Nghiên cứu chiết xuất polysaccharide và tannin trong nấm lim xanh

LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp, tơi nhận đƣợc nhiều giúp đỡ, tạo điều kiện từ nhà trƣờng thầy cô Bộ môn Công nghệ Vi sinh- Hóa sinh, giảng viên, cán phịng ban chức Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam Tôi xin cám ơn bày tỏ lòng cảm ơn chân thành giúp đỡ Tơi xin chân thành cám ơn gia đình, bạn bè ln ln khích lệ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập, nghiên cứu khoa học hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Kim Dung - ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn bảo tận tình cho tơi suốt q trình làm đề tài khóa luận tốt nghiệp Giúp cho tơi có thêm kiến thức chuyên môn, xây dựng tảng vững phục vụ cho việc học tập nghiên cứu Với cố gắng thực khóa luận cách nghiêm túc nhƣng thiếu sót hạn chế thân, gặp phải điều mà chƣa làm đƣợc Rất mong nhận đƣợc đóng góp đƣa ý kiến quý thầy giáo, cô giáo để luận văn đƣợc hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2018 Sinh viên thực Phạm Trung Thành i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Nấm Lim xanh 1.1.1 Giới thiệu Nấm Lim xanh 1.1.2 Đặc điểm sinh trƣởng phát triển Nấm lim xanh 1.1.3 Đặc điểm hình thái Nấm lim xanh 1.1.4 Thành phần dƣợc chất tác dụng dƣợc lý Nấm Lim xanh 1.2 Tổng quan polysaccharide 1.2.1 Giới thiệu polysaccharide 1.2 Vai trị cơng dụng 10 1.2.3 Polysaccharide Nấm Lim xanh 11 1.3 Tổng quan Tannin 11 1.3.1 Cấu trúc hóa học 11 1.3.2 Tính chất tannin 12 1.3.3 Vai trị cơng dụng 13 1.3.4 Tannin số dƣợc liệu 16 1.4 Tình hình nghiên cứu tách chiết polysaccharide tannin 16 1.5 Phƣơng pháp định tính, định lƣợng tannin polysaccharid 17 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 19 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Vật liệu phạm vi nghiên cứu 19 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 19 ii 2.3.2 Phạm vi, địa điểm nghiên cứu 19 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phƣơng pháp chiết xuất định lƣợng polysaccharide 19 2.4.2 Phƣơng pháp chiết xuất định lƣợng tannin 21 2.5 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 21 2.5.1 Xác định phƣơng pháp chiết xuất polysaccharide tannin 21 2.5.2 Xác định điều kiện ảnh hƣởng đến hiệu suất chiết xuất polysaccharide 22 2.5.3 Xác định điều kiện ảnh hƣởng đến hiệu suất chiết xuất tannin 23 2.5.4 Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất polysaccharide từ Nấm lim xanh 25 2.6 Phƣơng pháp thu thập xử lý số liệu 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Xác định phƣơng pháp thích hợp cho chiết xuất polysaccharide tannin 28 3.2 Xác định điều kiện ảnh hƣởng đến hiệu suất chiết xuất polysaccharide 30 3.2.1 Ảnh hƣởng tỉ lệ nguyên liệu : dung môi 30 3.2.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ 31 3.2.3 Xác định điều kiện ảnh hƣởng thời gian 32 3.3 Xác định điều kiện ảnh hƣởng đến hiệu suất chiết xuất tannin 34 3.3.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ nƣớc : ethanol 34 3.3.2 Ảnh hƣởng nguyên liệu : dung môi 35 3.3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ 36 3.3.4 Ảnh hƣởng thời gian 38 3.4 Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất polysaccharide từ Nấm lim xanh 40 3.4.1 Phân tích phƣơng sai 41 3.4.2 Phƣơng trình hồi quy 42 3.4.3 Tối ƣu hóa điều kiện chiết xuất 42 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MOP Polysaccharides từ Morinda officinalis CS Cộng PS Polysaccharide IL Interleucine iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần chất có hoạt tính Nấm lim xanh Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm xây dựng đƣờng chuẩn glucose…………………20 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm xác định phƣơng pháp chiết xuất polysaccharide tannin phù hợp 22 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng tỉ lệ nguyên liệu rắn : dung môi đến hiệu suất chiết xuất polysaccharide 22 Bảng 2.