Nghiên cứu đa dạng di truyền một số xuất xứ giổi xanh michelia meidiocris dandy dựa vào chỉ thị ADN

Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Huế TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP KHOA LÂM HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ XUẤT XỨ GIỔI XANH (MICHELIA MEDIOCRIS DANDY) BẰNG CHỈ THỊ ADN NGHÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 307 Giáo viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Đức Thành Sinh viên thực : Nguyễn Thị Huế Khóa học : 2005- 2009 Hà Nội, 2009 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Huế LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đồ án khơng có cố gắng, nổ lực thân mà cịn cần động viên, cổ vũ gia đình, bạn bè, đặc biệt giúp đỡ nhiệt tình thầy cô anh chị hướng dẫn T ôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Đức Thành, trưởng phòng Di truyền tế bào thực vật- Viện Công nghệ Sinh học- Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn tận tình, chu đáo tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp T xin gởi lời cảm ơn đến thầy cô giáo trường Đại học Lâm nghiệp giảng dạy cho tảng kiến thức vững để tiếp thu tốt kiến thức khoa học tạo cho hội học hỏi quý giá T ôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ, hướng dẫn nhiệt tình ThS Nguyễn Thị Bích Thủy tập thể cán phòng Di truyền tế bào thực vật thời gian thực tập Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè giúp đỡ, động viên suốt thời gian học tập nghiên cứu H Nội, ngày 12 tháng năm 2009 S inh viên Nguyễn Thị Huế MỞ ĐẦU Giổi xanh (Michelia mediocris Dandy) loài thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae), loài địa có ý nghĩa lớn sinh thái học có giá trị kinh tế Gỗ Giổi xanh khơng bị mối mọt phá hoại, bị cong vênh, thớ mịn đẹp, dễ gia công chế biến nên dùng để đóng đồ gia dụng, nhà cửa… Những năm gần gỗ Giổi xanh thị trường giới ưa chuộng, giá thành xấp xỉ gỗ hồng sắc nhóm Song, chiến tranh phá hoại, khai thác khơng hợp lí chưa có kế hoạch trồng nên diện tích rừng có lồi bị giảm đáng kể diện tích trữ lượng Cho đến nay, Giổi xanh mọc rải rác rừng tự nhiên với số lượng không nhiều bị săn tìm để lấy gỗ, điều làm cho số lượng loài ngày giảm Giổi xanh số giống lâm nghiệp (theo định số 24/2007/QĐ - BNN, ngày 09 tháng năm 2007 Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn việc ban hành danh mục giống lâm nghiệp chính), vấn đề khơi phục, cải tạo phát triển rừng có lồi này, bước hình thành khu sản xuất nông - lâm nghiệp ổn định, bền vững yêu cầu cấp thiết, phục vụ nhu cầu phát triển kinh tế - xã hội vùng, khu vực nước Mặt khác, Giổi xanh cịn tập đồn địa có khả tham gia vào cấu trồng cho việc trồng rừng, ni dưỡng làm giàu rừng Tuy nhiên, công tác lai tạo, lưu trữ, bảo tồn, nghiên cứu phát triển nguồn gen lồi cịn quan tâm nên nguồn gen Giổi xanh có nguồn gốc địa phương ngày bị lẫn tạp thối hóa Việc khai thác hiệu nguồn gen quý từ Giổi xanh để phục vụ công tác chọn, tạo giống; công tác khôi phục, cải tạo, phát triển rừng loài tương lai đưa phương hướng tối ưu công tác bảo tồn việc làm cần thiết Muốn vậy, trước hết ta phải đánh giá mức độ đa dạng di truyền loài Giổi xanh có Cơng nghệ sinh học phát triển với đời kỹ thuật thị phân tử đem đến tiến tất lĩnh vực sinh học đại; thị phân tử đóng vai trị ngày quan trọng nghiên cứu đa dạng di truyền, phát sinh chủng loại, tiến hoá loài giống Hàng loạt thị phân tử như: RAPD, AFLP, RFLP, SSR, thị lục lạp… đời ứng dụng rộng rãi nghiên cứu đa dạng di truyền, đem lại lợi ích đáng kể giúp rút ngắn thời gian công sức nghiên cứu nhà khoa học Trên sở đó, tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu đa dạng di truyền số xuất xứ Giổi xanh (Michelia mediocris Dandy) dựa vào thị ADN" với mục đích nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền số xuất xứ Giổi xanh vùng Kon Hà Nừng thuộc tỉnh Gia Lai, để