(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu phân lập nhân giống và nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo (cordyceps militaris) ở việt nam​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN THỊ HỒNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP - NHÂN GIỐNG VÀ NUÔI TRỒNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris) Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ HỒNG GẤM Hà Nội, 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan, cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Nếu nội dung nghiên cứu trùng lặp với cơng trình nghiên cứu cơng bố, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm tuân thủ kết luận đánh giá luận văn Hội đồng khoa học Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2020 Ngƣời cam đoan Nguyễn Thị Hồng ii LỜI CẢM ƠN Luận văn hồn thành chương trình đào tạo nghiên cứu sinh khóa 26A trường Đại học Lâm nghiệp Đ hoàn thành Luận văn này, trước hết xin chân thành cảm ơn tập th Ban lãnh đạo Viện, th y cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Ban Giám đốc Công ty Cổ ph n Dược thảo Thiên Phúc tạo u kiện tốt cho q trình thực Luận văn Đặc biệt, tơi xin g i lời biết ơn sâu s c đến TS Nguyễn Thị Hồng Gấm tận tình hướng d n nh ng ngày đ u b t tay vào nghiên cứu đ tơi hồn thành tốt Đ tài nghiên cứu Luận văn tiến hành hỗ trợ kinh phí Dự án thuộc Quỹ đổi Công nghệ Quốc gia - Bộ Khoa học & Cơng nghệ tài trợ: “Hồn thiện, nâng cấp quy trình sản xuất phát tri n sản phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa Cordyceps militaris”, PGS.TS Lê Minh S t, Công ty Cổ ph n Dược thảo Thiên Phúc làm chủ nhiệm Cuối c ng, xin g i lời cảm ơn tới gia đình, bạn b người thân luôn kh ch lệ, động viên tạo u kiện thuận lợi cho học tập hoàn thành Luận văn Tuy cố g ng đ hoàn thiện Luận văn, song kinh nghiệm tơi c n hạn chế, Luận văn khơng tránh khỏi nh ng thiếu sót, k nh mong qu th y đóng góp kiến đ Luận văn tơi hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Nội, ngày29 tháng năm 2020 Học viên Nguyễn Thị Hồng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ix ĐẶT VẤN ĐỀ Phần I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan chung v Cordyceps militaris 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm phân bố Cordyceps militairs 1.1.4 Giá trị dược liệu nấm Cordyceps militaris 1.1.5 Các hoạt chất nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 1.2 Tình hình nghiên cứu ni cấy đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris Việt Nam giới 1.2.1 Tình hình nghiên cứu ni cấy đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu ni cấy đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris Việt Nam 1.3 Các phương pháp định danh nấm 10 1.3.1 Phương pháp định danh thơng qua hình thái 10 1.3.2 Phương pháp định danh phân tử 11 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát tri n nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 15 iv 1.4.1 Yếu tố giống 15 1.4.2 Yếu tố dinh dưỡng 15 1.4.3 Các yếu tố môi trường 17 Phần MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 18 2.1.1 Mục tiêu tổng quát 18 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 18 2.2 Đối tượng, phạm vi nội dung nghiên cứu 18 2.2.