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết xuất polysaccharide 23 Bảng 2.5 Ảnh hƣởng thời gian đến hiệu suất chiết xuất polysaccharide 23 Bảng 2.6 Ảnh hƣởng tỉ lệ nƣớc : ethanol đến hiệu suất chiết xuất tannin 24 Bảng 2.7 Ảnh hƣởng tỉ lệ nguyên liệu rắn : dung môi đến hiệu suất chiết xuất tannin 24 Bảng 2.8 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết xuất tannin 25 Bảng 2.9 Ảnh hƣởng thời gian đến hiệu suất chiết xuất tannin 25 Bảng 2.10 Các biến số khoảng chạy chúng 26 Bảng 2.11 Ma trận thực nghiệm 26 Bảng 3.1 Hàm lƣợng polysaccharide tannin chiết xuất theo phƣơng pháp 29 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng tỉ lệ nguyên liệu : dung môi đến hiệu xuất tách chiết polysaccharide 30 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết xuất polysaccharide 31 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng thời gian đến hiệu suất chiết xuất polysaccharide 32 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng tỷ lệ nƣớc : ethanol đến hiệu suất chiết xuất tannin 34 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu : ethanol đến hiệu suất chiết xuất tannin 35 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết xuất tanin 36 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng thời gian đến hiệu suất chiết xuất tannin 38 Bảng 3.9 Kết tối ƣu hóa q trình chiết xuất polysaccharide từ ba kích 40 Bảng 3.10 Kết phân tích phƣơng sai mơ hình tối ƣu phần mềm DesignExpert 7.1.5 (Bảng anova) 41 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nấm lim xanh Yên Tử - Quảng Ninh Hình 1.2 Nấm lim xanh tự nhiên Hình 1.3 Cấu tạo fucoidan (A) beta glucan (B) Hình 1.4 Một số sản phẩm chứa polysaccharide đƣợc ứng dụng thực phẩm 11 Hình 1.5 Cấu tạo acid galic (A) số dạng tannin dƣợc liệu (B) 12 Hình 1.6 Cấu trúc tannin ngƣng tụ 12 Hình 3.1 Nấm lim xanh sau sơ chế 28 Hình 3.2 Đƣờng chuẩn glucose 28 Hình 3.3 Dịch chiết Nấm lim xanh phƣơng pháp siêu âm (C), hãm (B), hầm (A) 29 Hình 3.4 Phần dịch chứa polysaccharide 100 C 31 Hình 3.5 Phần tủa polysaccharide 75 phút 33 Hình 3.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến tannin, phần tủa chứa tannin 37 Hình 3.7 Dịch tủa chứa tannin 75 phút 39 Hình 3.8 Phản ứng tủa tannin với Fe3+ Pb2+ 39 Hình 3.9 Hàm mục tiêu điều kiện tối ƣu để chiết xuất polysaccharide 42 Hình 3.10 Bề mặt đáp ứng hàm lƣợng polysaccharide 43 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, giới Việt Nam việc sử dụng dƣợc liệu có nguồn gốc tự nhiên đƣợc trọng lợi ích mang lại cho ngƣời Khi nhu cầu tăng cao việc nghiên cứu hoạt tính sinh học quy trình bào chế, sản xuất thành phẩm dƣợc liệu ngày phát triển Việt Nam nƣớc khí hậu nhiệt đới gió mùa, điều kiện thích hợp để số loại dƣợc liệu quý sinh trƣởng nhƣ Ba kích, Đinh lăng, Củ dịm, Ngũ bội tử…Trong phải kể đến Nấm lim xanh loại dƣợc liệu quý cung cấp lƣợng đáng kể chất có hoạt tính sinh học nhƣ polysaccharide (giàu glucan), tannin, triterpenoid, steroid, saponin, anthraquinon, terpenoid, glucosides…Ở Nấm lim xanh, polysaccharide đƣợc xem nhóm chất quan trọng chúng có khả chống lại tế bào ung thƣ tannin nhóm chất có khả chống oxy hóa cao Với tác dụng mà Nấm lim xanh mang lại nên đƣợc sử dụng rộng rãi thuốc cổ truyền phối trộn dƣợc liệu khác Hiện Việt Nam, việc nghiên cứu tách chiết polysaccharide tannin Nấm lim xanh chƣa có nhiều, nhiên có số nghiên cứu tách chiết polysaccharide tannin Nấm linh chi đỏ, trà hoa vàng, Nấm hƣơng