góp phần vào công tác khuyến cáo để bảo vệ nguồn gen Giổi xanh nước ta Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ 1.1 Đại cƣơng loài Giổi xanh (Michelia mediocris Dandy) 1.1.1 Đặc điểm sinh vật học sinh thái học loài Giổi xanh Giổi xanh (Michelia mediocris D.) thuộc chi Ngọc lan (Michelia), họ Ngọc lan (Magnoliaceae), thực vật ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Giổi xanh loài gỗ lớn, cao tới 25 m – 30 m, đường kính tới 100 cm; thân thẳng, vỏ màu xám tro, vết võ đẽo màu xám vàng có mùi hắc Cành non phủ nhiều lơng, rải rác đốm trịn sẫm Lá đơn mọc cách, trải cành; kèm mang nhiều lông nâu vàng phía ngồi Lá hình trái xoan trứng ngược trái xoan đầu có mũi nhọn, hình nêm Hoa mọc lẻ đầu cành đối diện với đầu cành Nụ hình trứng dài, phủ nhiều lông nâu vàng Quả đại kép, vỏ đại nhiều nốt sần Mùa hoa tháng - 4, chín tháng - 10 Giổi xanh loài sinh trưởng nhanh, ưa sáng, thích hợp nhiều loại đất có nguồn gốc đá mẹ khác nhau, đất Feralít đỏ vàng, nâu đỏ, xám vàng vùng Tây Nguyên điều kiện tốt cho sinh trưởng phát triển Giổi xanh thường mọc rải rác hỗn giao với loại rộng thường xanh khác, thường gặp rừng rậm thường xanh mưa mùa nhiệt đới nhiệt đới, đơi lồi ưu rừng hỗn loài [5] 1.1.2 Phân bố địa lý Giổi xanh phân bố rộng từ Bắc vào Trung độ cao 70 1.700 m, lượng mưa hàng năm từ 1.700 - 3.000 mm Hiện Giổi xanh trồng chủ yếu Bình Định (ở Vĩnh Sơn (Vĩnh Thạnh), An Toàn (An Lão), rải rác Canh Liên (Vân Canh)) Gia Lai, Đắc Lắc thuộc khu vực Tây Nguyên 1.1.3 Giá trị kinh tế Giổi xanh Cây cho gỗ to; gỗ có giác màu vàng nhạt, lõi sẫm Gỗ có mùi thơm dễ chịu, mềm, thớ mịn đẹp dễ làm, dễ gia cơng chế biến, biến dạng, cong vênh, khơng bị mối mọt phá hoại nên thường dùng làm nhà cửa nông thôn, đồng thời sản xuất tủ, giường, bàn ghế, chế tác mặt hàng thủ công mỹ nghệ phục vụ đời sống xã hội Những năm gần gỗ giổi thị trường giới ưa chuộng, giá thành xấp xỉ gỗ hồng sắc nhóm Hạt có vị cay, mùi thơm dùng làm gia vị [5] Vỏ hạt dùng làm thuốc chữa sốt, đau bụng; số phận khác cất tinh dầu dùng công nghiệp y dược 1.2 Đa dạng di truyền 1.2.1 Khái niệm chung đa dạng di truyền Đa dạng di truyền thể đa dạng gen cá thể quần thể vốn gen quần thể lồi Sự đa dạng gen có cá thể có gen khác Đa dạng di truyền đa dạng cấu trúc phân tử ADN tồn cá thể loài, loài chi chi họ… ADN cá thể khác xác định khác số lượng, thành phần, trình tự nucleotide; khác trình tự nucleotide mang tính đặc trưng 1.2.2 Nguyên nhân phát sinh tính đa dạng di truyền Sự tồn lồi có nhờ sản xuất chép lại tính trạng tính chất thể qua hệ nhờ di truyền Vật chất di truyền sinh vật axit nucleic (gồm có axit deoxyribonucleic - ADN axit ribonucleic - ARN) Thông tin di truyền lưu giữ bảo quản ADN Thậm chí cá thể lồi mang phân tử ADN đặc trưng cho loài thể qua số lượng, thành phần trình tự xếp nucleotide ADN Trật tự cặp nucleotide gen có liên quan đến việc quy định tính trạng đặc tính thể Thơng thường vật chất di truyền trì bền vững qua hệ nhờ khả tự chép xác ADN, nhiên tác động tác nhân vật lý, hố học mơi trường tự nhiên yếu tố nội bào làm cho chế chép ADN có sai sót, vật chất di truyền bị biến đổi tạo đột biến Các đột biến truyền lại cho hệ sau, chúng tồn mẫu, quần thể, gia đình cá thể lồi Những biến đổi có lợi có hại thường biến đổi có lợi xảy nhiều trình chọn lọc tự nhiên đấu tranh sinh tồn Sự khác biệt gen di truyền tăng dần thu nhận đầy đủ tổ hợp gen nhiễm sắc thể bố mẹ thông qua tái tổ hợp gen trình sinh sản Các gen trao đổi nhiễm sắc thể tổ hợp thiết lập nhiễm sắc thể hai bố mẹ kết hợp thành tổ hợp thống cho [12, 13] 1.2.3 Ý nghĩa đa dạng di truyền Đa dạng di truyền phương thức tồn loài qua hàng ngàn năm tiến hóa Đa dạng di truyền cần thiết quan trọng sinh vật để trì khả sinh sản hữu thụ, tính bền vững trước yếu tố đe doạ Nó có vai trị quan trọng đến khả đề kháng với loại dịch bệnh khả thích nghi cá thể loài với