Nghiên cứu phân lập và chuyển gen nac2 liên quan đến chịu hạn ở cây lạc arachis hypogaea l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– NGUYỄN THỊ THU NGÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN NAC2LIÊN QUAN ĐẾN CHỊU HẠN Ở CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– NGUYỄN THỊ THU NGÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN NAC2 LIÊN QUAN ĐẾN CHỊU HẠN Ở CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học:GS.TS LÊ TRẦN BÌNH THÁI NGUYÊN - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Thị Thu Ngà LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Lê Trần Bình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Chu Hoàng Hà, TS Lê Văn Sơn, TS Phạm Bích Ngọc tồn thể cán phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Nguyễn Thị Tâm tập thể cán Bộ môn Di truyền & Sinh học đại giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, Ban giám hiệu Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên bạn đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành luận án Thái Nguyên, ngày 17 tháng 02 năm 2014 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thu Ngà MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Một tượng thay đổi môi trường ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển thực vật tình trạng hạn.Hạn hán có ảnh hưởng xấu mức độ khác suốt trình hay giai đoạn sống thể thực vật dẫn đến làm giảm suất trồng, chậm phát triển gây chết Hiện giới có khoảng 45% diện tích đất trồng bị hạn hán Tại Việt Nam, 7,3 – 7,4 triệu đất trồng có tới 1,5 – 1,8 triệu bị thiếu nước Nghiên cứu chất tính chống chịu trồng cho thấy tính trạng đa gen Vai trị cụ thể gen riêng rẽ liên quan đến tính chống chịu thực vật(ví dụ P5CS, RD22…) nhiều nghiên cứu tìm hiểu phân tích Tuy nhiên, tác động yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh, không gen riêng rẽ biểu mà hệ thống gen liên quan kích hoạt biểu nhằm đáp ứng với tình trạng bất lợi mà thực vật gặp phải Một số yếu tố kích hoạt hoạt động gen liên quan đến khả chống chịu nhân tố phiên mã (transcription factor – TF) Họnhân tố phiên mã NAC (NAC transcription factor) họ TF đặc trưnglớn hệ genthực vật [106].Nhân tố phiên mãNAC có liên quan đếnnhiều q trình sinh lý quan trọng thể thực vật [99] Nhiều gen NAC tham gia vào phản ứng với áp lực khác từ mơi trường,trong có hạn [87], [113], [133]… Nhiều tác giả nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mãNAC thành cơng vào số loài trồng như: lúa, lúa mỳ, thuốc lá, [54], [55],[60], [77], [87], [103], [127], [133].Trên đối tượng lạc,các gen AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3 liên quan đến tính chịu hạn tách dịng thành cơng [71], AhNAC2 sử dụng để thiết kế vector mang cấu trúc gen chịu hạn chuyển thành công vào Arabidopsis [72] Lạc nông nghiệp ngắn ngày trồng phổ biến giới Ở nước ta, lạc trồng khắp miền phù hợp với nhiều vùng sinh thái khác Tuy nhiên, hạn, mặn, lạnh yếu tố hạn chế sinh trưởng suất trồng có lạc Cây lạc họ đậu, thuộc nhóm chịu hạn [13].Một số kỹ thuật chọn tạo giống có khả chịu hạn lai giống ứng dụng công nghệ tế bào thực vật áp dụng [11], [13], [14], [15].Tuy nhiên, việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tạo giống lạc có khả chịu khơ hạn cịn chưa nghiên cứu nhiều.Từ lí trên, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn lạc (Arachis hypogaea L.)”nhằm thử nghiệm khả chuyển gen thị tiến tới chuyển gen chịu hạn với mục đích tạo dịng chuyển gen phục vụ chọn giống chịu hạn lạc Ứng dụng thực tiễn nghiên cứu nhằm cải tạo lạc cải thiện khả chống chịu đối tượng trồng Mục tiêu nghiên cứu (1) Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc chịu hạn tốt (2) Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 Tạo chuyển gen biểu protein NAC2 thuốc (3) Tạo dịng lạc chuyển gen Phân tích dịng lạc chuyển gen Nội dung nghiên cứu (1) Phân nhóm giống lạc nghiên cứu theo mức độ chịu hạn thông qua đánh giá khả chịu hạn giai đoạn mô sẹo non (2) Phân lập, tách dịng giải trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 liên quan đến tính chịu hạn lạc (3) Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mãNAC2, tạo vi khuẩn A.tumefaciensmang vectortái tổ hợp chuyển vào thuốc mơ hình (4) Xác định có mặt