Việc trích ly hoạt chất sinh học có dƣợc liệu phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ loại dung môi, nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly…Trong tất loại dung mơi nƣớc đƣợc xem loại dung mơi tốt cho q trình trích ly nƣớc không độc hại, không dễ cháy, giá thành rẻ ứng dụng sản xuất thực phẩm cách dễ dàng Mục tiêu mà đề tài hƣớng tới chọn nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dƣợc liệu : dung mơi trích ly tối ƣu nhằm thu đƣợc hàm lƣợng hoạt chất sinh học cao nhất, trọng tâm nhóm chất polysaccharide tannin để ứng dụng hiệu sản xuất sản phẩm có liên quan tới nguồn dƣợc liệu Xuất phát từ tơi thực đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất polysaccharide tannin Nấm lim xanh” CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Nấm Lim xanh 1.1.1 Giới thiệu Nấm Lim xanh Nấm Lim xanh hay đƣợc gọi Nấm Linh chi Việt Nam có tên khoa học Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst., có tên đồng nghĩa Polyporum lucidus W Curt., thuộc họ Nấm Lim (Ganodermataceae) Ngồi Nấm lim xanh cịn có tên gọi khác nhƣ: Tiên thảo, Nấm trƣờng thọ, Vạn niên nhung, thuộc họ Nấm lim (Ganodermataceae) Khái quát: Tên khoa học: Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst Tên đồng nghĩa: Polyporum lucidus W Curt Tên khác: vạn niên nhung, tiên thảo, nấm trƣờng thọ Thuộc họ: Ganodermataceae Bộ nấm lỗ: Anphyllophorales Lớp phụ: Hymenomycetidae Lớp: Hymenomycetes Ngành phụ: Basidiomycotiana Ngành nấm thật: Eumycota Giới nấm: Fungi Hình 1.1 Nấm lim xanh Yên Tử - Quảng Ninh Nấm lim xanh mọc gốc Lim xanh rừng nguyên sinh khu vực rừng tán lớn chịu tác động ngƣời có Việt Nam Lào Ở Việt Nam, Nấm lim xanh có mặt tỉnh đồi núi nhƣ: Hồ Bình, Quảng Ninh, Bắc Giang…Chúng có tác dụng lớn việc phục hồi thể lực ngƣời đặc biệt trình chữa bệnh mãn tính Theo tài liệu cổ Nấm Lim Xanh có loại cụ thể nhƣ sau (Trịnh Tam Kiệt cs, 2001): + Nấm đỏ, xích hay hồng linh chi loại mọc từ rễ lim có vị đắng loại chứa nhiều chất polysaccharides có tác dụng chống ung thƣ, chống rối loạn miễn dịch chống cao huyết áp thành phần quan trọng khác triterpenes hay đƣợc gọi ganoderic acids giúp giảm nhẹ dị ứng đẩy mạnh khả hấp thụ ôxy thể làm tăng hoạt động gan + Nấm đen, hắc linh chi loại mọc từ vỏ lim xanh có tác dụng ổn định huyết áp, giảm mệt mỏi, hỗ trợ thần kinh chống đau đầu tê tứ chi, ngồi cịn có tác dụng loại trừ chất cholesterol đƣợc tích tụ thành mạch giúp làm máu, chất germanium hắc linh chi giúp tế bào hấp thụ oxy tốt làm tăng cƣờng khả tuần hồn lƣu thơng máu, điều hịa kinh nguyệt phụ nữ Ngồi ra, hắc linh chi cịn có chức giúp tăng cƣờng miễn dịch cho thể nhờ chất polysaccharide chống viêm, chống dị ứng nhờ thành phần acid ganodermic, công dụng quan trọng hắc linh chi tác dụng tốt gan, điều hịa tiêu hóa giảm chứng béo phì, làm cho ruột đƣợc chống táo bón ỉa chảy, hắc linh chi cịn giúp thúc đẩy trình tiết insulin giúp cải thiện cách việc thiểu insulin (một nguyên nhân gây nên bệnh đái đƣờng) Hắc linh chi giúp da dẻ hồng hào, ngăn chặn q trình lão hóa sớm… + Nấm trắng, bạch linh chi mọc từ lõi lim xanh có tác dụng ích phế khí, làm trí nhớ dai + Nấm vàng, hồng linh chi mọc từ tầng vỏ lõi lim thành phần bao gồm Beta Hetero- beta – glucans có tác dụng chống ung thƣ, kích thích hoạt động hệ thống miễn dịch, Ling Zhi – protein, Garnodermictriterpenes có tác dụng kháng dị ứng làm hạ cholesterol làm hạ huyết áp, giúp chống dị ứng, điều chỉnh hệ thống miễn dịch ngồi hồng linh cịn có tác dụng ích tì khí trung hịa, an thần + Nấm lim xanh màu xanh gọi chi giúp sáng mắt, an thần bổ can khí, dùng lâu thấy thân thể nhẹ nhàng thoải mái + Nấm lim xanh màu tím ngƣời ta cịn gọi