Nghiên cứu nhân giống một số dòng tếch (tectona grandis linn) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Bộ giáo dục đào tạo Bộ nông nghiệp PTNT Trường đại học lâm nghiệp Nguyễn thị thuỳ Dương Nghiên cứu nhân giống số dòng tếch (Tectona grandis Linn) phương pháp nuôi cấy in vitro Luận văn thạc sĩ khoa học Lâm nghiệp H Tây 2007 Bộ giáo dục đào tạo Bộ nông nghiệp PTNT Trường đại học lâm nghiệp Nguyễn thị thuỳ Dương Nghiên cứu nhân giống số dòng tếch (Tectona grandis Linn) phương pháp nuôi cấy in vitro Chuyên ngành: Lâm học Mà số: 60.62.60 Luận văn thạc sĩ khoa học Lâm nghiệp Người hướng dẫn: T.S Hà huy thịnh H Tây 2007 Lời nói đầu Nâng cao chất lượng đào tạo nghiên cứu khoa học mục tiêu quan trọng việc đào tạo cao học Trường đại học Lâm nghiệp Để hoàn thành chương trình đào tạo Cao học Lâm nghiệp khoá học 2005- 2007, đồng ý Khoa sau đại học - Trường Đại học Lâm nghiệp, thực đề tài tốt nghiệp: "Nghiên cứu nhân giống số dòng Tếch (Tectona grandis Linn) phương pháp nuôi cấy in vitro Được trí Ban lÃnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống rừng, đề tài thực phòng nghiên cứu nuôi cấy mô - Trung tâm nghiên cứu giống rừng Để đạt kết học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tác giả đà nhận quan tâm giúp đỡ tận tình nhiều mặt Trường đại học Lâm nghiệp, đặc biệt Khoa sau đại học, tất thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy, lÃnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống rừng Cho phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy, cô giáo, đặc biệt T.S Hà Huy Thịnh Th.S Đoàn Thị Mai, toàn thể cán công nhân viên trung tâm đà tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ hoàn thành luận văn Trong luận văn tránh khỏi khiếm khuyết, mong bảo bổ sung ý kiến nhà khoa học, bạn đồng nghiệp để công trình nghiên cứu hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Tây, Ngày 25/09/2007 Tác giả Đặt vấn đề Theo định thủ tướng phủ (QĐ số 17/2006/NĐ-TTg), đến năm 2020 phải tạo giống trồng, vật nuôi có suất cao, chất lượng hiệu kinh tế cao phục vụ tốt nhu cầu chuyển đổi cấu kinh tế lĩnh vực Nông nghiệp Phát triển nông thôn Một nhiệm vụ ngành Lâm nghiệp phát triển vi nhân giống đáp ứng đủ nhu cầu giống Lâm nghiệp vào năm 2015 [16] Tếch loài sinh trưởng nhanh có biên độ sinh thái rộng gỗ Tếch sử dụng phổ biến xây dựng làm đồ gỗ gia dụng có khả chống mối mọt, chịu nước lâu ngày, mặt gỗ có độ bóng cao Trong công nghiệp chế biến gỗ: Tếch loài có chất lượng gỗ mịn bóc tách thành mỏng Do gỗ Tếch có tỷ trọng nhẹ, bị hà bám, chịu va đập ngâm nước mặn nên dùng công nghiệp đóng tàu Mặt khác, nhu cầu thương mại gỗ Tếch ngày tăng thay số loài gỗ quý khác[42] Cây Tếch trồng thăm dò nước ta vào khoảng năm 30 kỷ 20 Lúc đầu, Tếch trồng thử công viên đường phố nhiều tỉnh như: Hà Giang, Tuyên Quang, Sơn La, Lai Châu, Hà Nội, Đắc Lắc, Đồng Nai, Tây Ninh, Sài Gòn Cũng thời gian riêng Lộc Ninh, Tỉnh Bình Phước đà gây trồng Tếch thành khu rừng nhỏ Vào năm 60, với nguồn giống thu hái từ Lộc Ninh đà trồng thành công khu rừng Tếch 200 Định Quán, tỉnh Đồng Nai khu rừng Tếch Eak Mat, tỉnh Đắc Lắc Sau năm 1975, Tếch trồng