Nghiên cứu khả năng đối kháng của nấm trichoderma đối với chủng phytophthora gây bệnh tiêu chết nhanh phân lập tại bình dương

MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Hồ tiêu mặt hàng xuất đầy tiềm Việt Nam giới Theo Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam từ năm 2001, nước ta trở thành nước đứng đầu xuất hồ tiêu với sản lượng bình qn ước đạt 95.000 năm Tính đến năm 2013, diện tích hồ tiêu nước đạt 60.000 ha, vượt 17% so với quy hoạch đến năm 2020 (50.000 ha) Bộ NN&PTNT Tại Bình Dương, diện tích hồ tiêu tháng 10 năm 2013 đạt 320 [15] Thiên nhiên ưu đãi cho hồ tiêu Việt Nam đất đai, khí hậu, độ ẩm cao, lượng mưa nhiều Tuy nhiên, mưa nhiều, ẩm độ cao điều kiện thuận lợi cho số loại dịch hại phát triển gây hại như: bệnh héo chết nhanh, vàng chết chậm, tuyến trùng… Gây thiệt hại nặng cho hồ tiêu phải kể đến bệnh chết nhanh nấm Phytophthora sp gây Bệnh xuất tất phận tất giai đoạn sinh trưởng tiêu Nấm bệnh gây hại lá, chùm quả, thân, rễ, phổ biến phần thân nằm đất nơi tiếp giáp với mặt đất Tiêu bị bệnh có triệu chứng bị héo xanh Sau úa vàng, héo rũ, chết khơ với dây Thời gian từ bắt đầu héo đến dây tiêu bị chết nhanh, thường vòng - 10 ngày [2] Nấm bệnh Phytophthora thường xuất mùa mưa, nhiệt độ thấp, độ ẩm cao Nấm chủ yếu tồn đất lây lan qua nước mưa Hiện nay, việc phòng trừ bệnh tiêu chết nhanh chủ yếu biện pháp canh tác sử dụng thuốc hóa học Bên cạnh đó, việc sử dụng nấm đối kháng Trichoderma biện pháp an toàn hiệu thu hút nhiều quan tâm năm gần Trichoderma loại nấm phổ biến đất vật liệu hữu Chúng sống hoại sinh đồng thời kí sinh lồi nấm gây bệnh cho trồng Nhiều nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma bảo vệ trồng chống loại nấm gây bệnh như: Rhizoctonia, Sclerotinium, Phytophthora, Fusarium….Ngoài ra, Trichoderma cịn có khả thúc đẩy tăng trưởng trồng thơng qua việc kích thích phát triển hệ rễ có hiệu chống lại bệnh lồi nấm kích thích rễ tổng hợp chất đề kháng để chống lại tác nhân vi sinh vật xâm nhập, chất đề kháng từ rễ di chuyển đến phận phía [17] Trichoderma cịn có khả phát triển tốt loại phế phụ liệu rơm rạ, bã mía, xác bã thực vật….Điều thuận lợi việc tạo chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh bảo vệ trồng Xuất phất từ thực tiễn trên, chọn đề tài “Nghiên cứu khả đối kháng nấm Trichoderma với chủng Phytophthora gây bệnh tiêu chết nhanh phân lập Bình Dƣơng” Mục tiêu đề tài nhằm góp phần tìm giải pháp sinh học để hạn chế ảnh hưởng nấm bệnh nâng cao sản lượng, chất lượng hồ tiêu địa bàn Tỉnh Mục tiêu đề tài Phân lập số chủng Phytophthora gây bệnh tiêu chết nhanh Bình Dương Khảo sát khả đối kháng nấm Trichoderma với chủng Phytophthora gây bệnh tiêu chết nhanh tỉnh Bình Dương Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu Các chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh tiêu chết nhanh Bình Dương 3.2 Phạm vi nghiên cứu hảo sát khả đối kháng nấm Trichoderma PTN trường ĐH Thủ Dầu Một cung cấp với nấm bệnh Phytophthora sp phân lập được, qua tuyển chọn chủng nấm Trichoderma có khả đối kháng mạnh Nội dung nghiên cứu Phân lập nấm bệnh Phytophthora gây bệnh tiêu chết nhanh Nghiên cứu khả đối kháng Trichoderma với nấm Phytophthora Bố cục đề tài Bố cục đề tài gồm phần sau: Mở đầu ( trang) Phần gồm nội dung: lý chọn đề tài, mục tiêu đề tài, đối tượng phạm vi nghiên cứu bố cục đề tài Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu (13 trang) Trong chương này, chúng tơi trình bày sở lý thuyết tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài Gồm nội dung: giới thiệu tiêu, giới thiệu nấm bệnh Phytophthora