tử chi có tác dụng làm cứng gân cốt, ích tinh, giúp da tƣơi đẹp Các dƣợc chất quan trọng Nấm lim xanh: Nấm lim xanh nhiều đặc tính vơ quan trọng việc chữa trị điều trị bệnh nhƣ, Polysaccharide, Letinan, Selenium, Triterpenes, Germanium,…và vitamin (Sakai T cs, 1995) 1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng phát triển Nấm lim xanh Có khả phân huỷ trực tiếp lớp cellulose để sinh trƣởng phát triển thân gỗ, điều kiện thích hợp có độ ẩm lƣợng mƣa lớn mơi trƣờng ánh sáng chiếu trực tiếp, đặc biệt dƣới tán to Trong trình nghiên cứu nhận thấy tìm đƣợc Nấm lim xanh rừng nguyên sinh đặc hữu chƣa chịu tác động ngƣời đặc biệt chúng mọc dƣới gốc thân lim đã, trên, trình phân huỷ mục nát Tại điều kiện có mơi trƣờng dinh dƣỡng khác thành phần hố học hàm lƣợng chất dinh dƣỡng đƣợc xác định khác nhau, nhƣ cho thấy điều kiện mơi trƣờng bên ngồi dinh dƣỡng có ảnh hƣởng lớn đến việc thu hồi nghiên cứu hàm lƣợng chất dinh dƣỡng Nấm lim xanh Trong điều kiện khí hậu Việt Nam, Nấm lim xanh chủ yếu mọc Quảng Ninh, Quảng Nam, khu vực biên giới Lào, với đặc điểm khí hậu Quảng Nam nơi có nhiều có nhiều Nấm lim xanh phát triển mọc nhiều 1.1.3 Đặc điểm hình thái Nấm lim xanh Chủ yếu gồm phần mũ nấm cuống nấm: + Cuống nấm dài trung bình từ 3-12cm, dày 0,5-3cm thƣờng có dạng hình trụ dẹp Trong trình sinh trƣởng cuống nấm phân nhánh, trơn nhẵn gợn sóng kiểu uốn khúc Bên cuống dạng sợi, lớp vỏ bên ngồi khơng có lơng, có màu nâu sẫm, đen nâu đen bóng Kết thí nghiệm bảng 3.4 cho thấy thời gian tách chiết có ảnh hƣởng lớn đến quy trình tách chiết polysaccharide Khi thời gian tăng hàm lƣợng polysaccharide tăng mạnh từ 30-45-60 phút lần lƣợt đạt 7,46 ± 0,08; 8,22 ± 0,17 10,70 ± 0,15 mg/g Tiếp tục tăng thời gian lên 75 phút hàm lƣợng thu đƣợc đạt mức cao 11,78±0,06 mg/g giảm mạnh tăng thời gian lên 90 phút Polysaccharide thơ (hình 3.5) thu đƣợc có màu trắng đục kết tủa qua đêm điều kiện oC Hình 3.5 Phần tủa polysaccharide 75 phút Điều đƣợc giải thích thủy phân phân tử hữu polysaccharid thời gian dài nhiệt độ cao Hàm lƣợng chất hữu giảm mạnh nhiệt độ tăng cao thời gian kéo dài Mặt khác thời gian thích hợp 17 loại axit amin liên kết với polysaccharide (Chan cs, 2016) nhiệt độ cao dễ dàng thu đƣợc polysaccharide hòa tan chất phân cực cách tối ƣu Đối với polysaccharide: Tiến hành thí nghiệm phƣơng pháp hầm tỉ lệ nguyên liệu rắn : dung môi = : 50, nhiệt độ phù hợp 100 C, thời gian phù hợp 75 phút cho hàm lƣợng cao (11,78±0,06 mg/g) Sau tối ƣu quy trình tách chiết hàm lƣợng polysaccharide Nấm lim xanh thu đƣợc cao đạt 11,78±0,06 mg/g nguyên liệu khô so với tài liệu dƣợc 33 điển Trung Quốc 2015, hàm lƣợng polysaccharide không đƣợc thấp 0,5% so với hàm lƣợng khô Theo G- Bing hàm lƣợng polysaccharide Nấm linh chi từ - 1,2% Kết thu đƣợc trình thí nghiệm đạt yêu cầu Một số nghiên cứu khác Nấm linh chi đỏ (Phạm Bảo Trƣơng cs, 2015) cho kết 130 C thời gian trích ly 30 phút cho hàm lƣợng polysaccharide Nấm linh chi cao (684,1 ± 14,5 mg/l) 3.3 Xác định điều kiện ảnh hƣởng đến hiệu suất chiết xuất tannin 3.3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ nước : ethanol Sau bố trí thí nghiệm xác định hàm lƣợng tannin ảnh hƣởng tỉ lệ nƣớc : ethanol theo tỉ lệ : 1, : 2, : 3, :4 (nồng độ cồn tăng từ 50 100) : 1, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi : 50 60 C thời gian 30 phút Hàm lƣợng tannin thu đƣợc bảng 3.5 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng tỷ lệ nƣớc : ethanol đến hiệu suất chiết xuất tannin Tỷ lệ nƣớc: ethanol Hàm lƣợng tannin (v/v) (mg/g) 1:1 2,89 ± 0,13 1:2 3,61 ± 0,05 1:3 4,08 ± 0,11 1:4 4,56 ± 0,15 0:1 2,65 ± 0,06 TT Từ bảng kết 3.5 cho thấy tăng nồng độ ethanol từ 