thay đổi môi trường Sự đa dạng di truyền trồng vật ni có giá trị đặc biệt có ý nghĩa lớn chương trình lai tạo giống phục vụ sản xuất nông lâm nghiệp [12, 13] Sự khác biệt gen quần thể xác định số gen vốn gen số alen gen Sự khác biệt gen cho phép lồi thích ứng với thay đổi mơi trường Nói chung, loài quý thường đơn điệu gen so với lồi phổ biến, lồi có phân bố rộng hậu loài quý thường nhạy cảm với biến đổi môi trường dễ bị tuyệt chủng [12, 13] 1.3 Đại cƣơng ADN lục lạp (chloroplast ADN- cpADN) Năm 1971, Manning cộng ông lần công bố cpADN hình trịn Euglena gracilis có kích thước 126 kb Từ cpADN nhiều lồi sinh vật khác quan sát mơ tả cpADN có cấu trúc dạng vòng Ở thực vật bậc cao cpADN có chiều dài khoảng 120 - 217 kb tuỳ lồi, hầu hết nằm khoảng 120 - 160 kb; Tảo phạm vi biến động rộng hơn: 85 - 292 kb Điển hình Tảo lam Siphonous có cpADN nhỏ (85 kb) hệ gen lục lạp Tảo khổng lồ Acetobularia có độ lớn 2000 kb [8] Ở thực vật cpADN khác kích thước, cấu trúc vật liệu gen [39] Một nét đặc trưng bật cpADN tìm thấy hầu hết thực vật có mặt trình tự lặp lại đảo ngược (Inverted repeat - IR) xếp theo thứ tự từ kb đến 76 kb dọc theo chiều dài gen Hệ gen lục lạp điển hình thực vật hạt kín dài khoảng 135 - 160 kb, có 20 - 25 kb trình tự IR Các IR chia phần lại cpADN thành vùng đơn độc lớn vùng đơn độc nhỏ [39] Những thay đổi trật tự vật liệu gen hệ gen lục lạp đặc trưng phát sinh hay có thêm hay số lặp lại đảo ngược Phần lớn khác kích thước số cpADN thực vật cạn giải thích thay đổi chiều dài IR Chẳng hạn lồi Pelagornium (Geraniaceae) có cpADN dài 217 kb, kích thước cpADN tăng lên chứng minh mở rộng IR không liên quan đến tăng phức hệ hệ gen [39] Ngược lại, cpADN đậu Hà Lan, vài lồi Thơng, người ta thấy chúng khơng có IR [39, 40, 41] Điều gợi cho thấy đoạn IR có mặt tổ tiên thực vật cạn trình tiến hố đoạn IR số lồi bị [41] Cho đến nay, kích thước cpADN xác định hoàn chỉnh 79 loài chẳng hạn: Chlamydomonas reinhardtii 196000 bp [28], Marchantia polymorpha 121.024 bp [8], Oryza sativa 135.000 bp, Thuốc (Nicotiana tabacum) 155.884 bp [8], N sylvestris 155.941 bp N tomentosifomis 155.745 bp [51], Citrus sinensis 160.129 bp [25], Đậu xanh 150.000 bp, đậu Hà Lan 120.000 bp, Arabidopsis thaliana 154.478 bp [44] v.v Với số loài đọc trình tự cpADN ngày tăng tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu tiến hoá nguồn gốc lục lạp, đồng thời ứng dụng phân tích cpADN nghiên cứu đa dạng di truyền, phát sinh lồi… Hệ gen lục lạp chứa trung bình khoảng 120 kb chuỗi đơn đủ ghi mã cho 120 gen Các gen cpADN xếp vào hai nhóm chính: nhóm gen mã hố thành phần máy sinh tổng hợp protein lục lạp (vào khoảng 100 gen): tiểu phần ARN polymerase, ARN vận chuyển (tARN), ARN riboxom [8]; nhóm gen quy định nhiều thành phần máy quang hợp: hệ quang hợp I II, chuỗi vận chuyển điện tử cpADN kiểm tra số q trình tạo màng lục lạp Ngồi lục lạp cịn có số gen chống chịu [8] Những cpADN biết có chứa tất gen rARN lục lạp (3 - gen), có 30 - 31 gen tARN khoảng 100 gen mã hoá cho protein Chẳng hạn Nicotinana tabacum có cpADN dài 155.884 bp chứa tồn 113 gen khác có gen mã hoá rARN, 30 gen mã hoá tARN 79 gen mã hoá protein [51]; Arabidopsis thaliana với cpADN dài 154.478 bp có chứa gen mã hố rARN, 37 gen mã hoá cho tARN 87 gen mã hoá cho protein [44]… Những tiến việc phân tích cpADN vượt xa việc phân tích protein lục lạp ADN lục lạp có đặc điểm quan trọng tính bảo thủ cao tần số đột biến thấp so với ADN nhân Chỉ thị lục lạp thường sử dụng chuỗi không mã gen 16S, rbcL, atpB, matK…[18, 20, 22] Gần đây, ứng dụng kỹ thuật nhân dòng gen đọc trình tự cho biết cấu trúc bước đầu gen lục lạp dự đốn có mặt gen lục lạp 1.4 Chỉ thị ADN ứng dụng thị ADN nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật 1.4.1 Chỉ thị ADN Chỉ thị ADN (chỉ thị phân tử) gen đoạn trình tự nucleotide đặc hiệu hệ gen sinh vật (bao gồm ADN nhân, ADN