giới thiệu Trichoderma Những nghiên cứu khả kiểm soát nấm bệnh thực vật Trichoderma Chƣơng 2: Phƣơng pháp nghiên cứu (4 trang) Tơi trình bày hệ thống phương pháp nghiên cứu bao gồm: vật liệu dụng cụ thí nghiệm, môi trường nghiên cứu phương pháp nghiên cứu Chƣơng 3: Kết thí nghiệm thảo luận (9 trang) Trong chương này, kết nghiên cứu trình bày thảo luận Chúng tơi tập trung vào nội dung sau: + Phân lập chủng nấm Phytophthora địa bàn tỉnh Bình Dương + hảo sát khả đối kháng Trichoderma sp PTN trường ĐH Thủ Dầu Một cung cấp với nấm bệnh phân lập Kết luận khuyến nghị (1 trang) Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tiêu Những năm gần đây, người ta biết đến Việt Nam nhà sản xuất xuất hồ tiêu số giới Được khai sinh từ kỷ XVII loại công nghiệp lâu năm nông nghiệp Việt Nam, Hồ tiêu vươn thành người khổng lồ nông nghiệp Việt Nam mà giới [7] Theo báo cáo ngành NN&PTNT, năm 2013, xuất hồ tiêu nước ước đạt 134.000 với kim ngạch đạt 899 triệu USD, tăng gần 15% lượng tăng 13% kim ngạch so với năm 2012 Xuất hồ tiêu Việt Nam giữ vững vị trí số sản lượng số lượng xuất giới, có vai trị quan trọng việc điều tiết lưu thơng, bình ổn giá thị trường Năm 2013, diện tích hồ tiêu Bình Dương khoảng 320 ha, phân bố tập trung huyện Phú Giáo với 295 ha, Dầu Tiếng 23 ha, Bến Cát Thị xã Thủ Dầu Một với 2,8 Sản lượng ước đạt 803,84 năm 2013 Đứng sau cau su điều, hồ tiêu công nghiệp lâu năm mang lại nhiều giá trị mặt kinh tế cho người dân năm qua Nhiều hộ dân thoát nghèo, vươn lên làm giàu từ hồ tiêu Trong đó, có nhiều hộ dân có mức thu từ hàng chục triệu đồng, đến hàng trăm triệu đồng năm từ hồ tiêu sau trừ chi phí sản xuất Tuy nhiên, năm gần sản lượng hồ tiêu giảm mạnh tình hình dịch bệnh tiêu phát triển nhanh gây nhiều thiệt hại ảnh hưởng đến đời sống người dân [5] 1.1.1 Đặc điểm chung Cây Tiêu có tên khoa học Piper nigrum L., có nguồn gốc miền Tây nam Ấn Độ, loại đặc trưng miền nhiệt đới Ở Việt Nam, Hồ tiêu trồng lâu đời vùng Quảng Trị, Hà Tiên sau trồng phổ biến vùng Đông Nam Bộ, Tây Nguyên [30] Hồ tiêu loại trồng yêu cầu cao điều kiện sinh thái cho sinh trưởng phát triển Nhiệt độ thích hợp cho tiêu từ 20-25oC Nhiệt độ cao 40oC thấp 10oC ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển tiêu Hồ tiêu yêu cầu lượng mưa cao từ 2.000-3.000 mm/năm, độ ẩm khơng khí từ 7590% Tiêu loại ưa ánh sáng, nhiên giai đoạn cần che rợp cho tiêu Cây tiêu trồng nhiều loại đất khác đất phát triển đá basalt, đất phù sa, đất pha cát, đất cát xám… 1.1.2 Giá trị tiêu Tiêu loại trồng sống lâu năm có giá trị kinh tế cao Ngồi cơng dụng làm gia vị, sử dụng y dược tiêu cịn biết đến cơng nghiệp hương liệu làm chất trừ côn trùng [9] Chất gia vị: Hạt tiêu có vị nóng, cay, có mùi thơm hấp dẫn nên thích hợp cho việc chế biến ăn Vì mà tiêu trở thành gia vị dùng phổ biến giới Trong y dược: Do có diện chất piperin, tinh dầu nhựa có mùi thơm, cay, nóng đặc biệt, tiêu có tác dụng kích thích tiêu hóa, làm cho ăn ngon miệng Ngồi ra, tinh dầu tiêu có mùi thơm đặc biệt cịn sử dụng cơng nghiệp hương liệu hóa dược [9] 1.1.3 Bệnh tiêu chết nhanh Một dịch bệnh gây hại ảnh hưởng lớn đến suất chất lượng hạt tiêu xác định bệnh thối gốc rễ Phytophthora Bệnh thối gốc rễ Phytophthora hồ tiêu (còn gọi bệnh chết nhanh hay bệnh tiêu sầu) dịch bệnh hại nguy hiểm, thường làm chết dây tiêu hàng loạt, gây trắng làm giảm suất trồng (Nguyễn Đăng Long 1992, Truong et al 2008) [11,33] Bệnh chết nhanh nấm Phytophthora sp gây thường xuất mùa mưa, đặc biệt tháng mưa nhiều tập trung vườn khơng nước tốt Những năm mưa nhiều kéo dài bệnh thường gây hại nặng lây lan