50% lên 80% hàm lƣợng tannin tăng sử dụng phƣơng pháp hầm Tại nồng độ ethanol 80% hàm lƣợng tannin thu đƣợc đạt 4,56 ± 0,15 mg/g Trong khi nồng độ ethanol mức thấp 50% (theo tỉ lệ nƣớc : ethanol : 1) hàm lƣợng tannin thu đƣợc thấp (2,89 ± 0,13 mg/g) 34 Mặt khác, nồng độ ethanol tăng tới 100% (tỉ lệ nƣớc:ethanol 0:1) hàm lƣợng tannin giảm xuống nhanh (2,65 ± 0,06 mg/g) Việc tiến hành chiết xuất tannin theo nồng độ ethanol khác góp phần tìm tỉ lệ tối ƣu Ngun nhân tannin hợp chất polyphenol tan tốt ethanol nên tỉ lệ 1:4 tạo môi trƣờng có độ phân cực phù hợp với tannin Ngồi ra, số hợp chất khác tan tốt ethanol trình chiết xuất nồng độ ethanol tăng cao khiến hiệu suất chiết tannin giảm dần Qua cho thấy sử dụng phƣơng pháp hầm theo tỉ lệ nƣớc : ethanol = : phù hợp cho hiệu chiết xuất tannin cao 3.3.2 Ảnh hưởng nguyên liệu : dung môi Bố trí thí nghiệm sử dụng lệ nƣớc : ethanol = : 4, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi lần lƣợt : 40, 50, 60, 70, 90 thời gian 30 phút 60 C Kết thu đƣợc thể bảng 3.6 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu : ethanol đến hiệu suất chiết xuất tannin Tỷ lệ nguyên liệu : Hàm lƣợng tannin ethanol (g/ml) (mg/g) 2:40 4,34 ± 0,05 2:50 4,56 ± 0,08 2:60 4,01 ± 0,15 2:70 3,88 ± 0,11 2:80 3,67 ± 0,03 TT Từ bảng kết 3.6 cho thấy tiến hành tách chiết tannin theo phƣơng pháp hầm, tỉ lệ : 50 hàm lƣợng tannin đạt 4,56 ± 0,08 mg/g Và tăng hàm lƣợng dung môi so với nguyên liệu ban đầu 2g từ 60 ml lên 80 ml hàm lƣợng tannin thu đƣợc giảm nhanh tỉ lệ : 60 4,01 ± 0,15 mg/g, tỉ lệ 2:80 3,67 ± 0,03 mg/g 35 Đối với tannin tỉ lệ dung mơi thấp cho hiệu tách chiết tannin cao tác động chất phân cực mà tannin hòa tan Kết hợp với phƣơng pháp hầm tỉ lệ nguyên liệu : dung môi = : 50 để tiến hành sử dụng vào thí nghiệm tối ƣu quy trình tách chiết tannin sau 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ Từ tỉ lệ nƣớc : ethanol = : 4, nguyên liệu : dung môi = : 50 tiến hành xây dựng thí nghiệm dải nhiệt 40, 50, 60, 70, 80, 90oC thời gian 30 phút phƣơng pháp hầm để xác định hàm lƣợng tannin Kết thu đƣợc bảng 3.7 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết xuất tanin TT Nhiệt độ (oC) Hàm lƣợng tannin (mg/g) 40 3,36 ± 0,02 50 4,26 ± 0,05 60 4,56 ± 0,12 70 4,07 ± 0,18 80 3,82 ± 0,03 90 3,54 ± 0,05 Qua bảng 3.7 ta thấy: Quy trình tách chiết xảy nhiệt độ thấp 60 oC thu đƣợc hàm lƣợng cao Lƣợng tannin thu đƣợc cao tăng từ 40 C (3,36 ± 0,02 mg/g) lên 60 C (4,56 ± 0,12 mg/g) đạt giá trị cao giảm mạnh tăng nhiệt lên tới 90 C (3,54 ± 0,05 mg/g) Hàm lƣợng tannin tủa dịch chiết quan sát đƣợc rõ nét thay đổi yếu tố chiết xuất (hình 3.6) 36 40oC 50oC 60oC 70oC 80oC 90oC Hình 3.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến tannin, phần tủa chứa tannin Quá trình đƣợc giải thích tannin nhóm chất có nhiệt độ phân hủy khơng ổn định tùy thuộc vào loại tannin điều kiện môi trƣờng Mặt 37 khác tannin bị oxy hóa có mặt oxy trình tách chiết nhiệt độ tƣơng đối cao dƣới tác động enzyme polyphenol oxydase ( Lê Ngọc Tú, 2003) Để giảm thiểu việc oxy hóa phải tăng ngƣỡng nhiệt nên cao ngƣỡng 110 C dẫn đến số yếu tố khác trình nghiên cứu Từ kết lựa chọn nhiệt độ tách chiết tannin 60 C cho thí nghiệm sau 3.3.4 Ảnh hưởng thời gian Tiến hành thực thí nghiệm ảnh hƣởng thời gian 30, 45, 60, 75 90 phút để chiết xuất tannin với tỉ lệ nƣớc : ethanol = 1: 4, nguyên liệu : dung môi = :50 60 C Kết thu đƣợc đƣợc biểu diễn bảng 3.8 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng thời gian đến hiệu suất chiết xuất tannin TT Thời gian (phút) Hàm lƣợng tannin (mg/g) 30 4,56 ± 0,11 45 5,94 ± 0,09 60 6,23 ± 0,07 75 7,02 ± 0,08 90 6,04 ± 0,18 Đối với tannin thời gian làm tăng