mở rộng nhiều lâm trường tỉnh miền Đông Nam Bộ Tây Nguyên như: Đồng Nai, Bình Phước, Tây Ninh, Đắc Lắc, Gia Lai, Kom TumNhưng chưa có giống cải thiện nên chất lượng rừng không cao, suất rừng trồng Tếch nước ta thấp (9 12m3/ năm) [17] Hiện nay, diƯn tÝch rõng TÕch trång míi cđa c¸c n­íc giới năm tăng nhanh, nhiều Indonesia khoảng 1.760 nghìn ha, ấn Độ khoảng 2.450 nghìn ha, Myanmar 139 nghìn ha, Malaysia khoảng nghìn ha, Thái Lan 836 nghìn [29] Việt Nam, diện tích trồng Tếch đạt 1.500 ha, rÊt Ýt so víi c¸c n­íc khu vùc nhiều nguyên nhân khác mà thiếu giống cải thiện nguyên nhân quan trọng Chính công tác chọn tạo nhân giống số dòng tếch có suất cao vấn đề cần thiết Hiện nay, giống sản xuất từ hạt sử dụng phổ biến không đáp ứng nhu cầu trồng rừng rừng giống chuyên canh, hạt giống thu hái xô bồ nên phẩm chất hạt Hơn cách nhân giống gây tượng phân ly tính trạng thụ phấn tự làm cho trồng không đồng dẫn đến suất rừng biến động Một khó khăn suất hạt thÊp (1 rõng 15 ti chØ cho kho¶ng 50 kg hạt) Không thế, hạt Tếch tự nhiên có khả nảy mầm thấp, vườn ươm tỷ lệ nảy mầm không cao, đạt khoảng 5-10% [28] [42] Để khắc phục nhược điểm giải pháp nhân giống sinh dưỡng ngày quan tâm Tuy nhiên loài Tếch phương pháp nhân giống vô tính hom gặp nhiều khó khăn tỷ lệ rễ không cao đạt khoảng 24-30% [3] Chính lý nên giải pháp nhân giống sinh dưỡng nuôi cấy mô tế bào quan tâm nghiên cứu Nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, gọi nhân giống in vitro, phương pháp sản xuất từ chồi vượt mẹ cách nuôi cấy chúng ống nghiệm, điều kiện vô trùng tuyệt môi trường thích hợp kiểm soát điều kiện hoàn cảnh đồng Nuôi cấy mô tế bào nhân nhanh với số lượng lớn khoảng thời gian ngắn, tiến hành điều kiện phòng thí nghiệm nên hoàn toàn chủ động sản xuất Ngoài ra, kỹ thuật giúp tạo giống mới, tạo nguồn bệnh, tạo có độ đồng cao trì đặc tính tốt mẹ Từ lý đề tài Nghiên cứu nhân giống số dòng Tếch phương pháp nuôi cấy in vitro tiến hành Đây nội dung đề tài cấp Nghiên cứu tuyển chọn nhân giống Xoan ta Tếch có suất cao Chương Tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.1 Khái niệm sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm Nhân giống nuôi cấy mô tế bào thực vật hay gọi vi nhân giống phương pháp sản xuất hàng loạt từ chồi non (cơ quan, mô tế bào) cách nuôi cấy chúng ống nghiệm điều kiện vô trùng tuyệt môi trường thích hợp kiểm soát Thuật ngữ nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nuôi cấy in vitro phạm trù khái niệm tất loại nuôi cấy mô tế bào điều kiện vô trùng, bao gồm: Nuôi cấy cây: nuôi cấy thực vật Nuôi cấy phận đà tách khỏi thực thể thực vật: nuôi cấy quan Nuôi cấy phôi thành thục hay chưa thành thục đà tách khỏi thể thực vật: nuôi cấy phôi Nuôi cấy mô bắt nguồn từ quan thực vật: nuôi cấy m« hay nu«i cÊy m« sĐo  Nu«i cÊy tÕ bào đơn lẻ hay cụm tế bào nhỏ môi trường lỏng Nuôi cấy tế bào thực vật sau đà tách bỏ vỏ tế bào, gọi nuôi cấy tế bào trần (protoplast) [14] 1.1.