nhanh, đơi thành dịch Những năm có hạn hán kéo dài, khả sinh trưởng sức đề kháng nên dễ bị nấm công mùa mưa Hồ tiêu bị bệnh thường có triệu chứng: thối thân ngầm (nếu nấm bệnh công vào phần thân ngầm phần cổ rễ làm tiêu chết đột ngột), thối rễ (ban đầu nấm công vào rễ nhỏ sau lan dần sang hệ thống rễ lan vào cổ rễ gây thối hệ thống rễ) Nếu bệnh công vào phận mặt đất thân, cành, làm phận thối đen gây tượng gié hoa bị rụng, gié bị đen Bệnh diễn biến bệnh đồng ruộng nhanh, nên bệnh phòng chủ yếu [2] Hình 1.1 Vƣờn tiêu bị bệnh chết nhanh nấm Phytophthora sp gây Để phòng trừ bệnh cần phải sử dụng biện pháp phòng trừ tổng hợp, đặc biệt trọng biện pháp canh tác sinh học Cần thực biện pháp canh tác chọn đất trồng tiêu có tầng canh tác dày, nước tốt, có mực nước ngầm thấp, khơng lấy giống tiêu bị nhiễm bệnh chết nhanh Trong q trình chăm sóc vườn tiêu tránh gây vết thương cho thân ngầm rễ tiêu hi phát bệnh phải kiên đào bỏ, thu dọn tàn dư bệnh đưa khỏi vườn đốt để loại trừ nguồn bệnh Sử dụng chế phẩm sinh học như: Trichoderma để hạn chế phát triển nấm Phytophthora Phòng trừ biện pháp hóa học: sử dụng loại thuốc sau Aliette 80 WP, Ridomil MZ 72 WP, Ridomil Gold 68 WP, Mexyl MZ 72 WP… [2] 1.2 Giới thiệu nấm bệnh Phytophthora 1.2.1 Đặc điểm chung Tên giống nấm Phytophthora có nguồn gốc từ Hi lạp (phyto có nghĩa thực vật; phthora có nghĩa vật phá hoại) Phytophthora nhóm nấm thuộc lớp Oomycetes, Peronosporales, họ Pythoaceae, giống Phytophthora [12] Đặc điểm sợi nấm Phytophthora khơng màu, khơng vách ngăn, đơn bào, kích thước khơng đều, túi bào tử có hình trứng hình chanh, đầu có núm khơng có núm, khơng màu, suốt Bào tử hình cầu hình thận có hai lơng roi, di chuyển nhanh nước, nhiệt độ thích hợp để nấm sinh trưởng phát triển từ 25-30oC, pH 6-7 [21] Hình 1.2 Phytophthora reeser sau 14 ngày nuôi cấy môi trƣờng V8 agar (trái) PGA (phải) (Nguồn Forest Phytophthoras of the world) 1.2.2 Đặc điểm sinh trƣởng Khi Phytophthora ni cấy mơi trường thích hợp, khuẩn ty (mycelium) phát triển nhanh Một số lồi Phytophthora tạo bào tử môi trường agar, nhiều lồi khác cần ni cấy nước, dung dịch muối khống dịch trích từ đất pha loãng trước chúng tạo bào tử Điều quan trọng tạo bào tử Phytophthora phụ thuộc vào điều kiện ánh sáng Dưới điều kiện ẩm ướt chúng tạo bào tử vơ tính gọi túi bào tử (sporangia) túi bào tử động (zoosparangia) Túi bào tử nảy mầm môi trường nước nhiệt độ môi trường giảm [12] Những bào tử động sau phóng thích bơi lội hàng liền cuối ngưng bơi lội để cuộn tròn hay kết kén Sau thời gian chúng hình thành vách tế bào Bào tử có vách dày (chlamydospore) dạng hình cầu hay hình trứng, chúng đốt (nằm sợi nấm) tận (cuối sợi nấm) cấu trúc nghỉ vơ tính [12] A B Hình 1.3 Bào tử vách dày (A) bào tử nang hình lê (B) nấm Phytophthora sp 1.2.3 Khả gây bệnh Phytophthora trồng Các lồi Phytophthora cơng phận khỏe mạnh bao gồm rễ Do đó, mầm bệnh diện khơng có dấu hiệu rõ ràng Những thông tin bệnh Phytophthora số trồng Việt Nam theo ghi nhận Thanh, Ngô Andre’ Drenth năm 2004 [12] cho thấy nấm Phytophthora có khả gây hại nhiều loại trồng khác bệnh tàn lụi cà chua, khoai tây, khoai sọ; bệnh thối nõn dứa; thối rễ, loét thân, thối trái rụng sầu riêng….Nấm thường xuất gây bệnh vào thời điểm thuận lợi độ ẩm lượng mưa cao, nhiệt độ ổn định phát triển thành dịch Cách thức xâm nhiễm gây bệnh tùy thuộc chủng nấm Phytophthora Tuy nhiên, trình xâm nhiễm vào phận khác thực bọc bào tử động du động bào tử Mưa tạt phân tán bào tử lên cây, q trình xâm nhiễm thân, (tùy thuộc vào loài Phytophthora ký chủ) Phytophthora tác nhân gây số dịch bệnh