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 18 2.2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp thu thập định danh loài nấmCordyceps militaris .19 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật phân lập giống gốc nấm Cordyceps militaris 22 2.3.3 Phương phápnghiên cứu kỹ thuật nhân giống cấp cấp nấm Cordyceps militaris 23 2.3.4 Phương phápnghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng chất tổng hợp phù hợp với Cordyceps militaris địa 24 2.4 Nguyên liệu,hóa chất, thiết bị 27 2.5 Phương pháp thu thập x lý số liệu 27 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết thu thập định danh loài nấm Cordyceps militaris 28 3.1.1 Kết điều tra thu thập mẫu VQG Hoàng Liên - Lào Cai 28 3.1.2 Kết định danh loài nấm Cordyceps militaris phân tử 37 3.2 Kỹ thuật phân lập giống gốc nấm Cordyceps militaris 51 3.3 Kỹ thuật nhân giống cấp cấp nấm Cordyceps militaris 54 3.3.1 Nhân giống cấp môi trường thạch 54 3.3.2 Nhân giống cấp môi trường lỏng 63 v 3.4 Kết nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng chất tổng hợp ph hợp với Cordyceps militaris địa 73 KẾT LUẬN 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO 102 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt APS C CMWE Viết đầy đủ Acidic polysaccharide Cacbon Dịch chiết từ th nấm Cordyceps militaris C.militaris Cordyceps militaris CNSH Công nghệ sinh học Cu Đồng ddNTP Dideoxynucleotide ĐTHT Đông tr ng hạ thảo FAME Fatty Acid Methyl Ester IL-6 Interleukin-6 ITS Internal Transcribed Spacer LPS Lipopolysaccharide PCR Polemerase Chain Reaction PDA Potato Dextro Agar PGA Potato Glucose Agar rRNA ARN riboxom Se SSU Selen Small Subunit TNHH Trách nhiệm h u hạn TNF - α yếu tố hoại t khối u α VQG Zn Vườn quốc gia Kẽm vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành ph n phản ứng PCR 221 Bảng 2.2 Công thức phối trộn loại môi trường nuôi cấy sợi nấm C.militaris 255 Bảng 2.3 Công thức phối trộn loại môi trường nuôi cấy sợi nấm C.militaris 255 Bảng 3.1 Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM1 với trình tự tương đồng GeneBank 37 Bảng 3.2 Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM2 với trình tự tương đồng GeneBank 39 Bảng 3.3 Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM13 với trình tự tương đồng GeneBank 41 Bảng 3.4 Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM18 với trình tự tương đồng GeneBank 43 Bảng 3.5 Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM28 với trình tự tương đồng GeneBank 44 Bảng 3.6 Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM29 với trình tự tương đồng GeneBank 46 Bảng 3.7 Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM32 với trình tự tương đồng GeneBank 47 Bảng 3.8 Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM34 với trình tự tương đồng GeneBank 49 Bảng 3.9 Kết phân lập m u nấm Codyceps militaris thu tự nhiên 50 Bảng 3.10 Đường k nh sinh trưởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris môi trường PGA 55 Bảng 3.11 Đường k nh sinh trưởng hệ sợ nấm Cordyceps militaris u kiện nhiệt độ khác 57 Bảng 3.12 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thành ph n môi trường đến khả tạo sinh khối nấm môi trường dịch th 62 Bảng 3.13 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ l c đến khả tạo sinh khối nấm môi trường dịch lỏng 69 viii Bảng 3.14 Kết ảnh hưởng nguồn Cacbon đến khả hình thành phát tri n th 71 Bảng 3.15 Kết nghiên cứu đặc m sinh trưởng hệ sợi nuôi cấy môi trường C2 76 Bảng 3.16 Kết ảnh hưởng nguồn Nito đến khả hình thành phát tri n th 79 Bảng 3.17 Kết nghiên cứu đặc m sinh trưởng hệ sợi nuôi cấy môi