tế bào chất) Có thể hiểu đơn giản chúng “cột mốc” hệ gen Sự hiển diện cột mốc khoảng cách tương đối “cột mốc” phản ánh mức độ biến dị cá thể, giống loài quần thể Sinh vật có khả nhân ADN chúng với độ xác cao có nhiều chế xảy làm thay đổi cấu trúc ADN, đơn giản thay đổi cặp base phức tạp đảo đoạn, chuyển đoạn đoạn Nhờ vậy, có biến động lớn ADN quần thể tự nhiên sinh vật Chỉ thị phân tử xem công cụ hiệu để đánh giá đa dạng sinh học phục vụ công tác chọn tạo giống trồng [11] Nhờ thị phân tử cho phép xác định đặc điểm trực tiếp kiểu gen thông qua việc xác định trình tự định gen trình tự liên kết chặt với gen mang tính trạng mong muốn Bằng việc sử dụng tiêu phân tích trực tiếp kiểu gen trên, người thẳng vào trnS - trnM rbcL - atpB Tổng HinfI 26 11 42,30 TaqI 30 0 HinfI 15 0 TaqI 30 0 176 11 6,25 Từ bảng 3.1, sau cắt enzyme, xét độ dài sản phẩm cắt mẫu Giổi xanh cặp mồi lục lạp tỷ lệ đa hình thấp (6,25 %) với 176 phân đoạn thu có 11 phân đoạn đa hình Đa hình thu sản phẩm PCR với mồi trnS - trnM sau cắt enzyme HinfI có tổng số 26 băng có 11 phân đoạn đa hình (chiếm 42,30 %) ; khơng xuất đa hình cặp mồi: trnS - trnM với enzyme TaqI; cặp mồi 16SF - 16SR, rbcL atpB với enzyme HinfI TaqI Sản phẩm PCR với mồi 16SF - 16SR sau cắt với enzyme HinfI có điểm cắt, thu phân đoạn có kích thước khoảng: 200 bp, 300 bp, 600 bp (HinfI); cắt với enzyme TaqI có điểm cắt, thu phân đoạn kích thước khoảng 100bp, 700 bp Với mồi rbcL - atpB, sản phẩm cắt với enzyme TaqI có điểm cắt thu phân đoạn có kích thước: 250 bp, 400 bp với tất mẫu Riêng G4 G9 ta thấy có phân đoạn phân đoạn thứ có kích thước với mẫu đối chứng chưa cắt với enzyme Như G4 G9 enzyme chưa cắt hết sản phẩm, nên phân đoạn G4 G9 khơng phải đa hình Trong đó, sản phẩm cắt với enzyme HinfI thu số phân đoạn nhỏ có kích thước từ 100 - 200 bp Sản phẩm PCR với mồi trnS - trnM cắt enzyme HinfI có điểm cắt, thu phân đoạn kích thước khoảng 500 bp, 700 bp với 11 mẫu Giổi xanh; mẫu lại là: G1, G6, G9, G15 thu phân đoạn với kích thước là: 500 bp Điều trình tự nucleotide sản phẩm PCR mẫu G1, G6, G9, G15 với mồi trnS - trnM có sai khác 35 với trình tự nucleotide sản phẩm PCR 11 mẫu, thay có phân đoạn 11 mẫu ta thấy phân đoạn điện di chụp ảnh Trong đó, cắt enzyme TaqI thu phân đoạn: 300 bp, 700 bp tất mẫu Từ số liệu cho thấy tổng kích thước số phân đoạn thu sau cắt enzyme giới hạn nhỏ kích thước phân đoạn sản phẩm PCR với cặp mồi lục lạp ban đầu Điều thực tế có số điểm cắt khác tạo phân đoạn có kích thước q nhỏ nên gel agarose Mức độ đa hình thấp phân đoạn ADN thu trình tự nucleotide phân đoạn AND vị trí cắt enzyme giới hạn có sai khác Như vậy, với số lượng vị trí cắt có đa hình chứng tỏ trình tự đoạn lục lạp nhân tương đối bảo thủ đặc thù cho lồi Qua phân tích với thị lục lạp thấy xuất xứ Giổi xanh nghiên cứu có mức độ đa hình ADN lục lạp thấp, gần khơng có khác biệt mặt di truyền Có thể phần lớn xuất xứ có nguồn gốc Do đó, để đánh giá cách toàn diện mức độ đa dạng di truyền xuất xứ Giổi xanh tiến hành nghiên cứu đa hình hệ gen nhân thị RAPD 3.3 Kết PCR với thị RAPD Sản phẩm PCR thu từ mồi RAPD điện di gel agarose để đánh giá độ đa dạng phân đoạn ADN xuất xứ nghiên cứu thể hình 3.11, hình 3.12, hình 3.13, hình 3.14, hình 3.15 36 M 10 11 12 13 14 15 kb kb Hình 3.11 Sản phẩm RAPD - PCR ADN hệ gen 15 xuất xứ Giổi xanh với mồi OPC17 (M: Marker kb, 1- 15: Sản phẩm PCR mẫu) M 10 11 12 13 14 15 kb 0,5 kb Hình 3.12 Sản phẩm RAPD - PCR ADN hệ gen 15 xuất xứ Giổi xanh với mồi OPC12.