Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện thu nhận levan từ b subtilis

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN THU NHẬN LEVAN TỪ B SUBTILIS NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : TS Vũ Kim Dung Sinh viên thực : Trần Đình Đức Lớp : K61 – CNSH Khóa học : 2016 - 2020 Hà Nội, 2020 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Kim Dung – ngƣời trực tiếp bảo, hƣớng dẫn tận tình tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn q Thầy, Cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Đại học Lâm nghiệp tận tình truyền đạt kiến thức năm qua Với vốn kiến thức đƣợc tiếp thu q trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà cịn hành trang q báu để tơi bƣớc vào đời cách vững tự tin Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, khích lệ, tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành khóa luận Cuối tơi xin kích chúc q Thầy, Cô dồi sức khỏe thành công nghiệp cao quý Mặc dù có nhiều cố gắng để thực khóa luận cách hồn chỉnh Song thời gian có hạn, lực cịn hạn chế nên khó tránh khỏi thiếu sót Vì vậy, kính mong nhận đƣợc bảo ý kiến đóng góp Thầy Cơ, bạn bè bạn đọc đề tài khóa luận hồn thiện Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2020 Sinh viên thực Trần Đình Đức i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan 1.1.1 Giới thiệu levan 1.1.2 Tính chất 1.1.3 Nguồn thu nhận levan 1.1.4 Một số môi trƣờng nuôi cấy kích thích B subtilis sinh levan 1.1.5 Ứng dụng levan 1.2 Tổng quan B subtilis 11 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu 11 1.2.2 Đặc điểm phân loại phân bố 12 1.2.3 Đặc điểm hình thái 12 1.2.4 Bào tử khả tạo bào tử 14 1.2.5 Đặc điểm sinh hóa B subtilis 14 1.2.6 Đặc điểm nuôi cấy 15 1.2.7 Bộ gen 16 1.2.8 Ứng dụng B subtilis 16 PHẦN II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Vật liệu nghiên cứu 18 2.3.1 Vi sinh vật 18 ii 2.3.2 Môi trƣờng 18 2.3.3 Hóa chất 18 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố đến khả sinh tổng hợp levan 19 2.4.2 Phƣơng pháp tối ƣu hóa yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp levan theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken (Bruna cs, 2013) 22 2.4.3 Phƣơng pháp nghiên cứu điều kiện thu nhận levan 24 2.4.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 26 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp levan 27 3.1.1 Ảnh hƣởng nồng độ sucrose 27 3.1.2 Ảnh hƣởng pH 27 3.1.3 Ảnh hƣởng nguồn nito 28 3.1.4 Ảnh hƣởng nồng độ nito 30 3.1.5 Ảnh hƣởng tỷ lệ giống cấp 31 3.1.6 Ảnh hƣởng tốc độ lắc 31 3.2 Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp levan 33 3.3 Nghiên cứu điều kiện thu nhận levan 36 3.3.1 Ảnh hƣởng loại dung môi đến hàm lƣợng levan thu đƣợc 36 3.3.2 Ảnh hƣởng tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung mơi đến hàm lƣợng levan thu đƣợc 37 3.3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ kết tủa đến hàm lƣợng levan thu đƣợc 39 3.3.4 Ảnh hƣởng thời gian kết tủa đến hàm lƣợng levan thu đƣợc 40 PHẦN IV: KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 42 4.1 Kết luận 42 4.