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào * Tính toàn (totipotence) Năm 1902 lần nhà thực vật học người Đức Haberlandt đà đưa quan niệm: Mỗi tế bào (đà biệt hoá) lấy từ thể thực vật có khả tiềm tàng để phát triển thành thể hoàn chỉnh Theo quan niệm sinh học đại tế bào riêng rẽ đà biệt hoá chứa toàn thông tin di truyền (ADN) cần thiết thể đó, gặp điều kiện thích hợp tế bào có khả phát triển thành thể hoàn chỉnh, tính toàn tế bào thực vật Tính toàn tế bào sở lý luận nuôi cấy mô tế bào Cho đến nay, người đà hoàn toàn chứng minh khả tái sinh thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ * Sự phân hoá phản phân hoá tế bào Cơ thể thùc vËt tr­ëng thµnh lµ mét chØnh thĨ thèng nhÊt bao gồm nhiều quan chức khác nhau, có nhiều loại tế bào khác thực chức cụ thể khác Tuy nhiên, tất loại tế bào bắt nguồn từ tế bào phôi sinh Sự phân hoá tế bào chuyển hoá tế bào phôi sinh thành tế bào mô chuyên hoá đảm nhận chức khác thể Quá trình phân hoá biểu thị sau: Phân hoá Tế bào phôi sinh Tế bào dÃn Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá Sơ đồ 1.1: Quá trình phân hoá phản phân hoá tế bào Quá trình gồm có giai đoạn - Sự phân chia tế bào: Quá trình phân chia tế bào xảy mô phân sinh làm cho số lượng tế bào tăng lên cách đáng kể - Sự dÃn tế bào: Tế bào dÃn chiều ngang chiều dọc làm tăng kích thước quan nói riêng toàn thể nói chung Sau hai giai đoạn với trình biệt hoá tế bào phân hoá thành mô có chức riêng biệt, đảm nhận vai trò khác thể sống Tuy nhiên, tế bào phân hoá thành mô chức chúng không hoàn toàn khả phân chia Trong điều kiện định tế bào lại trở thành dạng tế bào phôi sinh tiếp tục trình phân chia cho tế bào có khả tái sinh thành hoàn chỉnh Đây trình phản phân hoá tế bào Về chất phân hoá phản phân hoá trình điều hoà hoạt hoá gen Tại thời điểm trình phát triển cá thể, có số gen bị ức chế hoạt hoá trở lại để tạo tính trạng mới, số gen khác lại bị đình hoạt động Điều xảy theo chương trình đà mà hoá cấu trúc phân tử ADN tế bào Mặt khác, tế bào nằm khối mô thể, thường bị ức chế tế bào xung quanh Khi tế bào tách riêng ra, gặp điều kiện thuận lợi gen hoạt hoá, trình diễn biến theo chương trình đà định sẵn gen 1.2 Các giai đoạn trình nhân giống in vitro 1.2.1 Giai đoạn chuẩn bị Mục đích giai đoạn chuẩn bị nhằm tạo nguồn mẫu để phục vụ cho bước Giai đoạn coi bước hoá vật liệu để nuôi cấy Cây giống đưa khỏi nơi phân bố tự nhiên ®Ĩ chóng thÝch øng víi m«i tr­êng míi, ®ång thêi giảm bớt khả nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy chủ động công tác nhân giống Trong trường hợp cần thiết làm trẻ hoá vật liệu giống 1.2.2 Giai đoạn cấy khởi động Mục đích giai đoạn tạo chồi từ mô nuôi cấy Khi đà có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu xử lý điều kiện vô trùng Người ta th­êng dïng mét sè ho¸ chÊt nh­ HgCl2, Ca(Ocl)2, H2O2… để khử trùng mẫu cấy Tuỳ thuộc vào loại vật liệu mà chọn hoá chất, nồng độ thời gian khử trùng thích hợp Về nguyên tắc, mô nuôi cÊy cã thĨ lµ bÊt kú bé phËn nµo cđa (thân, rễ, lá, hoa quả) theo Bhatt mô lấy từ phần non có khả nuôi cấy thành công cao mô lấy từ phận trưởng thành khác [29] Vì vậy, người ta thường lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro Ngoài ra, lựa chọn mô nuôi cấy cần ý tuổi sinh lý mô thấp độ trẻ hoá cao, nuôi cấy dễ thành công Các mô lấy thời kỳ sinh