Nha Trang Đào Sỹ Sành, Nguyễn Huy Sơn, Cao Văn, “Báo cáo kết ánh giá sơ tiềm sản xuất bột giấy dó bầu”, Trung tâm nghiên cứu Lâm đặc sản, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Viện Công nghiệp giấy Cenlulose Lê Duy Thành, Tạ Toàn, Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2005), Di truyền học, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Thái Thành Lượm (2000), “Bảo vệ nguồn gen khai thác kết qủa tạo trầm nhân tạo trầm hương”, Tạp chí khoa học phổ thơng - Liên hiệp hội khoa học kỹ thuật TP HCM, số 518 Nguyễn Đức Lượng (2002) Công nghệ gen NXB Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh TIẾNG ANH Anton L (2007), Investigation of seed longevity and viability and cutting propagation for Aquilaria crassna, School of Marine and Tropical Biology James Cook University, Cairns 10.Alvarez I.W.J.F (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenic inference Molecular phylogentics and Evolution 29: 417-434 11.Barden A., Awang A.N., Mulliken T., Song M (2000), Heart of the matter: agarwood use and trade and CITES implementation for Aquilaria malaccensis 48 12.Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., and Vincent S (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and longterm goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp 18891895 13.He, RR; Yao, XS; Li, HY; Dai, Y; Duan, YH; Li, YF; Kurihara, H (2009) "The anti-stress effects of Sarcandra glabra extract on restraint-evoked immunocompromise" 14.Jaakola L.S.M., Haggman H (2010) Novel approaches based on ADN barcoding and high-resolution melting of amplicons for authenticity analyses 15.Mark Y.S.H (2008) Barcode of life Scien Ameri 82-88 16.Tautz, D Arctander, P Minelli, A Thomas, R.H Vogler (2003) A plea for ADN taxanomy Trends Ecol 18: 70-74 17.Wei Liu, Ying Zheng, Zhenzhen Zhang, Wenbing Yao and Xiangdong Gao, ‘’Hypoglycemic, hypolipidemic and antioxidant effects of Sarcandra glabra polysaccharide in type diabetic mice’’ 18.Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms, J Evol Biol, (6), pp 558-576 19.Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 20.CITES (2004), Thirteenth Meeting of the Conference of the Parties Amendments to Appendices I and II of CITES Bangkok, Thailand, 3-14 October 2004 unpublishe 21.Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 22.Kress W J., Erickson D L (2008), “DNA barcodes: Gens, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 49 23.Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 24.Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 25.Kiet L., Kessler PJA and Eurlings M (2005), A new species of Aquilaria (Thymelaceaceae) from Vietnam, Blumea, (50), pp 135-141 26.M Ishihara, T Tsuneya, & K Uneyama, (1993), Fragrant sesquiterpenes from agarwood, Phytochemistry 33: 1147-1155 27.Lichao Jiao, Yafang Yin, Yeming Cheng and Xiaomei Jiang (2013), ADN barcoding for identification of the endangered species Aquilaria sinensis: comparison of data from heated or aged wood samples Holzforschung; aop.DOI 10.1515/hf-2013- 0129 28.Shiou Y L., Jean W., Rozi M (2011), Genetic variation and molecular authentication of slected Aquilaria species from natural population in Malaysia using RAPD and SCAR markers, Asian journal of Plant Sciences, 10(3), pp 204 - 210 29.Nurita T M., Dewi R., Anidah (2009), Genetic variations among aquilaria species and gyrinops vetseegii using amplified fragment length polymorphism markers, Biotropia, Vol 16 (No.2), pp 88 - 95 30.Kiet L., Kessler PJA and Eurlings M (2005), A new species of Aquilaria (Thymelaceaceae) from Vietnam, Blumea, (50), pp 31.Storchova H., M S Olson (2007), The architecture of the chloroplast psbA-trnH non coding region in angiosperms, Plant systematic and evolution Biomedical and life sciences, Vol 268, No 1-4, pp 235-256 WEBSITE 50 32 https://caythuoc.org/tram-huong-cay-gio-bau-va-duoc-tinh-trong-y-hoc-cotruyen.html 33 https://tramhuongviet.com/cach-tao-tram-tren-cay-do-bai-phan-1 34 http://www.ioop.org.vn/vn/NCTK/Thanh-Tuu-Cua-Vien/Ban-Tin-KhoaHoc-Cong-Nghe/Cay-Do-Bau/ 35 http://www.barcodeoflife.org/ 36 http://www.barcoding.si.eu) 37 http://nonglamdong.com/dobau.htm 38 https://vi.wikipedia.org/wiki/dotram 51 ... nhỏ vào định danh bảo tồn loài thực vật giới Xuất phát từ nguyên nhân trên, thực nghiên cứu đề tài ? ?Nghiên cứu xác số trình tự ADN cho xác định lồi Dó Trầm Aquilaria yunnanensis Việt Nam" nhằm... sánh trình tự gen matK m u nghiên cứu với trình tự matK số trình tự gen đƣợc cơng bố NCBI Từ bảng 3.1 hình 3.6 ta thấy, mẫu nghiên cứu có trình tự gen matK giống tương đồng 100% so với trình tự. .. PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu Xác định đoạn DNA barcode cho lồi Dó Trầm Nhằm xây dựng sở liệu DNA mã vạch, phục vụ cho việc giám định loài quản lý nguồn tài nguyên sinh vật Phân lập xác