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC 48 iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT B subtilis Bacillus subtilis Ca Canxi CP Cruide Protein Cs Cộng Fat Fat FOS Fructo – oligosaccharides Fib Fiber GE Gross Energy GP Glucose trypton M Moisture MTCB Môi trƣờng P Photpho TGA Trypton Glucose Agar YE Yeast Extract ME Meat Extract BE Beaf Extract iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Độ kết đinh số Polymer tự nhiên Bảng 1.2 Sự khác bào tử tế bào sinh dƣỡng B subtilis 13 Bảng 2.1 Ảnh hƣởng nồng độ sucrose đến hàm lƣợng levan 19 Bảng 2.2 Ảnh hƣởng pH ban đầu đến khả sinh tổng hợp levan 19 Bảng 2.3 Ảnh hƣởng nguồn nito 20 Bảng 2.4 Ảnh hƣởng nồng độ nito đến khả sinh tổng hợp levan 21 Bảng 2.5 Ảnh hƣởng tỷ lệ giống cấp đến khả sinh tổng hợp levan 21 Bảng 2.5 Ảnh hƣởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp levan 22 Bảng 2.6 Bảng xác định biên ảnh hƣởng, mức khoảng thay đổi biến số 22 Bảng 2.7 Ma trận thực nghiệm Box - Behnken ba yếu tố hàm lƣợng levan 24 Bảng 2.7 Ảnh hƣởng loại dung môi đến hàm lƣợng levan thu đƣợc 25 Bảng 2.8 Ảnh hƣởng tỷ lệ thể tích dịch chiết levan với dung môi đến hàm lƣợng levan thu đƣợc 25 Bảng 2.9 Ảnh hƣởng tỷ lệ thể tích dịch chiết levan với dung môi đến hàm lƣợng levan thu đƣợc 25 Bảng 2.10 Ảnh hƣởng nhiệt độ kết tủa đến hàm lƣợng levan thu đƣợc 25 Bảng 2.11 Ảnh hƣởng thời gian kết tủa đến hàm lƣợng levan thu đƣợc 26 Bảng 3.1 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố hàm lƣợng levan thu đƣợc điều kiện nuôi cấy khác 34 Bảng 3.2 Kết phân tích phƣơng sai mơ hình tối ƣu phần mềm DX1135 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học levan Hình 1.2 Sản phẩm dƣỡng da mặt với Proteolea® Hình 1.3 Sản phẩm dƣỡng thể với Slimexir® Hình 1.4 Các sản phẩm levan thị trƣờng (www realbio.com) Hình 1.5 B subitilis nhuộm Gram (ảnh trái) 13 Hình 1.6 B subitilis giai đoạn bào tử 13 Bảng 1.3 Các phản ứng sinh hóa B subtilis (theo Holt, 1992) 15 Hình 1.7 B subtilis ni cấy mơi trƣờng thạch đĩa 16 Hình 2.1 Các biên ảnh hƣởng, mức khoảng thay đổi biến số 23 Hình 3.1 Ảnh hƣởng nồng độ sucrose đến khả sinh tổng hợp levan 27 Hình 3.2 Kết ảnh hƣởng pH ban đầu đến khả sinh tổng hợp levan 28 Hình 3.3 Kết ảnh hƣởng nguồn nito đến khả sinh tổng hợp levan 29 Hình 3.4 Ảnh hƣởng nguồn nito khác 29 Hình 3.5 Kết ảnh hƣởng nồng độ nito đến khả sinh tổng hợp levan 30 Hình 3.6 Kết ảnh hƣởng tỷ lệ giống cấp đến khả sinh tổng hợp levan 31 Hình 3.7 Kết ảnh hƣởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp levan 32 Hình 3.9 Hình ảnh 3D tƣơng tác yếu nhân tố 36 Hình 3.10 Kết ảnh hƣởng loại dung môi đến hàm lƣợng levan thu đƣợc 37 Hình 3.11 Kết ảnh hƣởng tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung môi đến hàm lƣợng levan thu đƣợc 38 Hình 3.12 Dịch kết tủa theo tỷ lệ thể tích levan với dung mơi Ethanol 96O 38 Hình 3.13 Kết ảnh hƣởng nhiệt độ kết tủa đến hàm lƣợng levan thu đƣợc 39 Hình 3.14 Dịch kết tủa thu đƣợc điều kiện khác 39 vi Hình 3.15 Kết ảnh hƣởng thời gian kết tủa đến hàm lƣợng levan thu đƣợc 40 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học, nguyên liệu sinh học an toàn dần đƣợc sử dụng để thay cho nguyên liệu hóa học Chúng đƣợc sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác sống Các nguyên liệu có khả đáp ứng nhu cầu thiết yếu đảm bảo an tồn mục đích sử dụng Vì thế, nhà khoa học tiến hành nghiên cứu thu nhận hợp chất có nhiều tính vƣợt trội từ vi sinh vật phục vụ cho đời sống ngƣời Trong năm gần đây, việc sử dụng loại polysaccharide từ vi khuẩn có phát triển mạnh, polymer sinh học có tính tƣơng thích sinh học cao, thân thiện với mơi trƣờng Do đó, polysaccharide đƣợc sản xuất từ vi khuẩn đƣợc xem nguồn lƣợng tiềm ngành công nghệ sinh học Levan hợp chất polymer sinh học đƣợc tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn mơi trƣờng có thành phần sucrose Đây polymer fructose đƣợc tạo liên kết β - (2→6) fructo - furanosidic, có mặt nhiều loại