nghiêm trọng giới điển bệnh mốc sương mai (hay tàn lụi muộn) khoai tây gây nạn đói lớn Châu Âu năm 1840, nguyên nhân nấm P infestans (Bourke, 1964) Bệnh Phytophthora nghiên cứu sâu Châu Âu Tuy nhiên, bệnh phổ biến vùng nhiệt đới ẩm gây nhiều nguy hiểm làm mùa nghiêm trọng nhiều loại ăn [19] Chi Phytophthora gây thiệt hại kinh tế nhiều loài trồng Việt Nam, làm giảm suất trầm trọng làm thu nhập nơng dân có ý nghĩa Ở vùng nhiệt đới Việt Nam Bệnh thối nõn dứa P cinnamomi P nicotianae gây làm sản lượng đến 60% Trên ăn có múi (bưởi), P citrophthora cơng thân gây bệnh chảy nhựa thối làm suất đến 30% Bệnh chết nhanh hại tiêu Phytophthora làm suất 70%[1] Hình 1.4 Chu trình xâm nhiễm Phytophthora sp ( Nguồn MetaPathogen.com/Phytophthora) 1.3 Giới thiệu Trichoderma 1.3.1 Đặc điểm chung Trichoderma thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes [20] Năm 1801, Persoon ex Gray xác định Trichoderma thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, Hypocreales, họ Hypocreaceae, giống Trichoderma (trích dẫn Clipson, N cs, 2001) [27] Trichoderma sợi nấm có dạng hình ống phấn phân nhánh, bên chứa chất nguyên sinh lưu động Khuẩn ty vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, cuối nhóm phát triển thành khối trịn mang bào tử trần khơng có vách ngăn, khơng màu, liên kết với thành chùm nhỏ đầu cành nhờ chất nhày Bào tử Trichoderma có màu xanh xanh xám, bào tử hình cầu, hình elip hình thn [6] Nhờ khả tạo thành bào tử chống chịu (chhlamydospores) mà Trichoderma sp tồn 110 – 130 ngày dù không cung cấp chất dinh dưỡng Chlamydospores cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả sống sót Trichoderma mơi trường khơng cung cấp chất dinh dưỡng nên chlamydospores dùng để tạo chế phẩm phịng trừ sinh học Hình 1.5 Khuẩn lạc cấu trúc sinh bào tử nấm Trichoderma sp môi trƣờng PGA 10 Chƣơng III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập nấm bệnh Phytophthora gây bệnh tiêu chết nhanh Sau tiến hành phân lập nấm bệnh từ mẫu lấy từ đất, rễ, thân tiêu bệnh xã An Bình huyện Phú Giáo, hai loại môi trường WA PGA Mỗi loại môi trường, tiến hành nghiệm thức, sau tiến hành quan sát sau 24 Nếu có khoảng mẫu nấm phát triển tương đồng tiến hành cấy chuyền sang hai loại môi trường PGA CA làm giữ giống Từ mẫu đất, rễ, thân tiêu bệnh thu nhận sau lần phân lập, thu chủng Phytophthora 3.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc Để tiến hành nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc Phytophthora sp phân lập được, tiến hành nuôi cấy chủng hai loại mơi trường PGA CA nhiệt độ phịng (30 - 35oC) Sau ngày, môi trường PGA, khuẩn lạc màu trắng, dạng bông, viền không đều, áp sát bề mặt thạch, không làm biến đổi bề mặt thạch Trên mơi trường CA, khuẩn lạc Phytophthora sp có màu trắng, hình tia, Thể sợi dạng bơng gịn, áp sát bề mặt thạch, viền đều, không làm biến đổi bề mặt thạch B A Hình 3.1 Khuẩn lạc Phytophthora sp môi trƣờng PGA (A) môi trƣờng CA (B) 22 3.1.2 Đặc điểm hiển vi Quan sát kính hiển vi, chủng Phytophthora sp phân lập có đặc điểm sau: Thể sợi thể sợi hình ống khơng vách ngăn, kích thước nhỏ, phân nhánh thưa theo hai cách ngang xiêng Phytophthora sp có hai dạng bào tử: bào tử nang có núm túi bào tử hậu (chlamydospore) hình cầu Bào tử nang có dạng hình trứng, hình lê… nằm cuống nhỏ dài, có núm hai núm Cuống sinh bào tử phân nhánh, hình thành 1, bào tử nang Bào tử hậu hình cầu, có vách dày, mọc đầu sợi nấm Bên túi bào tử có chứa bào tử hình hạt đậu, có roi, di chuyển nhanh nước A B Hình 3.2 Bào tử hậu nấm Phytophthora sp môi trƣờng PGA (A) bào tử nang có núm mơi trƣờng