gen chuyển NAC2 thuốc lá, đánh giá khả chịu hạn dòng thuốc chuyển gen thông qua thay đổi hàm lượng proline Phân tích biểu protein tái tổ hợp NAC2 thuốc chuyển gen (5) Phát triển hệ thống tái sinh lạc chuyển gen thị (GUS) qua mô sẹo phôi soma (6) Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2vào lạc, phân tích dịng lạc chuyển gen Những đóng góp luận án i) Tách dịng thành cơng gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc chịu hạn tốt L12 ii) Thiết kế thành công vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 chuyển vào thuốc lá, kết biểu protein chuyển gen chứng minh cấu trúc thiết kế hoạt động tốt thuốc iii) Thông qua hệ thống tái sinh xây dựng, luận án tối ưu hồn thiện quy trình chuyển gen hồn chỉnh thơng qua mô sẹo phôi soma lạc nhằm phục vụ tạo lạc chuyển gen theo mục đích cải thiện khả chống chịu với tình trạng thiếu nước từ môi trường Giống lạc LVT thử nghiệm chuyển gen GUS chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 5.1 Ý nghĩa khoa học i) Kết nghiên cứu luận án cung cấp dẫn liệu khoa học ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm phục vụ việc cải thiện tính chịu hạn lạc ii) Cung cấp thông tin nhân tố phiên mã NAC gen NAC2 lạc Khả chịu hạn giống lạc nghiên cứu vai trò gen NAC2 đáp ứng với thiếu nước từ môi trường 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết đánh giá khả chịu hạn lạc mức độ mô sẹo non sử dụng làm sở để đánh giá ứng dụng biện pháp cải thiện khả chịu hạn lạc Kết thu ban đầu lạc chuyển gen làm để đánh giá mức độ nhằm phục vụ nghiên cứu cải thiện tính chịu hạn lạc Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN THỰC VẬT 1.1.1 Tác động hạn đến thực vật lạc 1.1.1.1 Cây lạc Cây lạc có nguồn gốc vùng Nam Bolivia, Tây bắc Achentina, Nam Mỹ Người Bồ Đào Nha đưa lạc từ Brazin sang Tây Phi sau đến Tây Nam Ấn Độ từ kỉ XVI Sau đem trồng nhiều nước giới Ở Việt Nam, lạc du nhập từ Trung Quốc sang trồng vào khoảng kỉ XVII- XVIII [8], [13] Về mặt phân loại, lạc có tên khoa học Arachis hypogaea (L.) với 2n=40 NST Theo Krapo Vikas số tác giả khác, lạc thuộc họ cánh bướm Fabaceae, thuộc chi Arachis Loài lạc trồng Archis hypogaea (L.) gồm hai loài phụ: Loài phụ Hypogaea gồm hai chủng: Hypogaea loại hình Virginia Bersuta kohter Lồi phụ Fastigiata gồm hai chủng: Fastigiata loại hình Valencia Vulgaris harz loại hình Spanish Về hình thái, lạc gồm phận rễ, thân, lá, hoa lạc Rễ lạc có rễ cọc rễ Trên rễ lạc có nhiều nốt sần tạo thành vi khuẩn Rhizobium sống cộng sinh, lạc có khả cố định nitơ phân tử khơng khí thành đạm cung cấp cho đất trồng Những nốt sần tăng nhanh số lượng kích thước từ lạc có - đến lúc nở hoa.Thân lạc thường cao khoảng 25cm - 50cm Lá lạc loại kép hình lơng chim có chét mọc đối nhau, hình trái xoan ngược, có kèm hình dải nhọn bao quanh thân Trên thân thường có khoảng 20 Khi lạc có - thân lạc bắt đầu phân hố mầm hoa Hoa lạc mọc từ mắt cành Mỗi vị trí có từ - hoa, lạc có - hoa nở Lạc loại tự thụ phấn nghiêm ngặt, thấy hoa nở thụ phấn xong Hoa lạc sau thụ phấn đâm tia xuống đất hình thành (thường gọi củ) Quả lạc có hình trụ thn thắt lại hạt, vỏ cứng có gân mạng Mỗi có - hạt Hạt hình trứng, có vỏ lụa màu đỏ, vàng, cánh sen trắng [13] Theo thời gian sinh trưởng lạc, người ta chia làm giống chín sớm (thời gian sinh trưởng 90 ngày - 125 ngày) giống chín muộn (140 ngày - 160 ngày) Cây lạc địi hỏi khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cho sinh trưởng phát triển lạc từ 240C - 330C Nhiệt độ để hạt nảy mầm thấp phải 120C, từ 150C hạt lạc bắt đầu nảy mầm tốt, 170C hoa không thụ phấn, yêu cầu độ ẩm từ 60% - 70%, độ ẩm thấp 60% kéo dài thời gian nảy mầm hạt không nảy mầm độ ẩm đất 40% - 50% Đất trồng lạc lí tưởng phải đất thoát nước nhanh, chân đất nhẹ, thống, có màu sáng, tơi xốp, phù sa pha cát có đầy đủ canxi lượng chất hữu vừa phải tạo điều kiện cho lạc nảy mầm, dễ dàng ngoi lên mặt đất sinh trưởng, hình thành tốt, độ pH đất từ 6-7 thích hợp [13] Cây lạc coi trồng có hiệu kinh tế cao có giá trị đa dạng mặt dinh dưỡng, chăn nuôi, trồng trọt cơng nghiệp Diện tích trồng lạctập trung nhiều vùng Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh tới đồng trung du Bắc Bộ (Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình) Trên thực tế, diện tích trồng lạc nước ta cịn nhỏ phân tán, trừ vài vùng lạc tập trung Diễn Châu (Nghệ An), Hậu Lộc (Thanh Hoá) Gần lạc khuyến khích phát triển mạnh, đặc biệt nơi đất bạc màu, thoái hoá vùng trung du đồng Bắc Bộ, dải đất ven biển từ Thanh Hoá chạy dài tới giáp Đơng Nam Bộ,… trồng lạc Nhiều vùng đất, miền Nam trồng vụ lạc năm [13] 1.1.1.2 Tác động hạn đến thực vật Hạn yếu tố cực đoan phi sinh học quan tâm đến nhiều Hiện tượng khô hạn xảy mơi trường đất khơng khí thiếu nước đến mức áp suất thẩm thấu không cạnh tranh để lấy nước vào tế bào Trong trường hợp này, tác động môi trường bên lớn, gây ảnh hưởng đáng kể lên phát triển thực vật, dẫn đến hủy hoại cối mùa[7], [23], [27], [36] Các yếu tố bất lợi mơi trường là: nhiệt độ cao, gió nóng, thời tiết khí hậu.Khái niệm hạn dùng để tình trạng 10 nước Khả thực vật giảm thiểu mức tổn thương thiếu hụt nước gây gọi tính chịu hạn [7] Xu thayđổi khí hậu làm cho hạn hán bất thường xảy nhiềunơi, nguyên nhân làm giảm suất trồng [94] Theo FAO, ước tính có 70% tiềm suất bị điều kiện bất lợi môi trường sâu bệnh hại, quốc gia có nềnnơng nghiệp phát triển Hiện giới có khoảng 45% diện tích đất trồng bị hạn hán [45] Tại Việt Nam, 7,3-7,5 triệu đất trồng có tới 1,5-1,8 triệu thiếu nước Khi gặp hạn, trạng thái chất nguyên sinh tế bào thay đổi mạnh, ảnh hưởng đến tính chất hố lý chất ngun sinh tính thấm, mức độ thuỷ hố keo, thay đổi pH, độ nhớt, cuối ảnh hưởng đến trình trao đổi chất bình thường thể Hạn ảnh hưởng xấu đến trình hình thành diệp lục, phá hoại lục lạp nên hiệu suất quang hợp giảm xuống nhanh chóng Hạn ảnh hưởng đến hoạt động hút khống rễ, dẫn đến tình trạng thiếu nguyên tố dinh dưỡng quan trọng trình trao đổi tổng hợp chất hữu khác thể thực vật [28], [36], [45] Để chống khô hạn, giữ khơng bị nước, giảm diện tích lá, rút ngắn chu kì sống.Bất kỳ nước dẫn đến tượng thiếu hụt nước tế bào Nước vừa nguyên liệu, vừa môi trường để phản ứng trao đổi chất xảy Vì vậy, vi phạm chế độ nước ảnh hưởng lớn đến trình sinh trưởng phát triển Về tác động hạn đến thực vật, nhà khoa học tập trung nghiên cứu theo hướng: khảo sát tính chịu hạn đối tượng thực vật điều kiện tự nhiên đồng ruộng điều kiện nhân tạo phịng thí nghiệm Nhiều trồng ngơ, lúa, đậu tương, lạc…đã nhà nghiên cứu đánh giá, khảo sát đặc tính chịu hạn thơng qua điều kiện tự nhiên đồng ruộng Một phương pháp sử dụng chủ động gây thiếu nước tiến hành nghiên cứu phản ứng thể thực vật điều kiện [5].Khi gặp hạn, lạc chịu ảnh hưởng nặng nề đến trình sinh trưởng phát triển Khi tiến hành nghiên cứu tự nhiên phương pháp gây hạn nhân 113 Nguyễn Thị Thu Ngà, Lê Trần Bình (2011), “Phân nhóm giống lạc theo khả chịu hạn khác nhau”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, 167, tr 48-54 2.Nguyễn Thị Thu Ngà, Lê Trần Bình (2012), “Nghiên cứu khả tái sinh biến nạp gen lạc (Arachis hypogaea L.) thơng qua mơ sẹo hóa phơi soma“, Tạp chí Sinh học, 34(3), tr 370-376 3.Nguyễn Thị Thu Ngà, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Bành Thị Mai Anh (2013), “Tách dịng, giải trình tự đặc điểm transcription factor NAC2 lạc (Arachis hypogaea L.)“, Tạp chí Sinh học, 35(2), tr 234-242 Nguyễn Thị Thu Ngà, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2013), “Thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 điều khiển tính chống chịu hạn lạc”, Hội nghị khoa học Cơng nghệ Sinh học tồn quốc 2013, tr 935 – 939 Cơng bố 01 trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC (NAC2) Ngân hàng gen quốc tế (1) Nguyen NgaT.T., Le SonV., Pham NgocB and Le BinhT (2012), Arachis hypogaea mRNA for NAC2 transcription factor (NAC2 gene), cultivar L12, EMBL, GenBank, Accession HF546358 TÀI LIỆU THAM KHẢO 114 Tiếng Việt Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phịng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003), “Mối tương quan hàm lượng proline tính chống chịu lúa”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 1(1), tr 85-93 Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen (động vật, thực vật), NXB Đại học Sư phạm, Huế Trương Vĩnh Hải, Trần Kim Định, Nguyễn Thế Hùng, Bùi Xuân Mạnh, Nguyễn Văn Đoan, Trương Quốc Ánh, Lý Hậu Giang, Bùi Chí Bửu (2011), “Phân tích nguồn vật liệu chọn giống ngơ chịu hạn cho tỉnh phía