(M: Marker kb, 1- 15: Sản phẩm PCR mẫu) M 10 11 12 13 14 15 1,5 kb kb Hình 3.13 Sản phẩm RAPD - PCR ADN hệ gen 15 xuất xứ Giổi xanh với mồi OPC20 (M: Marker kb, 1- 15: Sản phẩm PCR mẫu) 37 M 10 11 12 13 14 15 kb 0,5 kb Hình 3.14 Sản phẩm RAPD - PCR ADN hệ gen 15 xuất xứ Giổi xanh với mồi OPC9 (M: Marker kb, 1- 15: Sản phẩm PCR mẫu) M 14 15 10 11 12 13 kb Hình 3.15 Sản phẩm RAPD - PCR ADN hệ gen 15 xuất xứ Giổi xanh với mồi OPB1 (M: Marker kb, 1- 15: Sản phẩm PCR mẫu) Việc phân tích phân đoạn ADN thu dựa có mặt hay vắng mặt chúng mẫu nghiên cứu Nếu có mặt ký hiệu 1, vắng mặt ký hiệu Các phân đoạn ADN nhân gồm hai loại: phân đoạn đơn hình (là phân đoạn có mặt tất mẫu) phân đoạn đa hình (là phân đoạn có mặt mẫu vắng mặt mẫu khác) Dựa vào đa hình phân đoạn đánh giá giống khác mẫu nghiên cứu Kết phân tích với 10 mồi RAPD thể bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết phân tích 10 mồi RAPD 38 Tên mồi TT Số phân đoạn Số phân đoạn Tỷ lệ phân đoạn đếm đƣợc đa hình đa hình (%) OPB1 125 20 16,00 OPB5 92 77 83,69 OPB8 55 40 72,73 OPB9 76 61 80,26 OPB10 94 79 84,04 OPC9 156 126 80,76 OPC12 118 38 32,20 OPC13 91 31 34,07 OPC17 110 95 86,36 10 OPC20 103 28 27,18 1020 595 58,33 Tổng Qua bảng 3.2 ta thấy: Các sản phẩm PCR ADN genome xuất xứ Giổi xanh với mồi RAPD cho đa hình.Trong tổng số 1020 phân đoạn thu có 595 phân đoạn đa hình chiếm 58,33% 425 phân đoạn đơn hình chiếm 41,67% Mức độ đa hình dao động từ 16% - 86,36% Trong mồi OPC17 có tỷ lệ phân đoạn đa hình cao (86,36%), với 110 phân đoạn thu có 95 phân đoạn đa hình Các mồi OPB9, OPC9, OPB5, OPB10 cho tỷ lệ phân đoạn đa hình cao tương ứng với tỷ lệ 80,26%, 80,76%, 83,69%, 84,04% Tỷ lệ đa hình thấp mồi OPB1 (16%) với 125 phân đoạn thu 20 phân đoạn đa hình Sự đa hình mồi RAPD cho thấy xuất xứ Giổi xanh nghiên cứu có đa dạng di truyền hệ gen nhân 3.4 Quan hệ di truyền xuất xứ Giổi xanh 39 Để nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền, dựa vào ba cơng thức tính hệ số di truyền là: hệ số Jaccard (1908), hệ số SM (Sokal Michener, 1958), hệ số Nei Li (1979) Để phân tích nhóm so sánh ma trận tương đồng với nhau, người ta thường sử dụng số ma trận như: ma trận khác UPGMA (Sokal Michener, 1958), ma trận giống WPGMA (Sneath Sokal, 1973) Việc sử dụng phương pháp tính tốn tùy thuộc vào đối tượng mục đích nghiên cứu Nhiều nghiên cứu sử dụng hệ số tương đồng di truyền Jaccard phương pháp tính UPGMA cho nghiên cứu di truyền phù hợp Vì nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng hệ số tương đồng di truyền Jaccard phương pháp tính UPGMA cho nghiên cứu đa dạng di truyền xuất xứ Giổi xanh 3.4.1 Kết phân tích quan hệ di truyền xuất xứ Giổi xanh dựa vào thị lục lạp Các mồi lục lạp enzyme sử dụng nghiên cứu cho kết bước đầu mức độ đa dạng di truyền 15 xuất xứ Giổi xanh thấp, mặt nguồn gốc xuất xứ Giổi xanh có nguồn gốc đoạn gen lục lạp bảo thủ mang đặc trưng lồi Vì đa hình phân đoạn ADN lục lạp nhân thấp nên chúng tơi khơng xử lí số liệu theo chương trình NTSY - pc NTSY SIMQUAL để xây dựng biểu đồ hình thể quan hệ di truyền xuất xứ nghiên cứu 3.4.2 Kết phân tích quan hệ di truyền xuất xứ Giổi xanh dựa vào thị RAPD Số liệu thu từ kết PCR - RAPD đưa vào chương trình NTSYS - pc NTSYS - SIMQUAL xử lý để tính hệ số tương đồng di truyền thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Hệ số tƣơng đồng di truyền 15 xuất xứ Giổi xanh dựa vào thị RAPD 40 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G1 1.000 G2 0.406 1.000 G3 0.558 0.225 1.000 G4 0.729 0.361 0.628 1.000 G5 0.604 0.317 0.512 0.738 1.000 G6 0.575 0.263 0.473 0.634 0.714 1.000 G7 0.465 0.297 0.302 0.558 0.565 0.650 1.000 G8 0.534 0.243 0.439 0.666 0.666 0.725 0.642 1.000 G9 0.606 0.354 0.451 0.750 0.694 0.696 0.714 0.735 1.000 G10 G11 G12 G13 G14 G15 G10 0.585 0.219 0.526 0.725 0.761 0.700 0.581 0.731 0.676 1.000 G11 0.523 0.225 0.461 0.658 0.697 0.634 0.522 0.707 0.727 0.682 1.000 G12 0.684 0.289 0.500 0.700 0.659 0.717 0.634 0.707 0.812 0.642 0.743 1.000 G13 0.512 0.205 0.410 0.571 0.543 0.625 0.547 0.658 0.647 0.558 0.650 0.736 1.000 G14 0.621 0.216 0.514 0.600 0.604 0.702 0.536 0.609 0.636 0.625 0.560 0.729 0.823 1.000 G15 0.550 0.305 0.486 0.650 0.651 0.756 0.585 0.658 0.718 0.675 0.692 0.783 0.729 