trường N2 83 Bảng 3.18 Kết ảnh hưởng cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng phát tri n th Cordyceps militaris 81 Bảng 3.19 kết nghiên cứu đặc m th chiếu sáng cường độ 700 lux 87 Bảng 3.20 Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng đến khả hình thành phát tri n th Cordyceps militaris 89 Bảng 3.21 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày 90 Bảng 3.22 Ảnh hưởng độ ẩm đến khả hình thành phát tri n th Cordyceps militaris 92 Bảng 3.23 Kết nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm 80% 90% đến sinh trưởng th 93 Bảng 3.24 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả hình thành phát tri n th Cordyceps militaris 96 Bảng 3.25 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng th 97 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Hình ảnh m u nấm CM1 thu tự nhiên 299 Hình 3.2 Hình ảnh m u nấm CM2 thu tự nhiên 309 Hình 3.3 Hình ảnh m u nấm CM5 thu tự nhiên 30 Hình 3.4 Hình ảnh m u nấm CM7 thu tự nhiên 31 Hình 3.5 Hình ảnh m u nấm CM13 thu ngồi tự nhiên 31 Hình 3.6 Hình ảnh m u nấm CM14 thu ngồi tự nhiên 32 Hình 3.7 Hình ảnh m u nấm CM18 ngồi tự nhiên 33 Hình 3.8 Hình ảnh m u nấm CM24 thu tự nhiên 33 Hình 3.9 Hình ảnh m u nấm CM28 tự nhiên 35 Hình 3.10 Hình ảnh m u nấm CM29 thu tự nhiên 36 Hình 3.11 Hình ảnh m u nấm CM32 ngồi tự nhiên 36 Hình 3.12 Hình ảnh m u nấm CM34 ngồi tự nhiên 37 Hình 3.13 Kết so sánh trình tự gen chủng CM1 BLAST NCBI 38 Hình 3.14 Sơ đồ di truy n chủng CM1 39 Hình 3.15 Kết so sánh trình tự gen chủng CM2 BLAST NCBI 40 Hình 3.16 Sơ đồ di truy n chủng CM2 40 Hình 3.17 Sơ đồ di truy n chủng CM7 40 Hình.3.18 Kết so sánh trình tự gen chủng CM13 BLAST NCBI 41 Hình 3.19 Sơ đồ di truy n chủng CM13 42 Hình 3.20 Kết so sánh trình tự gen chủng CM18 BLAST NCBI 42 Hình 3.21 Sơ đồ di truy n chủng CM18 44 Hình 3.22 Kết so sánh trình tự gen chủng CM28 BLAST NCBI 45 Hình 3.23 Sơ đồ di truy n chủng CM28 46 Hình 3.24 Kết so sánh trình tự gen chủng CM29 BLAST NCBI 47 Hình 3.25 Sơ đồ di truy n chủng CM29 48 Hình 3.26 Kết so sánh trình tự gen chủng CM32 BLAST NCBI 49 Hình 3.27 Sơ đồ di truy n chủng CM32 49 Hình 3.28 Kết so sánh trình tự gen chủng CM34 BLAST NCBI 50 90 So sánh thời gian hình thành th thời gian thu hoạch th ba thời gian chiếu sáng khác chúng nhận thấy rằng: chiếu sáng 12 giờ/ngày thời gian hình thành th thời gian thu hoạch th ng n hai thời gian chiếu sáng lại Kết cụ th trình bày bảng đây: Bảng 3.21 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày Kích thƣớc thể mm Mẫu CM1 CM2 CM7 Số lƣợng thể TB/hộp 22,67 ± 0,44 23,67 ± 0,44 28,33 ± 0,44 Chiều dài thể 51,80 ± 0,07 33,33 ± 0,09 66,80 ± 0,07 Đƣờng kính thể Đặc điểm thể 2,67 ±0,09 Quả th có màu cam đậm, hình trụ thuôn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ 2,40 ± 0,13 Quả th có màu cam, hình trụ, đ u th tr n, ph a đ u có bào t 2,10 ± 0,07 Quả th có màu cam đỏ, hình trụ dài, ph a đ u th có màu tr ng, th tr n CM13 35,67 ± 0,44 48,20 ± 0,07 2,73 ± 0,04 CM18 25,33 ± 0,44 60,10 ± 0,07 2,13 ± 0,11 CM29 35,67 ± 0,44 53,73 ± 0,04 3,63 ± 0,04 CM32 35,33 ± 0,44 92,10 ± 0,13 3,03 ± 0,04 CM34 40,33 ± 1,11 50,20 ± 0,07 3,57 ± 0,24 Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ, đ u th tr n, ph a đ u có chấm tr ng Quả th có màu cam, hình trụ thuôn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt 91 Như vậy, thời gian chiếu sáng phù hợp cho sinh trưởng phát tri n th nấm 12 giờ/ngày Hình 