CA (B) 23 3.1.3 Đặc điểm sinh trƣởng Để tìm hiểu sâu khả sinh trưởng hình thành bào tử nấm Phythophthora sp làm sở cho việc đối kháng phòng trừ nấm bệnh, tiến hành khảo sát tốc độ phát triển khuẩn lạc hình thành bào tử nấm Phytophthora sp hai loại môi trường PGA CA Kết cho thấy nấm Phythophthora sp phát triển hai loại môi trường Tuy nhiên, tốc độ phát triển Phytophthora sp môi trường PGA mạnh mơi trường CA, bán kính vòng tăng trưởng đạt 1,5 1,3 cm sau ngày ni cấy (hình 3.1) 3.1.4 Khả hình thành bào tử Trên mơi trƣờng thạch đĩa Trong môi trường PGA CA, sau ngày nuôi cấy nhiệt độ phịng, nấm Phytophthora sp thường hình thành bào tử hậu (chlamydospore) hình cầu có vách dày đầu sợi nấm sợi, ngăn cách với sợi nấm vách ngăn Chúng không quan sát thấy tạo thành bào tử nang mơi trường PGA CA A B Hình 3.3 Bào tử hậu (chlamydospore) môi trƣờng PGA (A) môi trƣờng CA (B) 24 Trong môi trƣờng nƣớc Tôi tiến hành kích thích việc hình thành bào tử theo phương pháp nêu mục 2.4.3 Các nghiệm thức kích thích hình thành bào tử tiến hành khảo sát hai điều kiện ánh sáng tối, lặp lại thí nghiệm 10 lần Điều kiện khảo sát hình thành bào tử ngồi sáng với cường độ ánh sáng (4000-4500 Lux), nhiệt độ phòng (30-35oC) Kết hình thành bào tử nang thể bảng 3.1 Bảng 3.1: Thời gian hình thành bào tử chủng Phytophthora sp điều kiện khác Môi trƣờng nuôi cấy Thời gian xuất bào tử nang (giờ) Phytophthora sp Trong tối Ngoài sáng PGA 48 48 CA 24 48 Kết Bảng 3.1 cho thấy 100% nấm Phytophthora sp nghiệm thức hình thành bào tử nang môi trường nước hai điều kiện sáng tối khoảng 24 - 48 Trên môi trường nuôi cấy PGA, nấm Phytophthora sp hình thành bào tử chậm so với nuôi cấy môi trường CA tối với thời gian 48 24 Sự hình thành bào tử nang Phytophthora sp từ thí nghiệm tối môi trường CA cho kết hình thành bào tử nhanh so với ngồi sáng Tuy nhiên, nghiệm thức khảo sát điều kiện ngồi sáng cho kết thời gian hình thành bào tử hai môi trường PGA CA sau 48 với 100% mẫu thí nghiệm Trên mơi trường PGA, khuẩn lạc nấm Phytophthora sp phát triển nhanh hình thành bào tử nang có núm nước sau 48 Trên môi trường CA, khuẩn lạc nấm Phytophthora sp phát triển chậm so với môi trường PGA hình 25 thành bào tử nang môi trường nước sau 24 giờ, nhanh so với nuôi cấy môi trường PGA Như tùy thuộc vào loại môi trường khác điều kiện ni cấy, nấm Phytophthora sp phát triển hình thành bào tử khác Trên thực tế, nấm bệnh Phytophthora sp thường xuất mùa mưa, nhiệt độ dao động ngày đêm lớn, độ ẩm cao cường độ chiếu sáng yếu Kết thí nghiệm cho thấy, thời gian hình thành bào tử nang điều kiện nghiên cứu phù hợp với thời điểm bắt đầu xuất bệnh thực tế Góp phần dự đốn thời điểm phát triển phịng trừ dịch bệnh năm B A Hình 3.4 Bào tử nang núm môi trƣờng PGA (A) bào tử nang hai núm (B) môi trƣờng CA 3.2 Khả đối kháng Trichoderma sp với Phytophthora sp Cấy khối thạch agar có chứa nấm bệnh lên đĩa môi trường trung gian nuôi cấy ngày Sau đó, tơi tiến hành cấy đối kháng nấm Trichoderma sp theo phương pháp 2.4.4 Sau bố trí thí nghiệm chúng tơi tiến hành quan sát ghi nhận kết bán kính khuẩn lạc nấm Phytophthora sp nghiệm thức tính hiệu suất đối kháng nấm Trichoderma sp thời điểm ngày, ngày ngày 26 Bảng 3.2 Hiệu đối kháng chủng Trichoderma sp với nấm bệnh Phytophthora sp sau ngày môi trƣờng PGA Chủng Trichoderma sp đối kháng Hiệu đối kháng Phytophthora sp (%) ngày T2.1 22,69±2,52 95,75±1,46 100±0 T2.2 28,2±4,70 90,66±1,46 100±0 T3.2 19,99±3,07 100±0 100±0 T4 66,15±5,32 100±0 100±0 T5.1 100±0 100±0 100±0 T5.2 41,53±5,32 100±0 100± T6.1 22,04±4,69 55,89±1,47 100±0 T7.1 21,53±2,17 100±0 