thực vật sản phẩm từ vi sinh vật Levan cung cấp nguyên liệu cho hàng loạt ngành công nghiệp nhiều lĩnh vực khác nhƣ: y dƣợc, thực phẩm mỹ phẩm Ứng dụng tiềm levan để làm chất nhũ hóa dùng sữa, chất ổn định, chất làm đặc đặc biệt có khả phục hồi sức khỏe có giá trị liệu pháp điều trị ung thƣ Levan đƣợc sản xuất thực vật, nấm men, nấm vi khuẩn (Jang cs, 2001) Levan tổng hợp từ nguồn vi sinh vật nhƣ: Zymomonas mobilis (Muro cs, 2000), Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Erwinia amylovora, Erwinia herbicola, Seraria sp (Oseguera cs, 1996), Rahnella aquatilis (Kim cs, 2000), Pseudomonas syringae (Hettwer cs, 1995) Acetobacter xylinum NCI 1005 (Tajima cs, 1998) Bacillus subtilis (Shin cs, 2005) Nhƣng nhìn chung, hiệu suất thu levan từ nguồn vi sinh vật chƣa cao Vì vậy, nhà khoa học khơng ngừng tìm kiếm nguồn thu nhận có khả thu đƣợc levan cao Xuất phát từ thực tế đó, tiến hành nghiên cứu, thực đề tài: “Nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện thu nhận levan từ B subtilis” PHẦN I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan 1.1.1 Giới thiệu levan Levan thuộc hai loại fructans (là cacbohydrate thƣờng tìm thấy thực vật, tảo, vi khuẩn) Fructans gồm có hai loại levan inulins đƣợc phân biệt loại liên kết Các đơn phân phân tử levan liên kết với liên kết β - (2 - 6) phân tử inulins liên kết β (2 - 1) (Han cs, 1990) Theo phân loại levan thuộc nhóm thứ hai fructans Levan polymer fructose đƣợc tạo liên kết β - (2 - 6) fructo – furanosidic (Ki- Hyo cs, 2001; Mardo cs, 2014) Các vi sinh vật có khả tổng hợp levan gồm: Lactobacillus gasseri, B circulans, E amylovora, Seraria sp., Acetobacter xylinum NCI 1005, Z mobilis B subtilis (Anwar cs, 2010; Devi Alamu, 2013; Oliveira cs, 2007) Levan polysaccharide ngoại bào đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn mơi trƣờng có thành phần sucrose Do vi khuẩn có khả sinh tổng hợp levansucrase để chuyển hóa sucrose thành levan (Mardo cs, 2014) Năm 2012, nghiên cứu đƣợc thực Esawy cs cho thấy vi khuẩn Bacillus spp đƣợc tách chiết từ mật ong có khả sinh tổng hợp levan Mặc dù cấu trúc levan đƣợc đặc trƣng mạch thẳng liên kết ß (2 6) nhƣng có nhiều levan đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn có cấu trúc phân nhánh với liên kết ß (2 - 1) Các mạch nhánh thƣờng ngắn đơi có mơt đơn phân fructose Fructans ngắn - ketose fructan ngắn loại levan Levan số polyme tự nhiên carbohydrate tồn dƣới dạng furanose Hình 1.1 Cấu trúc hóa học levan Hình 3.10 Kết ảnh hưởng loại dung môi đến hàm lượng levan thu Từ hình 3.10 cho thấy khả kết tủa levan ethanol 96O hiệu so với iso propanol aceton Mặt khác, kết tủa levan ethanol 96O có nhiều thuận lợi ethanol 96O hợp chất an toàn cho sản phẩm thu đƣợc (Kang cs, 2009) Hơn nữa, ethanol 96O có sẵn dạng tinh khiết với tạp chất gây nhiễm độc hay ức chế Nhiệt độ bay dung môi ethanol thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym phƣơng pháp sấy nhẹ quạt gió Nghiên cứu Jothi cs (2019) thử nghiệm ảnh hƣởng dung môi khác nhau: ethanol, isopropanol, acetone, methanol lên hàm lƣợng levan thu đƣợc, kết cho thấy dung môi kết tủa ethanol cho hàm lƣợng levan lớn Kết tƣơng đồng với kết thí nghiệm lựa chọn dung mơi ethanol 96O để kết tủa sinh tổng hợp levan Vì vậy, đề tài sử dụng dung môi ethanol 96O cho nghiên cứu 3.3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung mơi đến hàm lượng levan thu Sau lựa chọn đƣợc dung môi kết tủa ethanol 96O cho hàm lƣợng levan cao nhất, tiếp tục lựa chọn tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung mơi lần lƣợt 1:1, 1:2, 1:3 1:4 để xác định hàm lƣợng levan thu đƣợc theo tỷ lệ Kết hàm lƣợng levan thu đƣợc thể hình 3.11 37 Giá trị – khơng lọc đƣợc kết tủa Hình 3.11 Kết ảnh hưởng tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung môi đến hàm lượng levan thu Hình 3.12 Dịch kết tủa theo tỷ lệ thể tích levan với dung mơi Ethanol 96O Qua kết hình 3.11 hình 3.12 cho thấy, thể tích dịch chiết levan dung mơi tỷ lệ 1:1 1:2 khơng thể lọc đƣợc kết tủa Khi tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung môi 1:3 cho hàm lƣợng levan thu đƣợc cao (18,02 g/l) cao so với tỷ lệ 1:4 (16,63 g/l) Nghiên cứu Mrudula cs (2009) sản xuất amylase chiết xuất cám lên men từ chủng Bacillus cereus MK trình lên men trạng thái rắn, tỷ lệ dung môi ethanol tối ƣu tìm thấy 1:2,5 Trong nghiên cứu Hà Thị Thúy Vy cs (2016) nghiên cứu ảnh hƣởng dung môi thời gian kết tủa đến hiệu tinh sơ enzyme protease trích ly từ thịt đầu tôm, kết cho thấy tỷ lệ mẫu tôm: tỷ lệ ethanol 1: Những kết đạt đƣợc nghiên cứu phù hợp với công bố tác giả Jothi cs (2019) lựa chọn tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung 38 môi ethanol (tỷ lệ 1:3) sinh tổng hợp levan từ chủng B subtilis MTCC411và tƣơng đƣơng với nghiên cứu Santos cs (2013) Vì vậy, lựa chọn tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung mơi 1:3 cho nghiên cứu 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thu Ở mức nhiệt độ kết tủa khác có ảnh hƣởng trực tiếp đến hàm lƣợng levan thu đƣợc Do với điều kiện thu nhận levan đƣợc xác định cách sử dụng dung môi kết tủa ethanol 96O , tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung mơi 1:3, tiếp tục xác định nhiệt độ kết tủa hỗn hợp lỏng nhiệt độ: -5 OC, O C 32 OC Kết ảnh hƣởng nhiệt độ kết tủa đến hàm lƣợng levan đƣợc thể hình 3.13 Hình 3.13 Kết ảnh hưởng nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thu Hình 3.14 Dịch kết tủa thu điều kiện khác Khi nghiên cứu tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp levan từ chủng B subtilis Natto Santos cs (2013) cho thấy hàm lƣợng levan thu đƣợc cao lựa chọn kết tủa levan dung môi ethanol nhiệt độ -5O C 39 Kết hình 3.13 cho thấy, kết tủa nhiệt độ -5O C cho hàm lƣợng levan thu đƣợc cao (18,02 g/l) Nhiệt độ kết tủa 0OC bắt đầu cho hàm lƣợng levan giảm dần (16,63 g/l) nhiệt độ môi trƣờng (32OC) hàm lƣợng levan thu đƣợc thấp (12,48 g/l) Vì lựa chọn nhiệt độ kết tủa -5 OC cho nghiên cứu 3.3.4 Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu Nghiên cứu lựa chọn thời gian kết tủa giờ, với điều kiện xác định: sử dụng dung môi kết tủa ethanol 96O, tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung mơi 1:3 nhiệt độ kết tủa -5 OC Kết hàm lƣợng levan thu đƣợc thể hình 3.14 Hình 3.15 Kết ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu Nghiên cứu tác giả Nguyễn Thị Bảo Uyên cs (2018) tiến hành thay đổi thời gian kết tủa protein từ dịch trích ly rong mền Chaetomorpha sp hiệu suất kết tủa tăng dần theo thời gian Nhƣng tăng thời gian lên hiệu suất kết tủa bắt đầu giảm xuống Tƣơng tự quy luật thay đổi độ tinh tăng tăng thời gian Tuy nhiên, tăng thời gian đến mức tới hạn độ tinh giảm Điều thời gian kéo dài tạo điều kiện cho tập hợp phân tử vùng pH đẳng điện làm tăng lƣợng kết tủa Tuy vậy, kéo dài đến mốc thời gian xác định khơng làm tăng số lƣợng kết tủa, nên không làm tăng hiệu suất kết tủa Ngoài ra, số polysaccharide bị kết tủa pH thay đổi thời gian dài làm giảm độ tinh sản phẩm 40 Do nghiên cứu này, tăng thời gian kết tủa lên 5giờ không làm tăng hàm lƣợng levan thu đƣợc Vì vậy, lựa chọn thời gian kết tủa thời gian tối ƣu Qua kết từ hình 3.10, 3.11, 3.13 3.15 xác định đƣợc điều kiện thu nhận levan sử dụng dung môi ethanol 96O, tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung mơi 1:3, nhiệt độ kết tủa -5OC thời gian kết tủa cho hàm lƣợng levan thu đƣợc cao 41 PHẦN IV: KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Xác định đƣợc ảnh hƣởng số yếu tố môi trƣờng điều kiện nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp thu nhận levan từ B subtilis: nồng độ sucrose 80g/l, pH 7, nguồn nito YE, nồng độ nito 2g/l, tỷ lệ giống cấp 7,5%; tốc độ lắc 150 vòng/phút với hàm lƣợng levan thu đƣợc 18,71 g/l - Xác định đƣợc điều kiện tối ƣu hố cho q trình sinh tổng hợp levan chủng B subtilis: nồng độ sucrose 80g/l, pH 8, nguồn nito YE, nồng độ nito 2,3 g/l, tỷ lệ giống cấp 7,5%; tốc độ lắc 120 vòng/phút cho hàm lƣợng thu đƣợc: 21,05 g/l - Đã xác định đƣợc dung môi hữu kết tủa levan ethanol 96O với tỷ lệ thể tích dịch levan dung môi 1:3, nhiệt độ kết tủa -5 OC thời gian 4.2 Kiến nghị - Nghiên cứu nhiệt độ thấp -5 OC ảnh hƣởng tới khả thu nhận levan - Tinh chế phẩm levan thu đƣợc để ứng dụng rộng thực phẩm - Nghiên cứu tính chất xác định khối lƣợng phân tử levan thu đƣợc 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Đức Duy Anh (2005) Phân lập khảo sát số đặc điểm vi khuẩn Latobacillus acidophilus Bacillus subtilis Khóa luận tốt nghiệp, đại học nông - lâm TP HCM Nguyễn Duy Khánh (2006) Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh bào tử từ vi khuẩn Bacillus subtilis Khóa luận tốt nghiệp, đại học nơng - lâm TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thanh Thủy (2007) Ni cấy Bacillus subtilis thu nhận enzyme α - amylase ứng dụng cơng nghiệp sản xuất Detrin Khóa luận tốt nghiệp, đại học Nơng - lâm TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Thúy (2012) Biểu β - Galactosidase vi khuẩn Bacillus subtilis Luận văn thạc sỹ sinh học, ĐH Khoa học tự nhiên - ĐHQGHN Vũ Thị Thứ (1996), Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả ứng ụng số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis, luận văn phó tiến sĩ khoa học sinh học, Viện sinh học nhiệt đới Nguyễn Minh Trí (2011) Điều kiện thích hợp ni cấy chủng Bacillus subtilis CB15 sinh protease môi trƣờng dịch ép đầu tôm Tống Ngọc Triêm (2010) Tổng quan enzyme ngoại bào Bacillus subtilis Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội - ĐHQGHN Nguyễn Thị Bảo Uyên, Trần Thị Thu Hà, Nguyễn Thúy Hƣơng, Trần Thị Hồng Châu, Lê Thị Hồng Ánh, Trần Chí Hải (2018) Khảo sát q trình kết tủa protein từ dịch trích ly rong mền Chaetomorpha sp acid cồn Đặng Ngọc Phƣơng Uyên (2007) Phân lập vi khẩn Bacillus subtilis từ đất khảo sát tính đối kháng với vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy heo Tạp chí khoa học đại học Nông - lâm TP HCM 10 Hà Thị Thụy Vy, Trần Thanh Trúc Nguyễn Văn Mƣời, 2016 Ảnh hƣởng dung môi thời gian kết tủa đến hiệu tinh sơ enzyme protease trích ly từ thịt đầu tơm Tạp chí khoa học trƣờng đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp (Tập 1): 9-17 Tài liệu Tiếng Anh 11 Abdel - Fattah, D Mahmoud & M Esawy (2005) Production of levansucrase from Bacillus subtilis NRC 33 and enzymic synthesis of levan and fructo – oligosaccharides Curr Microbiol, 51: 402 - 407 12 Abdel-Fattaha, A G Eldeenb, W A Helmya & M A Esawy (2012) Antitumor and antioxidant activities of levan and its derivative from the isolate Bacillus subtilis NRC1aza Carbohydrate