Nam”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn, 8, tr 21-27 James C (2011), Tình trạng chuyển gen/ trồng CNSH đưa vào canh tác đại trà tồn giới năm 2011, Báo cáo tóm tắt số 35 ISAAA: Ithaca, New York Trần Thị Phương Liên (2010), Protein tính chống chịu thực vật, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Nguyễn Văn Mã (2004),Ảnh hưởng thiếu nước tới khả quang hợp lạc, Báo cáo khoa học - Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, tr 504 – 507 Chu Hồng Mậu, Ngơ Thị Liêm, Nguyễn Thị Tâm (2006), Đánh giá khả chịu hạn số giống lạc bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, Hội nghị Khoa học Toàn quốc, tr 202 – 209 10 Chu Hoàng Mậu, Đinh Thị Ngọc, Bùi Thị Tuyết, Phạm Thị Thanh Nhàn (2008), “Nghiên cứu khả chịu hạn tách dòng gen chaperonin mộtsố giống đậu tương địa phương vùng Tây Ngun”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(1), tr 81-90 115 11 Nguyễn Thị Tâm, Chu Hồng Mậu, Ngơ Thị Liêm, Bùi Thị Hồi Loan (2006), “Nghiên cứu mơi trường ni cấy in vitro phơi lạc phục vụ nghiên cứu chọn dịng chịu hạn”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Đại học Thái Nguyên, 1(37), tr 87 – 92 12 Bùi Văn Thắng, Đinh Thị Phịng, Chu Hồng Hà (2004), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh lạc (Arachis hypogaea L.) phục vụ cho chuyển gen”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2(3), tr 371 – 379 13 Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006), Kĩ thuật trồng chăm sóc lạc, NXB Lao động, Hà Nội, tr – 43 14 Vũ Thị Thu Thủy, Đinh Tiến Dũng, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2010), “Kết chọn lọc số dịng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu nước giống lạc L18”, Tạp chí KH & CN– Đại học Thái Nguyên, 72(10), tr 122-126 15 Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hồng Mậu (2009), “Chọn dịng tế bào chịu hạn lạc (Arachis hypogaea L.) phương pháp nuôi cấy invitro”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển Nơng thơn, 7, tr 14-19 16 Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2011), “Nghiên cứu đặc điểm trình tự gen cystatin số dịng lạc có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu chiếu xạ xử lý nước”, Tạp chí Sinh học, 33(1), tr 86-95 17 Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết nghiên cứu thực nghiệm nơng lâm ngư nghiệp máy vi tính, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội Tiếng Anh 18 Abe H., Shinozaki Y., Urao T., Hosokawa D., Shinozaki K (2008), “Role of Arabidopsis MYC and MYB Homologs in Drought-and Abscisic AcidRegulated Gene Expression”, The Plant cell, 9(10), pp 1859-1868 19 Agarwal P K., Jha B (2010), “Transcription factors in plants and ABA dependent and independent abiotic stress”, Biol Plant., 54, pp 201-212 116 20 Ahmad R., Kim M D., Back K H., Kim H S., Lee H S., Kwon S Y., Murata N (2008), “Stress-induced expression of cholin oxidase in potato plant chloroplast confer enhanced tolerance to oxidative, salt and drought stresses”, Plant Cell Rep., 27, pp 687-698 21 Akasaka Y., Hiroyuki D., Masahiro M (2000), “Improved plant regeneration from cultured leaf segments in peanut (Arachis hypogaea L.) by limited exposure to thidiazuron”, Plant Sci., 156, pp 169–175 22 Akin P O., Anderson W F., Holbrook C C (2002), “Somatic embryogenesis in Arachis hypogaea L.: genotype comparison”, Plant Sci., 83, pp 103-111 23 Ashraf M (2010), “Inducing drought tolerance in plants: recent advances”, Biotechnol.Adv., 28, pp 169-183 24 Athmaram T N., Geetha B., Devaiah K M (2006), “Integration and expression of luetongue VP2 gene in somatic embryos of peanut through particle bombardment method”, Vaccine, 24, pp 2994–3000 25 Baker C M., Wetzstein H Y (2002), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaftets of peanut, Arachis hypogaeaL.”, Plant Cell Rep., 11, pp 71-75 26 Bates L S (1973), “Rapid determination of free proline for water stress studies”,Plant Soil., 39, pp 205-207 27 Beatriz X C., Francisco A R O., Leonardo F E (2011), “Drought tolerance in crop plants”, Plant Physiol., 56, pp 1-16 28 Beck E H., Fettig S., Knake C., Hartig K., Bhattarai T (2007), “Specific and unspecific responses of plants to cold and drought stress”, J Biosci., 32, pp 501–510 29 Beena M