100±0 T8.1 22,04±1,77 55,89±1,47 100±0 T8.2 29,22±5,32 100±0 100±0 T9 20±0,00 93,21±1,47 100±0 T10 54,86±1,77 100±0 100±0 T11 64,1±3,55 100±0 100±0 T12 14,86±3,55 55,25±2,57 100±0 27 Hình 3.5 Biểu đồ hiệu đối kháng chủng Trichoderma sp với chủng Phytophthora sp môi trƣờng PGA A D B C E F Hình 3.6 Khả đối kháng nấm Phytophthora sp chủng Trichoderma sp sau ngày (A) Chủng Trichoderma T2.1; (B) Chủng Trichoderma T2.2; (C) Chủng Trichoderma T3.2; (D) Chủng Trichoderma T7.1; (E) Chủng Trichoderma T8.1; (F) Chủng Trichoderma T9 28 Kết khảo sát khả đối kháng nấm Trichoderma sp với nấm bệnh Phytophthora sp tăng dần theo thời gian Sau ngày, hầu hết chủng Trichoderma có hiệu suất đối kháng yếu với hiệu suất trung bình từ 20-40% Tuy nhiên chủng T4; T10 T11 đạt hiệu đối kháng cao với hiệu suất 66,15%; 54,86% 64,1% Đặc biệt chủng T5.1 có hiệu đạt 100% Khuẩn lạc nấm Trichoderma phát triển nhanh lên phía tơ nấm bệnh, làm tơ nấm bệnh xẹp xuống Một số chủng tiết hoạt chất làm biến đổi mặt thạch, khuẩn lạc phát triển đến đâu làm biến đổi mặt thạch đến Tại thời điểm ngày hiệu ức chế nấm bệnh chủng đạt 50%, có 11 chủng đạt hiệu đối kháng cao với hiệu suất 100% chủng T3.2; T4; T5.2; T7.1; T8.2 Hiệu suất đối kháng đạt 95,75% chủng T2.1; 93,21% chủng T9 90,66% chủng T2.2 Bào tử chủng Trichoderma phát triển bao phủ lên bề mặt nấm bệnh Ở số chủng Trichoderma tiết hoạt chất biến đổi toàn mặt thạch Đến thời điểm ngày, chủng Trichoderma lại đối kháng 100% Dựa kết khảo sát cho thấy, tất chủng nấm Trichoderma dùng để khảo sát khả đối kháng với nấm Phytophthora sp có khả đối kháng với nấm Phytophthora sp thời điểm ngày Trong đó, có 11 chủng Trichoderma đối kháng sau ngày Kết phù hợp với kết nghiên cứu Nguyễn Thị Lan Hương, (2011) nghiên cứu khả đối kháng chủng nấm Trichoderma sp với nấm Phytophthora sp hầu hết chủng Trichoderma sp nghiên cứu đối kháng tốt với nấm bệnh sau ngày Qua khảo sát, tuyển chọn bốn chủng nấm T3.2; T5.1; T5.2; T8.2 có khả đối kháng tốt với nấm bệnh, có thời gian đối kháng hình thành bào tử nhanh để tiến hành thí nghiệm 29 3.3 Khả ức chế Trichoderma sp hình thành bào tử Phytophthora sp Tôi tiến hành cấy đối kháng chủng T3.2; T5.1; T5.2 T8.2 môi trường PGA theo phương pháp cấy đối kháng nêu mục 2.4.3 Sau ngày đối kháng, tiến hành cắt miếng agar kích thước x cm từ đĩa cấy đối kháng chủng T3.2; T5.1; T5.2 T8.2 vào đĩa petri thực theo phương pháp 2.4.3 Hình 3.7 Hiệu ức chế Trichoderma sp hình thành bào tử Phytophthora sp môi trƣờng nƣớc sau ngày điều kiện không chiếu sáng Quan sát hình 3.7, nấm Trichoderma hình thành bào tử phía mặt thạch bề mặt nước điều kiện sáng tối Sau ngày, nấm Phytophthora hình thành bào tử hậu nhiên khơng diện bào tử nang Thí nghiệm cho thấy, nấm Phytophthora sp khơng hình thành bào tử nang mơi trường nước khơng có mặt nấm Trichoderma nêu mục 3.1.4 sau ngày điều kiện sáng tối Điều cho thấy, nấm Trichoderma sp ức chế Phytophthora sp hình thành bào tử nang mà chủ yếu tồn dạng bào tử hậu trì 30 Trong thực tế, sử dụng nấm Trichoderma bổ sung vào đất trồng tiêu trước thời điểm phát sinh dịch bệnh sau dịch bệnh phát triển nhằm ức chế hình thành bào tử nang gây bệnh ngăn ngừa bệnh lây lan 31 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Kết luận Từ mẫu bệnh tiêu chết nhanh, phân lập chủng nấm Phytophthora sp với đặc điểm sau: - Chủng có khuẩn lạc màu trắng, dạng bơng xốp, tốc độ phát triển hệ sợi môi trường PGA nhanh môi trường CA - Trên môi trường thạch, chủng Phytophthora sp nghiên cứu hình thành bào tử hậu, không quan sát thấy bào tử nang - Trong môi trường nước, chủng