trưởng mạnh mùa sinh trưởng cho khả tái sinh tốt (Anolesnon 1980) Đối với mẫu dễ bị hoá nâu nuôi cấy bổ sung than hoạt tính Polyvinylpyrroline (PVP) vào môi trường [8] Giai đoạn cần đảm bảo yêu cầu: tỷ lƯ m« nhiƠm thÊp, tû lƯ sèng cao, m« tån sinh trưởng tốt Kết giai đoạn phụ thuộc vào việc chọn phận nuôi cấy, lấy mẫu cần đảm bảo nguyên tắc nêu Giai đoạn thường kéo dài tuần 1.2.3 Giai đoạn nhân nhanh Một ưu điểm phương pháp nhân giống in vitro so với phương pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao Vì vậy, coi giai đoạn then chốt toàn trình nhân giống Hệ số nhân giai đoạn biến động từ đến 50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi trường phương pháp nhân Để tạo hệ số nhân cao cần lựa chọn môi trường điều kiện ngoại cảnh thích hợp Trong giai đoạn vai trò chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokinin) quan trọng để sản sinh lượng tối đa mà đảm bảo sức sống chất di truyền Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều Cytokinin kích thích tạo chồi Chế độ nuôi cấy thường 25 27oC 10 16 chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 1000 3000lux Yêu cầu giai đoạn tạo số lượng tối đa thời gian ngắn đảm bảo sức sống chất di truyền 1.2.4 Tạo hoàn chỉnh (cho rễ) Đây giai đoạn chuẩn bị cho chuyển hệ thống vô trùng đạt kích thước định, chồi chuyển từ môi trường giai đoạn sang môi trường tạo rễ Thường sau tuần chồi xuất rễ trở thành hoàn chỉnh Môi trường tạo rễ giảm lượng Cytokinin tăng lượng Auxin để tạo ®iỊu kiƯn thn lỵi cho sù rƠ cđa chåi Người ta thường dùng chất NAA (Axit -naphtyl axetic), IBA (Axit β-indol butyric) vµ IAA (Axit β-indol axetic) nồng độ 1mg/lít đến mg/lít để tạo rễ cho hầu hết loài trồng Giai đoạn thường kéo dài từ tuần lễ, sau chuyển sang môi trường Auxin để rễ phát triển giai đoạn nhạy cảm với ẩm độ bệnh tật hoạt động rễ phát sinh yếu, chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng 1.2.5 Đưa môi trường tự nhiên Đây giai đoạn chuyển dần từ ống nghiệm nhà kính trời Cây mô chuyển từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng nên phải tập cho quen dần với môi trường tự nhiên, tránh thay đổi đột ngột làm sốc bị chết Khi đà cứng cáp đạt tiêu chuẩn định chiều cao, số số rễ đưa giá thể Giá thể tiếp nhận in vitro phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng nước bệnh Phải giữ ẩm cho đưa từ bình nuôi ra, cần trì độ ẩm 50% để không nước làm giàn che để tránh ánh sáng mạnh Sau tuần đưa mô sinh trưởng ổn định, chăm sóc mô tương tự chế độ chăm sóc hom từ hạt ... nghiệp: "Nghiên cứu nhân giống số dòng Tếch (Tectona grandis Linn) phương pháp nuôi cấy in vitro Được trí Ban lÃnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống rừng, đề tài thực phòng nghiên cứu nuôi cấy mô... tài Nghiên cứu nhân giống số dòng Tếch phương pháp nuôi cấy in vitro tiến hành Đây nội dung đề tài cấp Nghiên cứu tuyển chọn nhân giống Xoan ta Tếch có suất cao 3 Chương Tổng quan vấn đề nghiên. .. đại học lâm nghiệp Nguyễn thị thuỳ Dương Nghiên cứu nhân giống số dòng tếch (Tectona grandis Linn) phương pháp nuôi cấy in vitro Chuyên ngành: Lâm học Mà số: 60.62.60 Luận văn thạc sĩ khoa học