R., Jami S K., Srinivasan T., Swathi A T., Padmaja G., Kirti P B (2005), “Efficient direct shoot regeneration from cotyledonary node explants of peanut (Arachis hypogaea L cv JL-24)”, Plant Physiol., 10, pp 205-210 30 Bhatnagar M P., Devi M J., Reddy D S., Lavanya M., Vadez V., Serraj R., (2007), “Stress-inducible expression of at DREB1A in transgenic peanut 117 (Arachis hypogaea L.) increases transpiration efficiency under water-limiting conditions”, Plant Cell Rep, 26, pp 2071-2082 31 Boontang S., Girdthai T., Jogloy S., Vorasoot N (2010), “Responses of Released cultivars of peanut to terminal drought for traits related to drought tolerance”, Plant Sci., 9(7), pp 423-431 32 Bu Q (2008), “Role of the Arabidopsis thaliana NAC transcription factors ANAC019 and ANAC055 in regulating jasmonic acid-signaled defense responses”, Cell Res., 18, pp 756–767 33 Charu L., Yadav A., Prasad M (2012), Role of Plant Transcription Factors in Abiotic Stress Tolerance,National Institute of Plant Genome Research, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi, India 34 Chen Q (2011), “A structural view of the conserved domain of rice stressresponsive NAC1”, Protein Cell, 2, pp 55–63 35 Chengalrayan K., Hazra S., Gallo M M (2001), “Histological analysis of somatic embryogenesis and organogenesis induced from mature zygotic embryo-derived leaflets of peanut (Arachis hypogaea L.)”, Plant Sci., 161, pp 415–421 36 Cheruth A J., Paramasivam M., Abdul W (2009), “Drought stress in Plants: A review on morphological characteristics and pigments composition”, J.Agricul and Biol., 11, pp 100-105 37 Cutler S R., Rodriguez P L., Finkelstein R R., Abrams S R (2010), “Abscisic acid: Emergence of a core signaling network”, Plant Biol., 61, pp 651-679 38 Delessert C (2005), “The transcription factor ATAF2 represses expression of pathogenesis-related genes in Arabidopsis”, Plant, 43, pp 745–757 39 Devaiah M K., Hemanth K N., Ramesh K A A., Sheikh M B., (2011), “Impact of drought stress on peanut (Arachis hypogaea L.) productivity and food safety”, Plants and Environ., pp 779-786 40 Devi M J., Sinclair T R., Vadez V., Krishnamurthy L (2009), “Peanut genotypic variation in transpiration efficiency and decreased transpiration 118 during progressive soil drying”, Field Crops Res., 114, pp 280–285 41 Diop N N., Repellin A., Lameta A (2004), “A mulicystatin is induced by drought-stress in cowpea leaves”, FEBS Lett., 577(3), pp 545-550 42 Eliane G V., Ivan S., Marcos P., Carlos A S Hugo B C M (2007), “Stressinduced synthesis of proline confer tolerance to water deficit in transgenic wheat”, Plant Physiol., 164(10), pp 1367-1376 43 Ernst H A (2004), “Structure of the conserved domain of ANAC, a member of the NAC family of transcription factors”, EMBO Rep., 5, pp 297–303 44 Fang Y (2008), “Systematic sequence analysis and identification of tissuespecific or stress-responsive genes of NAC transcription factor family in rice”, Mol Genet Gen., 280, pp 535–546 45 Farooq M., Wahid A., Kobayashi N., Fujita D., Basra S M A (2009), “Plant drought stress: effects, mechanisms and management”, Agron Sustain Dev., 29, pp 185–212 46 Fujita M., Fujita Y., Kyonoshin M., Seki M., Hiratsu K., Tran L S P., Shinozaki K Y., Shinozaki K (2004), “A dehydration induced NAC protein, RD26, is involved in a novel ABA-dependent stress-signaling pathway”, Plant, 39, pp 863–876 47 Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Mohammad M., Seki M., Shinozaki K., Shinozaki K (2005), “AREB1 Is a Transcription Activator of Novel ABRE-Dependent ABA Signaling That Enhances Drought Stress Tolerance in Arabidopsis”, The Plant Cell, 17, pp 3470-3488 48 Gao S., Zhang H., Tian Y., Li F., Zhang Z (2008), “Expression of TERF1 in rice regulates expression of stress-responsive genes and enhances tolerance to drought and high-salinity”, Plant Cell Rep., 27, pp 1787-1795 49 Geng L., Lihong N., Changlong S., Fuping S., Dafang H., Jie Z (2011), “High-efficiency regeneration of peanut (Arachis hypogaea L.) plants from leaf discs”, J Biotechnol., 10(59), pp 12650-12652 50 Hamidou F., Ratnakumarc P., Haliloua O., Mpondad O., Kapewae T., Monyoe E., Fayef I., Ntareg B R., Nigam S N., Upadhyayac H D., Vadezc 119 