hàm lƣợng tannin cách đáng kể, thời gian tăng từ 30 phút (4,56 ± 0,11 mg/g) tới 75 phút hàm lƣợng đạt cao (7,02 ± 0,08 mg/g) tiếp tục giảm tăng thời gian lên 90 phút (6,04 ± 0,18 mg/g) Hàm lƣợng dịch tủa chứa tannin thu đƣợc cao 75 phút quan sát đƣợc mắt thƣờng có màu vàng nhạt (hình 3.7), sau kết tinh đƣợc đƣa dạng bột để tham gia vào trình rửa tủa xác định hàm lƣợng tannin thơ 38 Hình 3.7 Dịch tủa chứa tannin 75 phút Trong trình tách chiết tannin, để định tính tannin cách nhanh việc sử dụng thuốc thử nhƣ Fe3+, Pb2+ Cho tủa màu đặc trƣng (hình 3.8), Fe3+ cho màu nâu đen, Pb2+ dễ dàng quan sát đƣợc lớp tủa dạng màu vàng nhạt Ngồi ra, sử dụng đồng acetat để định tính tannin dịch chiết Hình 3.8 Phản ứng tủa tannin với Fe3+ Pb2+ Tiến hành sử dụng phƣơng pháp hầm tỉ lệ nƣớc : ethanol = : 4, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi = : 50, nhiệt độ phù hợp 60 C thời gian 60 phút cho hàm lƣợng tannin cao (7,02 ± 0,08 mg/g) Hàm lƣợng tannin thu đƣợc cao thân nấm mỡ 176,4 mg/100g, mũ nấm mỡ 245,3 mg/100g, nấm đùi gà 81,7 mg/100g, nấm sò trắng 65,9 3,7 mg/100g, nấm ngọc châm 55,3 nấm sị tím 43,1 0,5 mg/100g (Ngơ Xn Mạnh, 2015) 39 2.5 mg/100g, Hàm lƣợng thấp trà (20-30%), ngũ bột tử 50-70%, Trong nấm linh chi đỏ hàm lƣợng tannin cao (630,9 ±18,2 mg/l) đạt đƣợc thực q trình trích nhiệt độ 120 C thời gian 45 phút (Phạm Bảo Trƣơng, 2015) 3.4 Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất polysaccharide từ Nấm lim xanh Do thành phần hoạt tính sinh học polysaccharide Nấm lim xanh có vai trị vơ quan trọng với ngƣời Nên tiến hành tối ƣu hóa quy trình chiết xuất nhằm thu đƣợc hàm lƣợng polysaccharide cao Q trình tối ƣu hóa quy trình chiết xuất dựa sở khảo sát điều kiện thích hợp để chiết xuất polysaccharide yếu tố ảnh hƣởng đơn: ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu: dung môi, nhiệt độ, thời gian, nhận thấy để thu đƣợc hiệu chiết xuất polysaccharide cao, tiến hành xác định ảnh hƣởng đồng thời yếu tố theo phƣơng pháp sử dụng phần mềm Design-Expert 7.1.5 với quy hoạch Box-Benken, ma trận thực nghiệm gồm 17 thí nghiệm với khoảng chạy yếu tố ảnh hƣởng mạnh tới hiệu suất chiết xuất polysaccharide từ Nấm lim xanh Kết thí nghiệm đƣợc biểu diễn bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết tối ƣu hóa trình chiết xuất polysaccharide từ ba kích TT 10 11 12 13 14 15 16 17 Tỷ lệ NL : dung môi 40 60 40 60 40 60 40 60 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Nhiệt độ (oC) 80 80 100 100 90 90 90 90 80 100 80 100 90 90 90 90 90 Thời gian (phút) 60 60 60 60 45 45 75 75 45 45 75 75 60 60 60 60 60 40 Hàm lƣợng polysaccharide (mg/g) 1,26 2,35 7,54 5,96 2,23 3,69 7,56 2,56 5,68 3,64 2,38 11,87 6,96 5,78 6,34 7,21 6,49 Từ bảng 3.9 cho thấy yếu tố: dung môi, nhiệt độ, thời gian, ảnh hƣởng sâu sắc tới hàm lƣợng polysaccharide Hàm lƣợng polysaccharide nằm khoảng 1,26 - 11,87 mg/g Giá trị cực đại, cực tiểu tỉ lệ NL/dung mơi thí nghiệm 7, thời gian thí nghiệm 3, nhiệt độ thí nghiệm cho hàm lƣợng polysaccharide có chênh lệch lớn 3.4.1 Phân tích phương sai Bảng 3.10 Kết phân tích phƣơng sai mơ hình tối ƣu phần mềm Design-Expert 7.1.5 (Bảng anova) * Sum of Squares: Tổng phương sai; df: bậc tự do; Mean Square: trung bình bình phương sai khác; chuẩn F: chuẩn Fisher; Residual: phần dư; “Lack of Fit”: chuẩn đánh giá độ khơng tương thích mơ hình với thực nghiệm Kết phân tích pƣơng sai mơ hình tối ƣu phần mềm DesignExpert 7.1.5 (State-Ease, Inc., Minneapolis, Hoa Kỳ) đƣợc trình bày bảng 3.10 (bảng anova) cho thấy yếu tố tỷ lệ nguyên liệu rắn: dung môi, nhiệt độ thời gian ảnh hƣởng mạnh đến trình chiết xuất polysaccharide Nấm lim xanh Giá trị F mô hình 27,94 với p =0,0001 ( p< 0,05) cho thấy dạng mơ hình đƣợc lựa chọn Giá trị p 41 “Lack of Fit” 0,2410 (p>0,05) cho thấy mơ hình tƣơng thích với thực nghiệm 3.4.2 Phương trình hồi quy Phƣơng trình hồi quy biểu hàm lƣợng polysaccharide mô tả ảnh hƣởng yếu tố độc lập mối tƣơng tác chúng đƣợc biểu diễn nhƣ sau: Hàm lƣợng polysaccharide = -6.56 -0.5*X1 + 2.17*X2 + 1.14*X3 -0.67*X1*X2 1.62*X1*X3 + 2.88*X2*X3 - 2.08X12 - 0.2X22 + 0.47X32 Trong đó: X1, X2, X3 lần lƣợt Tỷ lệ NL/dung môi, nhiệt độ thời gian chiết 3.4.3 Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất Sử dụng phƣơng pháp hàm kỳ vọng để tối ƣu hóa hàm lƣợng polysaccharide thu đƣợc sau trình chiết xuất phần mềm Design-Expert Kết tìm đƣợc phƣơng án tốt để cực đại hàm mục tiêu dự đốn là: tỷ lệ ngun liệu: dung mơi = 42,62, nhiệt độ 99,85oC, thời gian chiết 74,57 phút Khi đó, hàm lƣợng polysaccharide chiết xuất đƣợc điều kiện theo tính tốn 12,8003 mg/g (hình 3.8) Hình 3.9 Hàm mục tiêu điều kiện tối ƣu để chiết xuất polysaccharide Xem xét ảnh hƣởng yếu tố (khi yếu tố khác đƣợc giữ mức trung bình) đến hàm lƣợng polysaccharide cho thấy hàm lƣợng polysaccharide 42 đạt giá trị cực đại tỷ lệ NL/ dung môi 35,35; nhiệt độ 91,570C thời gian 57,49 phút  Dạng biểu diễn 3D Hình 3.10 Bề mặt đáp ứng hàm lƣợng polysaccharide Hàm lƣợng polysaccharide thu đƣợc theo phƣơng án kết hợp yếu tố: tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1: 43, nhiệt độ 100oC thời gian 75 phút đạt 12,80 mg/g cải thiện đƣợc hàm lƣợng polysaccharide so với trƣớc tối ƣu (11,78 mg/g) 43 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết thu đƣợc, ta rút số kết luận sau: - Phƣơng pháp chiết xuất thích hợp thu hàm lƣợng polysaccharide cao hầm, theo tỉ lệ nguyên liệu : dung môi 1: 50, 100 oC thời gian 75 phút Hàm lƣợng polysaccharide thu đƣợc 11,78 ± 0,06 mg/g - Phƣơng pháp chiết xuất thích hợp thu hàm lƣợng tannin cao hầm, với tỉ lệ nƣớc : ethanol 1:4, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi 2: 50 60oC thời gian 75 phút Hàm lƣợng tannin thu đƣợc 7,02±0,08 mg/g - Tối ƣu hóa điều kiện chiết xuất polysaccharide Nấm lim xanh: tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1: 43, nhiệt độ 100oC thời gian 75 phút đạt 12,80 mg/g 4.2 Kiến nghị Do hạn chế thời gian nghiên cứu nên thí nghiệm xác định thành phần dịch chiết chƣa đƣợc triển khai đề tài Vì tơi đƣa kiến nghị sau: Nghiên cứu phân tích thành phần hàm lƣợng cụ thể polysaccharide tannin phƣơng pháp sắc kí phù hợp Nghiên cứu sâu hoạt tính polysaccharide tannin Nấm lim xanh Nghiên cứu ảnh hƣởng dung môi tách chiết khác nhƣ aceton, nƣớc cất, methanol tách chiết tannin HCl loãng, ethanol tách chiết polysaccharide 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành (2005) Giáo trình nấm học, Viện cơng nghệ sinh học – Đại học Cần Thơ Lê Đăng Khoa (2013) Định lƣợng polysaccharide nấm linh chi (Ganoderma lucidum) phƣơng pháp UV- VIS Tạp chí khoa học Cần Thơ Trịnh Tam Kiệt tác giả (2001), Danh mục loài thực vật Việt Nam, tập 1, phần Nấm, Nhà xuất Nông nghiệp – Hà Nội Nguyễn Thị Ngân (2017) Nghiên cứu xây dựng số tiêu kiểm nghiệm nấm linh chi Luận văn Thạc sĩ trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Phạm Bảo Trƣơng cộng (2015) Tối ƣu hóa quy trình tách chiết polysaccharide tannin nâm linh chi đỏ Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ Lê Ngọc Tú (2003) Hóa học thực phẩm Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH Askin R, Sasaki M, Goto M (2007) Sub- and superitical fluid extraction of bioactive compound from Ganoderma lucidum Proceeding of International of Symposium on Ecotobia Science, 07, pp 575-577 Atanassova M, Christova V, (2009) Determination of tannin content