Polymers, 89: 314 – 322 13 Aridson, B T Rinehart, B T Rinehart & F Cadala - Maria (2006) Concentraion regimes of solutions of levan polysaccharide from Bacillus spp Carbohyd Polymes, 65 : 144 - 149 14 Beste ỗalimliolu (2014) Purification and Characterization of Levansucrase by Halomonas smyrnensis AAD6T 15 Bruna Caroline Marques Goncalves, Cristiani Baldo, Maria Antonia Pedrine Colabone Celligoi (2015) Levan And Levansucrase Mini Review 16 Calazans, C E Lopez, R M O C Lima & F P Franca (1997) Antitumour activities of levans produced by Zymomonas mobilis strains Biotechnology Letter, 19 : 19 - 21 17 Devi & A Alamu (2013) Production of Biopolymer Levan by Bacillus subtilis using Non-Ionic Surfactants Asian J Pharm Tech, : 37 - 41 18 Esawy, E F Ahmed, W A Helmy, N M Mansour, W M El-Senousy & M M El-Safty (2012) Antiviral Levans from Bacillus spp Isolated from Honey Intech DoI, 10 : 5772 – 5248 19 Euzenat, A Guilbert & D Combes (1996) Production of fructo oligosaccharides by levansucrease from Bacillus subtilis C4 Process Biochem, 32 : 237-243 20 Han, & A M Clarke (1990) Production and characterization of microbial levan Journal of Agricultural and Food Chemistry, 38 : 393–396 21 In Young Bae , Im-Kyung Oh, Suyong Lee, Sang-Ho Yoo, Hyeon Gyu Lee(2007) Rheolo gical Characterization of Levan Polysaccharides from Microbacterium Laevaniformans 22 Jaecho, P N Hee, Y S Jae & L T Ho (2001) Molecular and enzymatic characterization of levan fructotransferase from Microbacterium sp AL - 210 J Biotechnol, 91 : 49 - 61 23 Jang, K B Song, C H Kim, B H Chung, S A Kang, U H Chun, R W Choue & S K Rhee (2001) Comparison of characteristics of levan produced by diferent preparations of levansucrase from Zymomonas mobilis Biotechnology Letter, 23 : 339 – 344 24 Jothi Sailaja C.A Chidambaram Bhuvaneshwari Veerapandian, Kartik Kumar Sarwareddy, Krishna Priya Mani, Saravanan Ramiah Shanmugam, Ponnusami Venkatachalam (2019) Studies on solvent precipitation of levan synthesized using Bacillus subtilis MTCC 441 25 Justin Barone, Maria Medynets (2007) Thermally processed levan polymer 26 Kang & I W Cottrell (1979) Polysaccharides In H J Peppler and D Perlman (ed), Microbial technology, 2nd ed Academic Press, Inc, New York, 418 - 481 27 Kang, (2009): "Levan: Applications and Perspectives" Microbial Production of Biopolymers and Polymer Precursors Caister Academic Press ISBN 978-1904455-36-3 28 Khadiga Abou-taleb, Mohamed Abdel-Monem, Mohamed H Yassin and Amal A Draz( 2015) Production, Purification and Characterization of Levan Polymer from Bacillus lentus V8 Strain 29 Kim, J W Seo, K B Song, K H Jang, B H Jung, S K Rhee (2000) Molecular cloning of a gene encoding the thermoactive levansucrase from Rahnella aquatilis and its growth phasedependent expression in Escherichia coli J Biotechnol, 81: 63 - 72 30 Kunst, N Ogasawara, I Moszer, A M Albertini, G Alloni, V Azevedo, M G Bertero, P Bessières, A Bolotin, S Borchert, R Borriss, L Boursier… (1997) The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis Nature, 390 : 249 - 256 31 Li, H Kim (2013) Effects of Levan-Type Fructan Supplementation on Growth Performance, Digestibility, Blood Profile, Fecal Microbiota, and Immune Responses After Lipopolysaccharide Challenge in Growing Pigs (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24045486/) 32 Mrudula, Kokila (2009) Production of Thermostable a-amylase by Bacillus cereus MK in solid state fermentation: Partial purification and characterization of the enzyme 