Phytophthora sp nghiên cứu hình thành bào tử nang sau 1-2 ngày Chủng phát triển mơi trường CA hình bào tử nhanh chủng phát triển môi trường PGA Trong điều kiện tối, nấm Phytopthora sp hình thành bào tử nhanh điều kiện sáng Khảo sát khả đối kháng 14 chủng nấm Trichoderma sp với nấm Phytophthora sp phân lập Trong đó, có 11 chủng Trichoderma sp đối kháng tốt với Phytophthora sp sau ngày Sau ngày, tất chủng Trichoderma sp đối kháng 100% Kết tuyển chọn chủng nấm Trichoderma sp đối kháng tốt với nấm bệnh Phytophthora sp gồm T3.2, T5.1, T5.2, T8.2 có khả ức chế hình thành bào tử nang môi trường nước Khuyến nghị Xác định khả gây bệnh tiêu chủng phân lập Xác định loài chủng Phytophthora sp phân lập kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu tạo chế phẩm từ chủng Trichoderma có hiệu đối kháng cao với để phòng bệnh tiêu chết nhanh tiêu 32 Tài liệu tham khảo Trong nƣớc Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn (2007), Quản lý bệnh Phytophthora hại trồng Việt Nam card, Báo cáo tổng kết dự án Bộ Nơng nghiệp phát triển nơng thơn (2013), Phịng trừ số sâu bệnh hại tiêu Trần Thị Lệ Hằng (2012), Nghiên cứu phân bố chủng vi nấm gây bệnh dứa (Ananas comosua) số khu vực bắc Quảng Nam, Luận văn Thạc sĩ, ĐH Đà Nẵng Nguyễn Bảo Hưng (2010), Tạo dòng biểu gen chitinase từ nấm Trichoderma, Luận văn thạc sĩ, Đại học Huế Nguyễn Thị Lan Hương (2011), Nghiên cứu tạo chế phẩm Trichoderma đối kháng với số chủng nấm bệnh Phytophthora gây bệnh tiêu, Khóa luận tốt nghiệp, ĐH Tơn Đức Thắng Nguyễn Thị Hương, Đồ án Trichoderma reesei: Tìm hiểu gen qui định enzyme cellulose số phương pháp nâng cao khả phân hủy cellulose, ĐH Bách khoa TP.HCM Giới thiệu Ngành Hồ tiêu Việt Nam (2011), Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam Lester W Burgess, Timothy E Knight, Len Tesoriero Phan Thuy Hien (2009), Cẩm nang chuẩn đoán bệnh Việt Nam, Trung tâm nghiên cứu nông nghệp quốc tế Ustralia Huỳnh Chấn Khôn (2006), Nghiên cứu đa dạng tiêu (Piper nigrum L.) thị xã Bà Rịa thuộc tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu kỹ thuật Rapd, Luận văn kỹ sư, Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh 10 Lê Duy Linh, Trần Thị Hường, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng - Thực tập vi sinh sở, NXB ĐH quốc gia TP Hồ Chí Minh 33 11 Nguyễn Đăng Long (1992), ết nghiên cứu bệnh hại tiêu 1987- 1991, Rhone-Poulenc, Tp Hồ Chí Minh 12 Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh (2006), Định danh nấm Phytophthora spp kỹ thuật sinh học phân tử, Luận văn kỹ sư, Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh 13 Dương Minh (2011), Sử dụng nấm đối kháng phịng trị bệnh thối nõn, thối rễ khóm, Đại học Cần Thơ 14 Nguyễn Đình Ngun (2009) Nghiên cứu khả kháng nấm tạo chế phẩm sinh học từ Trichoderma Khóa luận tốt nghiệp, ĐH Tơn Đức Thắng, TP Hồ Chí Minh 15 Nguyễn Ngọc Phúc, 2005 Bước đầu nghiên cứu diện nấm Trichoderma spp yếu tố đất, luận văn tốt nghiệp trường ĐH Nông Lâm 16 Huỳnh Văn Phục (2006), Khảo sát tính đối kháng nấm Trichoderma spp Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh lúa bắp, Khóa luận tốt nghiệp, ĐH Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh 17 Sở Nơng nghiệp phát triển nơng thơn tỉnh Bình Dương (2013), Báo cáo Ngành trồng trọt 18 Sở Nông nghiệp Phát triển nông thơn TP HCM (2005), Vai trị nấm đối kháng Trichoderma kiểm sốt vi sinh vật 19 Tơ Thị Nhã Trầm (2007), Khảo sát ảnh hưởng dịch nấm Phytophthora capsici tác nhân hóa lý đến sinh trưởng khả tạo đột biến tiêu (Piper nigrum L.) ni cấy mơ, Khóa luận tốt nghiệp, ĐH Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh 20 Nguyễn Cảnh Trí (2010), Khảo sát đặc điểm sinh học số chủng nấm sợi thuôc hai chi Trichoderma Fusarium từ rừng ngập mặn Cần 34 Giờ - TP Hồ Chí Minh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, ĐH Sư Phạm TP Hồ Chí Minh 21 Nguyễn Vĩnh Trường., Edward C.Y Liew Lester W Burgess (2006) Hình thức sinh sản hữu tính Phytophthora capsici Leonian, tác nhân gây bệnh chết héo hồ tiêu Tạp chí BVTV, số3: 14-18 22 Nguyễn Vĩnh Trường, Nguyễn Văn Được, Trần Hữu Hiếu Nguyễn Chí Thịnh (2012) Kết khảo nghiệm Potassium phosphonate phòng trừ bệnh chết nhanh hồ tiêu Quảng Trị Tạp chí BVTV số6: 13-18 23 Nguyễn Thị Khả Tú (2007), Định danh phân nhóm nấm Trichoderma sp phân lập Việt Nam, Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh 24 Nguyễn Văn Tuất, Ngơ vĩnh Viễn (2011), Nghiên cứu nấm Phytophthora sp gây bệnh hồ tiêu biện pháp quản lý bệnh hại tổng hợp Đăk Nông phụ cận, Luận án Tiến sĩ 25 Nguyễn Thị Nhã Vy (2009), Nghiên cứu khả sinh hoạt chất vi sinh vật gây bệnh cho trồng chủng nấm sợi phân lập từ rừng Đà Lạt, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh 26 Dương Hoa Xơ (2005), Vai trò nấm đối kháng Trichoderma kiểm sốt sinh vật, Sở Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn TP HCM Ngồi nƣớc 27 Clipson N., Landy E., Otte M., 2001 European register of marine species: a check-list of the marine species in Europe and a bibliography of guides to their identification Collection Patrimoines Naturels, 50, 15-19 28 Danielson, R.M and Davey, C.B 1973c Carbon and nitrogen nutrition in Trichoderma As quote by Kubicek-Pranz, E M 1998 Nutrition, cellular structure and basic metabolic pathways in Trichoderma and Gliocladium Soil boil.Biochem 5: 506-515 35 29 Drenth A., Sendall B., (2004), “Isolation of Phytophthora from infected plant tissue and soil, and principlesof species identification”, Diversity and management of Phytophthorain Southeast Asi, Canberra, Australia, pp 94 102 30 Gary J Samuels, 9-2005 Trichoderma: Systematic, the Sexual State, and Ecology United States Department of Agriculture Agricultural Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705 Acepted for publication 31 Grondona, I.R Hermosa, M., Tejada, M.D., Gomis, P.P., Bride, E Monte and I Garcia-Acha., 1997 Physiological and Biochemical Characterization of Trichoderma harzianum, a biological control agent againt soil borne fungal plant pathogens American society for Mycrobiologr 63 (8): 31893198 32 Prasun K Mukherjee and Kanthadai Raghu, 1997, Effect of temperature on antagonistic ang biocontrol pontential of Trichoderma sp on Sclerotium rolfsii Mycopathologia 139: 151-155 33 Trường N, Burgess LW, Liew ECY (2008), Prevalence and aetiology of Phytophthora foot rot of black pepper in Vietnam Australasian Plant Pathology 37, 431-442 Tài liệu intrenet 34 http://www.trongtrot.lamnghenong.com.vn/publ/ky_thuat_trong/cay_cong_ nghiep/k_thu_t_tr_ng_cay_h_tieu/33-1-0-189 36 ... lượng hồ tiêu địa bàn Tỉnh Mục tiêu đề tài Phân lập số chủng Phytophthora gây bệnh tiêu chết nhanh Bình Dương Khảo sát khả đối kháng nấm Trichoderma với chủng Phytophthora gây bệnh tiêu chết nhanh. .. với nấm bệnh Phytophthora sp phân lập được, qua tuyển chọn chủng nấm Trichoderma có khả đối kháng mạnh Nội dung nghiên cứu Phân lập nấm bệnh Phytophthora gây bệnh tiêu chết nhanh Nghiên cứu khả. .. tỉnh Bình Dương Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu Các chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh tiêu chết nhanh Bình Dương 3.2 Phạm vi nghiên cứu hảo sát khả đối kháng nấm Trichoderma