3.60 Hình ảnh mẫu sau nuôi trồng chất tổng hợp thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày e) Kết nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm đến khả hình thành phát triển thể nấm Cordyceps militaris Đ nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm đến khả hình thành phát tri n th nấm Cordyceps militaris tiến hành bố tr th nghiệm ba u kiện độ ẩm khác Nuôi c ng u kiện nhiệt độ, ánh sáng Kết th nghiệm trình bày bảng 92 Bảng 3.22 Ảnh hƣởng độ ẩm đến khả hình thành phát triển thể Cordyceps militaris M u CM1 CM2 CM7 CM13 CM18 CM29 CM32 CM34 Độ ẩm (%) 70 80 90 70 80 90 70 80 90 70 80 90 70 80 90 70 80 90 70 80 90 70 80 90 Thời gian hệ sợi ăn k n b mặt chất (ngày) 5 6 6 5 6 5 5 5 Thời gian hình thành th (ngày) 14 11 16 15 10 10 14 10 11 14 13 14 14 12 12 12 10 10 15 12 13 15 10 11 Thời gian thu hoạch th (ngày) 61 55 56 57 55 55 57 52 53 62 58 58 56 53 54 60 55 55 55 50 51 60 55 56 Từ kết thí nghiệm trên, cho thấy độ ẩm có ảnh hưởng đến sinh trưởng phát tri n th Cordyceps militaris Quan sát sinh trưởng th độ ẩm 70% nhận thấy: sinh trưởng th hai cường độ Quả th phát tri n chậm Nhận thấy th nhỏ, ng n, ph n đế th khô So sánh thời gian hình thành th thời gian thu hoạch th ba độ ẩm khác thấy rằng: độ ẩm 80% 90% tiêu thu thập đ u khơng có khác biệt rõ rệt Kết nghiên cứu trình bày bảng sau: 93 Bảng 3.23 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng độ ẩm 80% 90% đến sinh trƣởng thể Mẫu Độ ẩm (%) Số lƣợng thể TB/hộp 80 Kích thƣớc thể mm Chiều dài thể Đƣờng kính thể 22,33 ±0,44 51,73±0,04 2,53 ±0,04 90 22,33 ±0,89 51,77 ±0,04 2,53 ±0,11 80 23,67 ±0,44 32,80 ±0,07 2,37 ±0,04 90 23,67 ±0,44 32,87 ±0,04 2,40 ±0,13 80 28,33 ±0,44 66,70 ±0,73 2,17 ±0,04 90 28,00 ±0,67 66,70 ±0,07 2,20 ±0,07 80 35,33 ±0,44 48,23 ±0,04 2,33 ±0,04 90 36,67 ±0,89 48,13 ±0,04 2,47 ±0,09 80 25,33 ±0,44 69,70 ±0,13 2,53 ±0,04 90 25,00 ±0,67 59,80 ±0,07 2,50 ±0,07 80 35,33 ±0,44 52,30 ±0,07 2,63 ±0,04 90 35,67 ±0,44 52,20 ±0,07 2,67 ±0,04 CM1 CM2 CM7 CM13 CM18 CM29 Đặc điểm thể Quả th có màu cam đậm, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ Quả th có màu cam, hình trụ, đ u th tr n, ph a đ u có bào t Quả th có màu cam đỏ, hình trụ dài, ph a đ u th có màu tr ng, th tr n Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ, đ u th tr n, ph a đ u có chấm tr ng Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt 94 80 34,67 ±0,44 76,47 ±0,04 3,33 ±0.04 90 34,00 ±0,67 76,53 ±0,04 3,47 ±0,09 80 40,33 ±0,44 50,23 ±0,25 3,57 ±0,11 90 40,33 ±0,44 50,20 ±0,07 3,63 ±0,09 CM32 CM34 Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Hình 3.61 Hình ảnh mẫu sau ni trồng độ ẩm 80% 95 Hình 3.62 Hình ảnh mẫu sau nuôi trồng độ ẩm 90% Như vậy, khoảng độ ẩm phù hợp cho sinh trưởng phát tri n th nấm 80% - 90% f) Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến khả hình thành phát triển thể nấm Cordyceps militaris Đ nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến khả hình thành phát tri n th nấm Cordyceps militaris tiến hành bố tr th nghiệm ba u kiện nhiệt độ khác Kết th nghiệm trình bày bảng sau: 96 Bảng 3.24 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả hình thành phát triển thể Cordyceps militaris M u CM1 CM2 CM7 CM13 CM18 CM29 CM32 CM34 Nhiệt độ (oC) 20 22 24 20 22 24 20 22 24 20 22 24 20 22 24 20 22 24 20 22 24 20 22 24 Thời gian hệ sợi ăn k n b mặt chất (ngày) 8 6 5 5 5 6 5 5 Thời gian hình thành th (ngày) 