33 Olano, G R E Gibson & R A Rastall (2002) Comp - arison of the in vitro bitidogenic properties of pectin and pectin - oligosaccharides Journal of Applied Microbiology, 93 : 505 – 5111 34 Oliveira, R S Silva, J B Buzato & M A P C Celligol (2007) Study of levan production by Zymomonas mobilis using regional low - cost carbohydrate sources Biochem Eng J, 37 : 177 - 183 35 Oner, LazaroHernandez, JoanCombie (2016) Review of Levan polysaccharide: From a century of past experiences to future prospects, 34 : 827 – 844 36 Oseguera, L Guereca L & A Lopez - Munguia (1996) Properties of levansucrase from Bacillus circulans Appl Microbiol Biotechnol, 45 : 465 – 471 37 Patricia Bittencourt da Silva, Dionisio Borsato and Maria Antonia Pedrine Colabone Celligoi, (2014) Optimization of High Production of Fructooligosaccharides by Sucrose Fermentation of Bacillus subtilis Natto CCT 7712 American Journal of Food Technology, 9: 144-150 38 Santos, F Melo, W J M Paiva, D Borsato, M Dasilva & M Celligoi (2013) Characterization and optimization of levan production by Bacillus subtilis (Natto) Romanian Biotechnological Letters, 18 : 8413 - 8422 39 Selim, Seval, Sirma, Taner, (2013) Levan production by Zymomonas mobilis inbatchand continous fermantation system 40 Shin, Y T Yu, C J Shienh & C Y Hsien (2005) Selective Production and Characterization of Levan by Bacillus subtilis (natto) Takahashi J Agric Food Chem, 53 (21) : 8211 - 8215 41 Szwengiel, M Czarnecka, H Roszyk & Z Czarnecki (2004) Levan production by Bacillus subtilis DSM 347 strain Food Sicence and Technology, : - 12 42 Tajima, N Uenishi, M Fujiwara, T Erata & M Munekata (1998) The production of a new water - soluble polysaccharide by Acetobacterxylinum NCL 1005 and its structural analysis by NMR spectroscopy Carbohydr Res, 305 : 117 - 122 43 Xin Jian Lei , Yong Min Kim , Jae Hong Park, Dong Heon Baek , Charles Martin Nyachoti , In Ho Kim (2017) Effects of Levan-Type Fructan on Growth Performance, Nutrient Digestibility, Diarrhoea Scores, Faecal Shedding of Total Lactic Acid Bacteria and Coliform Bacteria, and Faecal Gas Emission in Weaning Pig 44 Yamamoto, Y Takahashi, M Kawano, M Iizuka, S Saeki & H Yamaguchi (1999) In vitro digestibility and fermentability of levan and its hypocholesterolemic effects in rat J Nutr Blochem, 10 : 13 - 18 45 Yanjun Tian, Yixiao Fan, Jianjun Liu, Xiangying Zha0 (2015) Effect of nitrogen, carbon sources and agitation speed on acetoin production of Bacillus subtilis SF4-3 46 Yitbarek A, Echeverry H, Brady J, et al Innate immune response to yeast derived carbohydrates in broiler chickens fed or-ganic diets and challenged with Clostridium perfringens Poult Sci 2012;91:1105–12 PHỤ LỤC Đặc điểm hình dạng tế bào B subtilis sau 24 hoạt hóa mơi trƣờng lỏng đƣợc sử dụng làm tiêu nhuộm Gram quan sát dƣới kính hiển vi Kết quan sát dƣới kính hiển vi cho thấy chủng có dạng hình que ngắn, nhỏ, đứng riêng rẽ thành chuỗi ngắn, bắt màu tím nên vi khuẩn Gram dƣơng Kết đƣợc ghi lại hình Hình Hình dạng tế bào chủng B subtilis Xác định mật độ tế bào phƣơng pháp đếm khuẩn lạc B subtilis sau 24 hoạt hóa môi trƣờng L1 nhân giống môi trƣờng L2 đƣợc pha loãng từ nồng độ 10-1 đến 10-12 Cấy trải dịch pha loãng lên đĩa pettri chứa môi trƣờng TGA Nuôi tủ ấm nhiệt độ 37 OC 24 Khi khuẩn lạc phát triển tới mức phân biệt mắt thƣờng quan sát thấy nồng độ pha loãng 10- cho khuẩn lạc có số lƣợng thích hợp, hình thái rõ nét Tính kết quả: Từ số khuẩn lạc ta suy số lƣợng tế bào ( CFU) có 1ml dung