V (2012), “Selection of intermittent drought tolerant lines across years and locations in the reference collection of groundnut (Arachis hypogaea L.)”, Field Crops Res., 126, pp 189–199 51 Hao Y J (2010), “Plant NAC-type transcription factor proteins contain a NARD domain for repression of transcriptional activation”, Planta, 232, pp 1033–1043 52 Hao Y J (2011), “Soybean NAC TF promote abiotic stress tolerance and lateral root formation in transgenic plants”, Plant J., 68, pp 302–313 53 Hegedus D., Yu M., Baldwin D., Gruber M., Sharpe A., Parkin I., Whitwill S., Lydiate D (2003), “Molecular characterization of Brassica napus NAC domain transcriptional activators induced in response to biotic and abiotic stress”, Plant Mol Biol., 53, pp 383-397 54 Hu H., Dai M., Yao J., Xiao B., Li X., Zhang Q., Xiong L (2006), Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 103, pp 12987–12992 55 Hu H., You J., Fang Y., Zhu X., Qi Z., Xiong L (2008), “Characterization of transcription factor gene SNAC2 conferring cold and salt tolerance in rice”, Plant Mol Biol., 67, pp 169-181 56 Huang B., Jin L., Liu J Y (2007), “Molecular cloning and functional characterization of a DREB1/CBF-like gene (GhDREB1L) from cotton”, Life Sci., 50(1), pp 7-14 57 Hui P., Hui-Ying., Xin-Wang Y., Qing-Hua S., Hua Z (2009), “Characterization of a chickpea NAC family gene, CarNAC5, which is both developmentally and stress-regulated”, Plant Physiol Biochem., 47(11-12), pp 1037-1045 58 Jefferson R A., Kavanagh T A., Bevan M W (1987), “GUS fusion: βglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants”, EMBO, 6, pp 3901-3907 59 Jensen M K (2010), “The Arabidopsis thaliana NAC transcription factor 120 family: structure-function relationships and determinants of ANAC019 stress signalling”, Biochem J., 426, pp 183–196 60 Jeong J S (2010), “Root-specific expression of OsNAC10 improves drought tolerance and grain yield in rice under field drought conditions”, Plant Physiol., 153, pp 185–197 61 Jimenez V M (2001), “Regulation of in vitro somatic embryogenesis with emphasis on the role of endogenous hormones”, Rev, Bras Fisiol Veg., 13, pp 196–223 62 Jongrungklang B., Toomsana N., Vorasoota S., Jogloya, Booteb K J., Hoogenboomc G., Patanothai A (2013), “Drought tolerance mechanisms for yield responses to pre-flowering drought stress of peanut genotypes with different drought tolerant levels”, Field Crops Res., 144, pp 34–42 63 Kazuo N., Hironori T., Junya M., Kazuo S., Kazuko Y S (2012), “NAC transcription factors in plant abiotic stress responses”, Biochim Biophys Acta,1819(2), pp 97–103 64 Khandelwal A., Vally K J M., Geeta N., Shaila M S (2003), “Engineering hemagglutinin (H) protein of rinder pest virus into peanut (Arachis hypogaea L.) as a possible source of vaccine”, Plant Sci., 165, pp 77-84 65 Kim T H., Bohmer M., Hu H., Nishimura N (2010), “Guard cell signal transduction network: Advances in understanding abscisic acid, CO2, and Ca2+ signaling”, Plant Biol., 61, pp 561–591 66 Kosmas S A., Argyrokastritis A., Loukas M G., Eliopoulos E., Tsakas S., Kaltsikes P J (2006), “Isolation and characterization of drought related trehalose 6-phosphate-synthase gene from cultivated cotton (Gossypium hirsutum L.)”, Planta, 223, pp 329–339 67 Kulkarni M., Deshpande U (2007), “In vitro screening of tomato genotypes for drought resistance using PEG”, J.Biotechnol., 18, pp 691-696 68 Le D T (2011), “Genome-wide survey and expression analysis of the plantspecific NAC transcription factor family in soybean during development and dehydration stress”, DNA Res., 18, pp 263–276 121 69 Lee S C., Hwang B K (2008), “Functional role of the pepper antimicrobial protein gene , CaAMP1, in ABA signaling and salt and drought tolerance in Arabidopsis”, Planta, 229, pp 383-391 70 Little E L., Magbanua Z V., Parrott W A (2000), “Aprotocol for repetitive somatic embryogenesis from mature peanut epicotyls”, Plant Cell Rep., 19, pp 351-357 71 Liu X., Li L (2009),“Cloning and Characterization of the NAC-Like Gene AhNAC2 and AhNAC3 in Peanut”, Acta Agron Sin., 35(3), pp 541−545 72 Liu X., Hong L., Li X Y., Yao Y., Hu B., Li L (2011), “Improved drought and salt tolerance in transgenic Arabidopsis