17 11 12 16 14 15 13 10 11 17 15 15 12 10 11 12 10 11 16 12 12 14 10 12 Thời gian thu hoạch th (ngày) A 63 56 57 60 57 58 56 50 52 62 60 61 55 52 54 62 56 58 55 50 52 61 55 56 B Hình 3.63 Hình ảnh mẫu CM18 sau hệ sợi ăn lan kín bề mặt chất (A) sau nuôi sáng ngày (B) nhiệt độ 22oC 97 Từ kết thí nghiệm trên, nhận thấy nhiệt độ có ảnh hưởng đến sinh trưởng phát tri n th Cordyceps militaris Quan sát sinh trưởng th nhiệt độ 20oC nhận thấy: sinh trưởng th nhiệt độ Quả th phát tri n chậm Nhận thấy th nhỏ, ng n, ph n đế th khơ So sánh thời gian hình thành th thời gian thu hoạch th ba nhiệt độ khác nhận thấy rằng: nhiệt độ 22oC 24oC tiêu thu thập đ u khơng có khác biệt rõ rệt Kết nghiên cứu trình bày bảng sau: Bảng 3.25 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng thể Mẫu Nhiệt độ (%) Số lƣợng thể TB/hộp Chiều dài thể mm Đƣờng kính thể mm 22 22,00 ± 0,67 51,70 ±0,07 2,53 ±0,04 24 22,67 ± 0,44 51,77 ±0,04 2,67 ±0,09 22 23,33 ± 0,44 32,90 ±0,13 2,37 ±0,09 24 23,00 ± 0,67 32,90 ±0,07 2,37 ±0,04 22 28,33 ± 0,44 66,50 ±0,10 2,20 ±0,07 24 28,33 ± 0,89 65,23 ±0,04 2,10 ±0,07 22 35,33 ± 0,44 48,23 ±0,04 2,33 ±0,04 24 35,67 ± 0,89 48,30 ±0,04 2,37 ±0,11 22 25,00 ± 0,44 59,77 ±0,04 2,57 ±0,04 24 25,67 ± 0,44 60,03 ±0,04 2,10 ±0,07 22 35,33 ± 0,44 52,23 ±0,04 2,60 ±0,07 24 35,33 ± 0,44 52,97 ±0,04 3,10 ±0,13 22 34,67 ± 0,44 80,60 ±0,07 3,33 ±0,04 CM1 CM2 CM7 CM13 CM18 CM29 CM32 Đặc điểm thể Quả th có màu cam đậm, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ Quả th có màu cam, hình trụ, đ u th tr n, ph a đ u có bào t Quả th có màu cam đỏ, hình trụ dài, ph a đ u th có màu tr ng, th trịn Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ, đ u th tr n, ph a đ u có chấm tr ng Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ thuôn dài, đ u th 98 Mẫu Nhiệt độ (%) Số lƣợng thể TB/hộp Chiều dài thể mm Đƣờng kính thể mm 24 34,33 ± 1,11 88,63 ±0,04 3,57 ±0,04 22 40,33 ± 0,44 50,27 ±0,04 3,57 ±0,16 24 40,33 ± 1,11 50,13 ±0,04 3,50 ±0,13 CM34 Đặc điểm thể nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt  Xét ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng thể mẫu CM1, CM13, CM29, CM32, CM34 Căn vào bảng số liệu nhận thấy m u đ u có chung đặc m th Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Sau khoảng thời gian nuôi trồng chất tổng hợp, nhận thấy m u CM32 có k ch thước thước th vượt trội th nh ng m u lại mà thời gian thu hoạch ng n (50 - 52 ngày) Hình 3.64 Hình ảnh mẫu CM32 nhiệt độ 22oC - 24oC sau 50 52 ngày nuôi trồng Ở m u CM1, CM29, CM34 nhận thấy sinh trưởng th tương đối giống Sau nuôi trồng chất tổng hợp, chi u dài th m u đ u > 50 mm Quả th đ u phát tri n tốt môi trường nhân tạo Quan sát sinh trưởng m u lại CM13, nhận thấy sau nuôi trồng chất tổng hợp chi u dài th đạt 48,23 - 48,30 mm sau 60 ngày nuôi trồng Quả th đ u, sinh trưởng phát tri n nhanh môi trường nhân tạo 99 Hình 3.65 Hình ảnh mẫu CM1, CM29, CM34 nhiệt độ 22oC 24oC sau nuôi trồng giá thể tổng hợp Hình 3.66 Hình ảnhmẫu CM13 sau nuôi trồng 58 ngày nhiệt độ 22oC 24oC 100  Xét ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng thể mẫu CM2, CM7, CM18 Căn vào bảng số liệu nhận thấy m u đ u có chung đặc m th là: Quả th có màu cam, hình trụ, đ u th tr n, ph a đ u có chấm tr ng Sau khoảng thời gian nuôi trồng chất tổng hợp, nhận thấy m u CM7 có kích thước thước th vượt trội th nh ng m u lại mà thời gian thu hoạch ng n (50 -– 52 ngày) Hai m u lại nhận