dịch gốc: = 85 x x = 17x1011 Trong đó: a = 85: số lƣợng khuẩn lạc trung bình đĩa nồng độ pha lỗng độ pha loãng dịch đƣợc cấy trải đĩa K= : V = 50 thể tích dịch pha loãng đƣợc cấy trải đĩa Xây dựng đƣờng chuẩn fructose xác định hàm lƣợng levan 3.1 Phương pháp xây dựng đường chuẩn fructose xác định hàm lượng levan  Xác định hàm lƣợng đƣờng khử Hóa chất: thuốc thử DNS, dung dịch Fructose chuẩn (10mg/ml) Tiến hành: Dựng đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng đƣờng Bố trí thị nghiệm nhƣ bảng Bảng : Xây dựng thí nghiệm xác định đƣờng chuẩn Hóa chất Ống nghiệm 10 Thể tích Fructose(ml) từ ống gốc 10mg/ml) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Thể tích nƣớc cất(ml) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Nồng độ fructose (mg/ml) 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 Thể tích DNS 1 1 1 1 1 OD540(nm) Từ ống nghiệm lấy 1ml ống nghiệm cho vào 10 ống nghiệm khác thêm vào ống 3ml thuốc thử DNS Đun sôi phút ( có nắp đậy ) Làm tới nhiệt độ phòng Đo OD540 nm với mẫu nƣớc cất pha từ ống ĐC Vẽ đƣờng chuẩn Fructose dạng y = ax + b Trong y: Giá trị OD540nm x: Nồng độ Fructose (mg/ml) a: Hệ số gốc b: Hệ số tự  Xác định hàm lượng levan Sau thu đƣợc kết tủa, tiến hành lọc Lấy 1ml dịch vừa thu đƣợc thủy phân 5ml HCl 100OC giờ, làm nguội Dịch thủy phân đƣợc trung hòa 7ml NaOH 2M Tỷ lệ hàm lƣợng fructose đƣợc xác định phản ứng tạo màu với DNS ( 400µl dịch + 1600 µl DNS ), thủy phân 10 phút sau làm lạnh nhanh đo bƣớc sóng 540nm (Berte cs , 2013) Do levan polymer fructose nên hàm lƣợng levan đƣợc tính theo cơng thức: L = F × 0,9 (Szwengiel cs, 2004) Trong đó: L: hàm lƣợng levan (g/l) F: hàm lƣợng fructose (g/l) 0,9 hệ số chuyển đổi từ monomer sang polymer 3.2 Kết xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng levan Bảng Đƣờng chuẩn fructose Hóa chất Ống nghiệm 10 Thể tích fructose(m l) từ ống gốc 10mg/ml) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Thể tích nƣớc cất(ml) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Nồng độ fructose (mg/ml) 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 Thể tích DNS 1 1 1 1 1 0,09 0,27 0,39 0,49 0,66 0,83 0,93 1,05 1,16 1,27 OD540(nm) Hình Đồ thị đƣờng chuẩn fructose Dựa sở phản ứng tạo màu đƣờng khử fructose với thuốc thử DNS( 3,5 –Dinitrolicylic acid) Cƣờng độ màu hỗn hợp tỉ lệ thuận với nồng độ đƣờng khử phạm vi định Ta có phƣơng tình đƣờng tuyến tính nồng độ đƣờng khử fructose(g/l) với mật độ quang ) OD540 nm y = 0,1301x – 0,0005 Từ phƣơng trình đồ thị đƣờng chuẩn ta tính đƣợc nồng độ đƣờng khử fructose dung dịch Hàm lƣợng đƣờng khử fructose: y = 0,1301x – 0,0005 => x = =F Do Levan polymer fructose nên hàm lƣợng levan đƣợc tính theo cơng thức: L = F x 0.9 Trong đó: L: Hàm lƣợng levan (g/l) F: Hàm lƣợng fructose (g/l) 0.9: Hệ số chuyển đổi từ monomer sang polymer => Hàm lƣợng Levan : L = F x 0,9 = x 0,9 ... từ thực tế đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu, thực đề tài: ? ?Nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện thu nhận levan từ B subtilis? ?? PHẦN I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan 1.1.1 Giới thiệu levan. .. PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy tối ƣu chủng B subtilis sinh tổng hợp levan với hàm lƣợng cao Nghiên cứu đƣợc điều kiện thu nhận levan 2.2 Nội dung nghiên. .. trƣờng điều kiện nuôi cấy cho chủng B subtilis sinh tổng hợp levan cao - Nghiên cứu điều kiện thu nhận levan 2.3 Vật liệu nghiên cứu 2.3.1 Vi sinh vật Chủng B subtilis môn Công nghệ Vi sinh - Hóa