by titrimetric method for comparision of different plant species Journal of the University of Chemical Technology and Metallurgy, 44, pp 413-415 Bao XF, Wang XS, Dong Q, Fang JN, Li XY (2002) Structural features of immunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum Phytochemistry 59, pp 175–181 10 Cao QZ, Lin ZB (2004) Antitumor and anti-angiogenic activity of Ganoderma lucidum polysaccharides peptide Acta Pharmacology Sinnica 25 (6), pp 833 – 838 11.Chan WK, Law HK, Lin ZB, Lau YL and Chan GC (2007) Response of human dendritic cells to different immunomodulatory polysaccharides derived from mushroom and barley International Immunology, 19, pp.891899 12.Chen HS, Tsai YF, Lin S, Lin CC, Khoo KH, Lin CH, Wong CH (2004) Studies on the immuno-modulating and anti-tumor activities of Ganoderma lucidum (Reishi) polysaccharides Bioorganic & Medicinal Chemistry 12 (21), pp 5595 – 5601 13.Kammatsuse K, Kajiware N, Hayashi K (1985) Studies on Ganoderma lucidum: Letficacy against hypertension and side effects, Yakugaku Zasshi; pp 105-531 14.Matsunaga Y, Wahyudiono, Machmudah S, Askin R, Quitain AT, Sasaki M and Goto M (2013) Hydrothermal extraction and micronization of polysaccharides from ganoderma lucidum in a one step process Bioresources, (01), pp 461-471 15.Sakai T and Chihara G (1995) Health foods and medicinal usages of mushrooms Food Reviews International, 11, pp 69-81 16.Sattler C, Labbe N, Harper D, Elder T, Rials T (2008) Effects of hot water extraction on physical and chemical characteristics of oriented strand board (OSB) wood flakes Clean Soil Air Water, 36, pp 674- 681 17.Scheller HV, Ulvskov P (2010) Hemicelluloses Annual Review of Plant Biology, 61, pp 263-289 18 Song T, Pranovich A, Holmbom B, (2012) Hot-water extraction of ground spruce wood of different particle size Bioresources, 7, pp 4214- 4225 19.Sung SK, Kim MJ, Lee DH, Choung SY, Kim BK, Kim HW (2005) Glucan of Ganoderma lucidum (W.Curt.:Fr.) Lloyd (Aphyllophoromycetideae) cooperatively induces tumor necrosis factor - and interleukin-6 with lipopolysaccharide by binding to dectin-1 International Journal of Medicinal Mushrooms 7, 193–200 20 Sye WT, (1991) Improverment method of extraction and high performance liquid chromatographic separation of ganoderic acid from Ganoderma Lucidum Journal of the Chinese Chemical Society, 38, pp 179 21.Valentin Popa (2012) Polysaccharides in medicinal and pharmaceutical applications, Environmental Engineering and Management Journal, 11(12), pp 2333-2334 22.Véronique Coma (2013) Polysaccharide-based biomaterials with antimicrobial and antioxidant properties, Polimeros, 23(3), pp 287-297 23.Yu Y, Lou X, Wu H, (2008) Some recent advances in hydrolysis of biomass in hot compressed water and its comparisons with other hydrolysis methods Energy and Fuels, 22, pp 46-60 24.Zhong L, Jiang D, Wang Q (1999) Effects of Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr) Karst compound on the proliferation and differentiation of K562 leukemic cells, 24(6), pp 521-524 ... Hiện Việt Nam, việc nghiên cứu tách chiết polysaccharide tannin Nấm lim xanh chƣa có nhiều, nhiên có số nghiên cứu tách chiết polysaccharide tannin Nấm linh chi đỏ, trà hoa vàng, Nấm hƣơng Việc trích... sản phẩm chứa polysaccharide đƣợc ứng dụng thực phẩm 1.2.3 Polysaccharide Nấm Lim xanh Nghiên cứu dịch chiết polysaccharide từ Nấm lim xanh với liều dùng 12 mg/ml cho thấy Nấm lim xanh có tác dụng... nhận polysaccharide Nấm lim xanh - Xác định đƣợc điều kiện thích hợp thu nhận đƣợc tannin Nấm lim xanh - Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất polysaccharide từ Nấm lim xanh 2.3 Vật liệu phạm vi nghiên