thấy đ u sinh trưởng phát tri n tốt mơi trường ni cấy tổng hợp Hình 3.67 Hình ảnh mẫu CM7 sau ni trồng chất tổng hợp nhiệt độ 22oC 24oC Như vậy, khoảng nhiệt độ phù hợp cho sinh trưởng phát tri n th nấm 22oC - 24oC 101 KẾT LUẬN Kết luận Thu thập 12 m u nấm VQG Hoàng Liên – Lào Cai độ - cao khoảng 2200m Các m u xác định Cordyceps militaris dựa vào đặc m hình thái bên ngồi k hiệu sau: CM1, CM2, CM5, CM6, CM7, CM13, CM14, CM18, CM24, CM28, CM29, CM32, CM34 Đã định danh phân t cho 08 m u CM1, CM2, CM7, CM13, - CM18, CM29, CM32, CM34 Cordyceps militaris - Phân lập giống gốc cho 08 m u Cordyceps militaris, tỉ lệ phân lập m u cao đạt 73,33% (CM32) tỉ lệ phân lập m u thấp đạt 33,33% (CM2) - Môi trường nhân giống cấp thích hợp PGA - Mơi trường nhân giống cấp phù hợp M2: 20g/l Glucose + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao nấm men + 5g/l Pepton + 5g/l bột nhộng khô Tốc độ nuôi l c giống cấp 150 vịng/phút Mơi trường chất tổng hợp ph hợp cho nuôi trồng th là: - 18g/hộp gạo lứt khô + 25g/l glucose + 10g/l nhộng tươi nghi n nhỏ + 0,5g/l KH2PO4, 1g/l cao nấm men, 3g/l Pepton + 20ml/l gồm nước dừa, nước chiết malt Đi u kiện ph hợp cho nuôi trồng th là: Cường độ chiếu sáng - 700 lux với thời gian 12 giờ/ngày; độ ẩm 80 %-90%; nhiệt độ 22oC - 24oC Kiến nghị - Xác định hàm lượng hoạt chất m u nuôi trồng - Đánh giá đặc m di truy n m u qua hệ 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đái Duy Ban, Lưu Tham Mưu (2009), Đông trùng hạ thảo, Nxb Y học, Hà Nội Nguyễn Thị Hậu (2014), Luận văn thạc sỹ “Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” PGS.TS Vũ Văn Liết (2009), Giáo trình quỹ gen bảo tồn quỹ gen Đoàn Minh Quân, Đinh Minh Hiệp (2014), “Nghiên cứu tách chiết ergosterol thử nghiệm hoạt tính kháng phân bào cao ether dầu hỏa từ sinh khối nấm Cordyceps spp Việt Nam”, Kỷ yếu hội nghị Nấm học nghiên cứu ứng dụng khu vực ph a nam năm 2014, tr.89 Tr n Văn Tú (2011), Luận văn thạc sỹ “Nghiên cứu thành phần lồi nấm Đơng trùng hạ thảo Vườn Quốc gia Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai” Nguyễn Mậu Tuấn, Nguyễn Thái Huy, Trương Phi H ng, Lê Thị Thơ, Nguyễn Kim Chi (2013), “Một số kết nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Lâm Đồng”, Hội thảo quốc tế Khoa học Công nghê phục vụ phát tri n sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng, tr.51-55 Nguyễn Mậu Tuấn, Trương Phi H ng, Nguyễn Thái Huy, Dương Thị Ngọc (2009), “ iệu dịch chiết nấm đông trùng hạ thảo tằm dâu, Paecilomyces tenuipes đến khả bơi chuột”, Tạp chí khoa học công nghệ nông nghiệp Việt Nam, 2(15), tr.110-115 Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân, Nguyễn Mạnh Hà, Nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi nuôi cấy khiết chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr) Link Phạm Quang Thu (2009), “Điều tra phát nấm nhộng trùng hạ thảo Cordyceps nutans pat phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát tri n Nông thôn, (4) 10 Phạm Quang Thu (2009), “Phát nấm nhộng trùng hạ thảo Cordyceps gunni Berk Tại vườn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc” Tạp chí Nơng nghiệp Phát tri n Nơng thôn, (6), Tr 96-99 103 11 Phạm Quang Thu (2013), “Đông trùng hạ thảo nghiên cứu nuôi trồng thể Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam”, Hội thảo quốc tế Khoa học Công nghê phục vụ phát tri n sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng, tr.45-50 12 Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân, Nguyễn Mạnh Hà (2011), Nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi nuôi cấy khiết chủng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr) Link.