0.722 1.000 Hệ số tương đồng di truyền phản ánh mối quan hệ di truyền đối tượng nghiên cứu: hệ số tương đồng di truyền cao cặp đối tượng gần gũi mặt tiến hóa ngược lại Kết bảng 3.3 cho thấy G2 G13 có hệ số tương đồng di truyền thấp nhất: 0,205; hệ số tương đồng di truyền cao G13 G14: 0,823 Như vậy, với thị RAPD cho thấy sai khác xuất xứ Giổi xanh mức độ phân tử ADN, từ xây dựng phân loại (hình 3.16) phần mềm máy vi tính NTSYS - pc 41 Hình 3.16 Biểu đồ quan hệ di truyền 15 xuất xứ Giổi xanh dựa vào thị RAPD Từ hình 16 ta thấy xuất xứ Giổi xanh có mối quan hệ di truyền khác (hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,28 đến 0,82) Trong có G2, G3 có khác biệt lớn ( hệ số tương đồng di truyền 0,28); tiếp G1 G3 có hệ số tương đồng di truyền 0,49; G1 G7 0,58 Hai xuất xứ G13 G14 có kiểu hình có hệ số tương đồng di truyền cao nhất: 0,82 Các xuất xứ lại (G4, G5, G10, G6, G15, G8, G9, G11, G12, G12, G14) đứng tách biệt thể khác biệt chúng với mức độ sai khác từ: 20% - 32% Trong hệ số tương đồng di truyền G9 G12 0,81; G6, G15 0,75; G5, G10 0,76 Như vậy, qua kết phân tích RAPD thấy xuất xứ Giổi xanh nghiên cứu có khác biệt ADN nhân Sự khác biệt tác động điều kiện sinh thái lên tính trạng thích nghi xuất xứ cụ thể 42 KẾT LUẬN - KHUYẾN NGHỊ Kết luận Từ kết thu rút số kết luận sau: 15 xuất xứ Giổi xanh nghiên cứu có mức độ đa dạng di truyền gen nhân cao, hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,28 đến 0,82 Sự khác biệt mức độ gen nhân tác động điều kiện sinh thái lên tính trạng thích nghi vùng cụ thể Về mặt nguồn gốc phần lớn xuất xứ Giổi xanh có nguồn gốc khơng có sai khác ADN lục lạp Một số xuất xứ (G1, G6, G9, G15) có nguồn gốc khác Khuyến nghị Đề tài dừng lại việc phân tích 15 xuất xứ Giổi xanh đại diện vùng Kon Hà Nừng (Gia Lai) Vì vậy, để phân tích sâu sắc tồn diện đa dạng di truyền xuất xứ Giổi xanh, cần tiếp tục phân tích nhiều xuất xứ vùng khác 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hồ Huỳnh Thùy Dương, (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội, tr 190 - 198 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, tr 38 - 61 Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 129 -154 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, Nhà xuất Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr 134 - 146 Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2006), Thực vật rừng, Trường Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam, tr 83 - 84 Nguyễn Đức Thành, Phan Thị Bảy, Lê Hồng Điệp (1999), Phát triển ứng dụng thị phân tử nghiên cứu đa dạng phân tử lúa, Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học, tr 1205 - 1215 Nguyễn Đức Thành, Phạm Duy Toản, Nguyễn Hoàng Anh, Nguyễn H T., (2000), Ứng dụng thị phân tử RAPD STS nghiên cứu đa dạng di truyền chọn giống lúa, Những vấn đề nghiên cứu sinh học, tr 149 - 151 Nguyễn Hồng Minh (1999), Giáo trình Di truyền học, Trường Đại học Nơng Nghiệp, NXB Nông nghiệp, tr 185 - 186 Nguyễn Thị Dung, Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Hoàng Tỉnh (2005), Sử dụng kỹ thuật RAPD AFLP để nghiên cứu quan hệ di truyền hai giống vải thiều vải chua, Báo cáo khoa học Hội nghị Toàn quốc 2005, Nghiên cứu khoa học sống, tr 1160 - 1162 44 10 Nguyễn Thúy Hạnh (2005), Nghiên cứu mối quan hệ di truyền số chi loài họ Dầu ( Dipterocarpaceae) Việt Nam thị ADN lục lạp RAPD, Luận văn Thạc sỹ, Viện Sinh Thái Tài nguyên sinh vật 11 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình Cơng nghệ sinh học nơng nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội tr 103 – 104 12 Phạm Nhật (2001), Bài giảng đa dạng sinh học, Trường Đại học Lâm Nghiệp, tr - 83 13 Phạm Bình Quyền, Nguyễn Nghĩa Thìn (2002), Đa dạng sinh học, NXB Nông nghiệp Hà Nội,tr - 85 14 Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa (2004), Sử dụng thị RAPD ADN lục lạp nghiên cứu quan hệ di truyền số xuất xứ Lim xanh (Erythrophloeum fordii Oliv.), Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc “ Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống”, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 464 - 468 15 Trần Quốc Trọng, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005), “Kết bước đầu đánh giá đa dạng di truyền ba xuất xứ Lim xanh thị RAPD ADN lục lạp”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thôn, số 8/2005, tr.62 - 81 16 Võ Thị Thương Lan (2007), Sinh học phân tử tế bào ứng dụng, NXB Giáo dục Hà Nội, tr 169 - 173 Tiếng Anh 17 Ali M.D.L., (1999), Mapping QTL for root traits related to drought resistance in rice (O sativa L.) using AFLP markers, A dissertation in Agronomy, Texas Tech University 18 Aagesen L., Medan D., Kellermann J., Hilger H H., (2005), Phylogeny of Tribe Colletieae (Rhamnaceae)- a sensitivity analysis of the plastid region 45 trnL – trnF combined with morphology, Plant Systematic and Evolution, 250, pp 197 - 214 19 Brown S.M and Kresovich S (1996), Molecular characterization for plant genetic resources conservation, In Genome mapping in plants, pp: 85 93 20 Conti E., Endress P K., Qiu Y L., Kocyan A., (2004), A phylogenetic analysis of Apostasioideae (Orchidaceae) based on ITS, trnL – trnF , Plant systematic and Evolution 21 Dyer T A (1984), The choloplast genome: its nature and role in development In: Baker N R., Barker J (eds), Chloroplast Biogenesis Elsevier, Amsterdam: 23-69 22 Dayanandan S., Ashton P S., William S M., Primack R B., (1999), “Phylogeny of the tropical tree family Dipterocarpaceae based on nucleotide sequences of chloroplast rbcL gene”, Amer Journal of Botany, 86, pp 1182 1190 23 Demesure B., Sodzi N., Petit R.J (1995), "A set of universal primers mitochondrial and chloroplast DNA in plant", Mol Ecol 4, pp: 129 - 131 24 Devos N., Tyteca D., Raspe O., Wesselingh R A (2003), “Pattern of chloroplast diversity among western European Dactylorhiza species (Orchidaceae)”, Plant Syst 243 : 85- 97 25 Entrez genomics (2006), Complete chloroplast genome sequences, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 26 FIPI (Forest Inventory and Planning Institute) (1996), Vietnam Forest Trees Agricultural Publishing House, Hanoi 27 Gupta PK., Balyan HS., Sharma PC., Ramesh B (1996), “Microsatellites in plants: A new class of molecular markers”, Current science, 70 (1): 45 53 46 28.Grant D M., Gillham N W., Boynton J.E., (1980), Inheritance of chloroplast DNA in Chlamydomonas reihardii, Proc Natl Acad Sci USA, (77), pp 6067 - 6071 29 Haber W A., Agius B.R., Stoleers S.L., Setzer W.N (2008), Bioactivity and Chemical Composition of the Leaf Essential Oil of Talauma gloriensis Pittier (Magnoliaceae) from Monteverde, Costa Rica, Rec Nat Prod 2(1): 30 Kartel N A., Malyshev S V., (1997), Molecular Marker in Mapping of Plant Genomes, Molecular Biology, (31), pp: 163 - 171 31 Lu S Y., Hong K H., Liu S L., Cheng Y P., Wu W L., Chiang T Y., (2002), “Genetic variation and population differentiation of Michelia formosana (Magnoliaceae) based on cpDNA variation and RAPD fingerprint: relevance to post- Pleistocence recolonization”, J Plant Res (115), pp: 203 – 216 32 Li Z (1999), DNA markers and QTL mapping in rice, In Genetic improvement of rice for water - limited environments IRRI, 157 – 172 33 Maughan P J., Maroof M S., Buss G R., Huestis G M (1996), Amplified fragment length polymorphism (AFLP) in soybean: species diversity, inheritance and near-isogenic line analysis, Theor Appl Genet, 93: 392 - 401 34 Mohanty A., Martin JP., Aguinagalde I., (2001), Chloroplast DNA study in wild popualations and some cultivars of Prunus avium L., Theor Appl Genet 103: 112 - 117 35 Malyshev SV., Kartel NA (1997), “Molecular Marker in Mapping of Plant Genomes”, Molecular biology 31(2): 163 - 171 36 