- , tr.400-408 13 Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà (2009), “Phát nấm nhộng trùng hạ thảo Cordyceps militaris LINK vườn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát tri n Nơng thơn, (9) 14 Phạm Thị Th y (2010), “Nghiên cứu phát triển nguồn nấm Beauveria Metarhizium để ứng dụng phòng trừ sâu hại trồng, rừng phát nguồn nấm Cordyceps sp làm thực phẩm chức cho người”, Hội thảo Quốc gia Bệnh hại Thực vật Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, tr.224-231 15 Tr n Minh Trang, Đinh Minh Hiệp, Huỳnh Thư (2014), “Tách chiết exopolysaccharite từ dịch nuôi cấy nấm Cordyceps sinensis khảo sát hoạt tính kích thích tăng sinh PBMC”, Kỷ yếu hội nghị Nấm học nghiên cứu ứng dụng khu vực ph a nam năm 2014, tr.87 Tài liệu Tiếng Anh 16 Das S.K (2009), Production of anti-cancer agent cordycepin from the medicinal mushroom Cordyceps militaris, A Dissertation of Doctor of Engineering, University of Fukui, Japan 17 Holliday J., Cleaver P., Loomis-Powers M., Patel D (2004), “Analysis of Quality and Techniques for Hybridization of Medicinal Fungus Cordyceps sinensis”, International Journal of Medicinal Mushrooms, 6, pp 147-160 18 Itoh H., Shioda T., Matsura T., Koyama S., Nakanishi T., Kajiyama G., Kawasaki T (1994), “Iron ion induces mitochondrial DNA damage in HTC Rat Hepatoma Cell Culture - Role of antioxidants in mitochondrial DNA protection from oxidative stresses”, Arch Biochem Biophys, 313(1), pp.120 – 125 19 Sun Y.J., Lü P., Ling J.Y., Zhang H.X., Chen C., Zhang C.K (2003), “Nucleosid from Cordyceps kyushuensis and the distribution of two active components in its different parts”, Yao Xue Xue Bao, 38(9), pp 690-694 104 20 Sung J.H., Jones N.L.H., Sung J.M., Luangsa-ard J.J., Shrestha B., Spatafora J.W (2007), “Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi, Studies in Mcology, 57, pp.5–59 21 Xie J.W., Huang L.F., Hu W., He Y.B., Wong K.P (2010), “Analysis of the main nucleosids in Cordyceps sinensis by LC/ESI-MS”, Molecules, 15, pp 305-314 22 Yoshikawa N., Nakamura K., Yamaguchi Y., Kagota S., Shinozuka K., Kunitomo M (2007), “Reinforcement of antitumor effect of Cordyceps sinensis by 2’ – Deoxycoformycin, an adenosin deaminase inhibitor”, in vivo, 21, pp.291-296 23 Zhang Z.S., Wang F., Wang X.M., Liu X.L., Hou Y., Zhang Q.B (2010), “Extraction of the polysaccharids from five algae and their potential antioxidant activity in vitro”, Carbohyd Polym, 82, pp.118-121 24 Zhou X., Gong Z., Su Y., Lin J., Tang K (2009), “Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products”, Journnal of Pharmacy and Pharmacology, 61, pp.279-291 ... tốt c n hạn chế Vì vậy, thực đ tài ? ?Phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) Việt Nam” với mục đ ch định danh nh ng chủng giống nấm Đông tr ng hạ thảo thu... Đông tr ng hạ thảo tự nhiên d n trở nên khan thúc đẩy nhi u nghiên cứu hướng đến việc nuôi trồng Đông tr ng hạ thảo nhân tạo Cordyceps militaris s dụng nguồn Đơng tr ng hạ thảo có th ni cấy nhân. .. phân tử 37 3.2 Kỹ thuật phân lập giống gốc nấm Cordyceps militaris 51 3.3 Kỹ thuật nhân giống cấp cấp nấm Cordyceps militaris 54 3.3.1 Nhân giống cấp môi trường thạch 54 3.3.2 Nhân giống