Morato G S., Calixto J B., Morato E F., Nicolau M., Rae G A., Takahashi R N.,; Valle R M., Yunes R A., (1989), Chemical and 47 pharmacological studies on Talauma ovata St Hil (Magnoliaceae), Journal of ethnopharmacology, 26(3): 277 - 86 37 Millan T., Osuna F., Torres A.M and Cubero J.I (1996), “Using RAPD to study phylogenetic relationships in Rosa”, Theor Appl Genet (92), pp: 273 - 277 38 Nee M (2008), A new species of Talauma (Magnoliaceae) from Bolivia, Britonia 46(4):265 - 269 39 Olmstead R G., Palmer J D (1994), Chloroplast DNA Systematics: A review of methods and Data Analysis, American Journal of Botany, 81, pp 1205 - 1224 40 Palmer J D., Thompson W F., (1981), Rearrangements in the chloroplast genomes of mung bean and pea, Proc Nalt Acad Sci USA 78 (9), 5533 5537 41 Palmer J D (1983), Chloroplast DNA exists in two orientations Nature 301: 92 - 93 42 Powell W., Morgante M., Devitt R Mc., Vendramin G G., Rafalski J A., (1995), Polymorphic simple sequence repeat regions in chloroplast genomes: applications to the population genetics of pines, Proc Natl Acad Sci USA 92 (17), pp 7759 - 7763 43 Redona E.D., Hipolito L.D., Ocampo T.D and Sebastian L.S (1998), Clasification of cytoplasmic male-sterile rice lines based on RAPDs, SSRs and AFLPs Agricultural Biotechnology, 87 - 89 44 Sato S., Nakamura Y., Kaneko T., Asamidu E., Tabata S., (1999), Complete Structure of the Chloroplast Genome of Arabidopsis thaliana, DNA Reseach, 6, pp 283 - 290 48 45 Sanchez de la Hoz M.P., Davila J.A., Loarce Y., Ferrer E., (1996), Simple sequence repeat primers used in polymerase chain reaction amplifications to study genetic diversity in barley, Genome 39: 112 – 117 46 Sandhu S.S., Bastos C R., Azini L M., Neto A T and Colombo C., (2002), “RAPD analysis of herbicide- resistant Brasilian rice lines produced via mutagenesis, Online journal ISSS - 1676 – 5680 47 Thanh N.D., Zheng H.G., Dong N.V., Trinh L.N., Ali M.L and Nguyen H.T., (1999), Genetic variation in root morphology and microsatellite loci in upland rice (oryza sativa L) from Vietnam, Euphytica, 105: 43 - 51 48 Taramino G., Tingey S., (1996), Simple sequence repeats for germplasm analysis and mapping in maize, Genome 39: 277 – 287 49 Tatineni V., Cantrell R.G., Davis D.D., (1996), Genetic diversity in elite cotton germplasm determined by morphological characteristics and RAPDs Crop Sci., 36: 186 - 192 50 Yen D A., (2005), Molecular Systematics of Cyperaceae Tribe Cariceae based on two chloroplast DNA regions: ndhF and trnL Intron – intergenic Spacer, Systematic Botany, 25, pp 479 - 494 51 Yukawa M., Tsudzuki T., Sugiura M., (2006), The chloroplast genome of Nicotianas sylvestris and Nicotiana tomentosisformis: complete sequencing confirms that the Nicotiana sylvestris progenitor is the maternal genome donor of Nicotiana tabacum, Mol genet genomics, 275, pp 367 - 373 52 Winter P., and Kalh G., (1995), Molecular marker technologies for plant improverment World Journal of Microbiology and Biotechnology 11: 438 448 53 Zhao X., and Kochert G., (1993), Phylogenetic distribution and genetic mapping of a (GGC)n microsatellite from rice (oryza sativa L.), Plant Molecular Biology, 21: 607 - 614 49 ... đoạn đa hình Sự đa hình mồi RAPD cho thấy xuất xứ Giổi xanh nghiên cứu có đa dạng di truyền hệ gen nhân 3.4 Quan hệ di truyền xuất xứ Giổi xanh 39 Để nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền, dựa vào. .. sức nghiên cứu nhà khoa học Trên sở đó, tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu đa dạng di truyền số xuất xứ Giổi xanh (Michelia mediocris Dandy) dựa vào thị ADN" với mục đích nghiên cứu. .. 1.4 Chỉ thị ADN ứng dụng thị ADN nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật 1.4.1 Chỉ thị ADN Chỉ thị ADN (chỉ thị phân tử) gen đoạn trình tự nucleotide đặc hiệu hệ gen sinh vật (bao gồm ADN nhân, ADN