overexpressing a NAC transcriptional factor from Arachis hypogaea”,Biosci Biotechnol Biochem., 75(3), pp 443-450 73 Mahajan S., Tuteja N (2005), “Cold, salinity and drought stress: An overview”, Biochem Biophys., 444, pp 139-158 74 Mao X., Zhang H., Qian X., Ang L., Guangyao Z., Ruilian J (2012), “TaNAC2, a NAC-type wheat transcription factor conferring enhanced multiple abiotic stress tolerances in Arabidopsis”, J Exper Bot., 63(8), pp 2933–2946 75 Muhammad W., Asghar A., Tahir M., Nadeem M A., Ayub M., Asif T., Ahmad R., Hussain M (2011), “Mechanism of drought tolerance in plant its management through different methods”, J Agricul Sci., (1), pp 10 – 25 76 Nakashima K., Ito Y., Shinozaki Y K (2009), “Transcriptional Regulatory Networks in Response to Abiotic Stresses in Arabidopsis and Grasses”, Plant Physiol., 149, pp 88–95 77 Nakashima K., Tran L S P, Nguyen D V., Fujita M., Maruyama K., Todaka D., Ito Y., Hayashi N., Shinozaki K., Shinozaki Y K (2007), “Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice”, The Plant J., 51, pp 617630 78 Nakashima K (2012), “NAC transcription factors in plant abiotic stress 122 responses”, Biochim Biophys Acta, 11, pp 10-15 79 Nigam S N., Nageswara R R C., Wright G C (2002), Field Screening for Drought Tolerance in Groundnut, In: Field Screening for Drought Tolerance Proceedings of an International Workshop on International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics , India, pp 147-151 80 Olhoft P M., Flagel L E., Donovan C M., Somers D A (2003), “Efficient soy-bean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonarynode method”, Planta, 216, pp 723-735 81 Olsen A N (2005), “NAC transcription factors: Structurally distinct, functionally diverse”, Trends Plant Sci., 10, pp 79–87 82 Olsen A N (2005), “DNA-binding specificity and molecular functions of NAC transcription factors”, Plant Sci., 169, pp 785–797 83 Olsen A N (2004), “Preliminary crystallographic analysis of the NAC domain of ANAC, a member of the plant-specific NAC transcription factor family”, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., 60, pp 112–115 84 Painawadee M., Jogloy S., Kesmala T., Patanothai A (2009), “Heritability and Correlation of Drought Resistance Traits and Agronomic Traits in Peanut (Arachis hypogaea L.)”, Asian J Plant Sci., 8, pp 325-334 85 Philips G C., Gamborg O L (2005), Plant cell tissue and organ culture, Community centre, New Delhi, India, pp 91- 93 86 Pierik R., Sasidharan R (2007), “Growth control by ethylene: adjusting phenotypes to the environment”, J Plant Growth Regul., 26, pp 188–200 87 Pinheiro G L., Marques C S., Costa M L., Reis P A., Alves M S., Carvalho C M., Fietto L G., Fontes E P (2009), “Complete inventory of soybean NAC transcription factors: Sequence conservation and expression analysis uncover their distinct roles in stress response”, Gene, 444, pp 10-23 88 Puranik S (2011), “Molecular cloning and characterization of a membrane associated NAC family gene, SiNAC from foxtail millet [Setaria italica (L.) P Beauv.]”, Mol Biotech., 49, pp 138–150 123 89 Qiusheng Z., Bao J., Likuun L., Xianhua X (2005), “Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea L.) explants by Agrobacterium tumefaciens”, Plant Cell Tiss Organ Cult., 81, pp 83-90 90 Quan R D., Shang M., Zhang H., Zhang J (2004), “Improved chilling tolerance by transformation with betA gene for the enhancement of glycinebetaine synthesis in maize”, Plant Sci., 166, pp 141–149 91 Ramesh K., Sheikh M B., Hemanth K N (2007), “Identification of drought tolerant groundnut genotypes employing proteomics approach”, J SAT Agricul Res., 5(1), pp 156-166 92 Reddy T Y., Reddy V R., Anbumozhi V (2003), “Physiological Responses of Groundnut (Arachis hypogea L.) To Drought Stress and Its Amelioration: A Critical Review”, Plant Growth Regul., 41, pp 75–88 93 Rohini V K., Rao K S (2001), “Transformation of peanut (Arachis hypogaea L.) with tobacco chitinase gene: variable response of transformants to leaf spot disease”, Plant Sci., 160, pp 889–898 94 Rorat T (2006), “Plant dehydrins – Tissue location, structure and function”, Cell Mol Biol Lett., 11(4), pp 536-541 95 Sakuma Y., Maruyama K., Osakabe Y., Qin F (2006), “Functional analysis of an Arabidopsis transcription factor, DREB2A, invovled in droughtresponsive gene expression”, The Plant Cell, 18, pp 1292-1309 96 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 97 Sarker R H., Nahar M (2003), “Stable expression of GUS (β-glucuronidase) gene following Agrobacterium-mediated transformation of peanut (Arachis hypogaea L.)”, Bangala J Bot., 32(1), pp 23-31 98 Seo P J (2008), “Membrane-bound transcription factors in plants”, Trends Plant Sci., 13, pp 550–556 99 Shan W., Kuang J., Chen L., Xie H., Peng H (2012), “Molecular characterization of banana NAC transcription factors and their interactions 124 with ethylene signalling component EIL during fruit ripening”, J Exp Bot., 63(14), pp 5171–5187 100 Sharma K K., Anjaiah V (2000), “An efficient method for the production of transgenic plants of peanut (Arachis hypogaea L.) through Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation”, Plant Sci., 159, pp 7-19 101 Shinozaki K., Shinozaki K Y (2004), “Gene networks involved in drought stress response and tolerance”, Plant Physiol., 13, pp 63-68 102 Singh S., Hazra S (2009), “Somatic embryogenesis from axillary meristems of peanut (Arachis hypogea L.)”, Plant Biotechnol Rep., 3, pp 333–340 103 Song S Y (2011), “Physiological mechanisms underlying OsNAC5dependent tolerance of rice to abiotic stress”, Planta, 234, pp 331–345 104 Songsri P., Jogloy S., Vorasoot N., Holbrook C C (2008), “DROUGHT STRESS: Root Distribution of Drought-Resistant Peanut Genotypes in Response to Drought”, J Agron Crop Sci., 194, pp 92-103 105 Swathi A T., Jami S K., Datla R S., (2006), “Genetic transformation of peanut (Arachis hypogaea L.) using cotyledonary node as explant and a promoterless gus::nptII fusion gene based vector”, J Biosci., 31, pp 235-246 106 Swati P., Pranav P S., Prem S S (2012), “NAC proteins: regulation and role in stress tolerance”, Trends Plant Sci., 7(6), pp 369–381 107 Svensson J., Ismail A M., Palva E T., Close T J (2002), “Dehydrins, in:Storey Cell and Molecular Responses to stress, Sensing, Signalling and Cell Adaptation”, Elsevier Sci., 3, pp 155–171 108 Szabados L., Savoure A (2009), “Proline: a multifunctional amino acid”, Trends Plant Sci., 15, pp 89-97 109 Taiz L., Zeiger E (2006), Plant Physiology 4th Ed., Sinauer Associates Inc Publishers, Massachusetts 110 Takasaki H (2010), “The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor OsNAC5 regulates stress-inducible genes and stress tolerance in rice”, Mol Genet Gen., 284, pp 173–183 125 111 Tiwari S., Mishra D K., Singh A., Singh P K (2008), “Expression of a synthetic cry1EC gene for resistance against Spodoptera litura in transgenic peanut (Arachis hypogaea L.)”, Plant Cell Rep., 27, pp 1017-1025 112 Tomader E., Christophe B G., Hayat E., Jamal A., (2006), “Growth, proline and ion accumulation in sugarcane callus cultures under drought-induced osmotic stress and its subsequent relief”, J Biotechnol., 5(16), pp 14881493 113 Tran L S P., Nakashima K., Sakuma Y., Simpson S D., Fujita Y., Maruyama K., Fujita M., Seki M., Shinozaki K (2004), “Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a droughtresponsive cis-element in the early responsive to dehydration stress promoter”, The Plant Cell, 16, pp 2481-2498 114 Tran L S., Nakashima K., Sakuma Y., Osakabe Y., Qin F., Simpson S D., Maruyama K., Fujita Y., Shinozaki K., Shinozaki Y K (2007), “Coexpression of the stressinducible zinc finger homeodomain ZFHD1 and NAC transcription factors enhances expression of the ERD1 gene in Arabidopsis”, The Plant J., 49, pp 46–63 115 Tran L S P (2009), “Molecular characterization of stress-inducible GmNAC genes in soybean”, Mol Genet Gen., 281, pp 647–664 116 Udvardi M K., Kakar K., Wandrey M., Montanri O., Murray J., Andraiankaja A., Zhang J Y., Benedito V (2007), “Legume transcription factors:global regulators of plant development and response to the environment”, Plant Physiol., 144, pp 538-549 117 Venkatachalam P., Kavipriya V (2012), Efficient Method for In Vitro Plant Regeneration from Cotyledonary Node Explants of Peanut (Arachis hypogaea L.), International Conference on Nuclear Energy, Environmental and Biological Sciences (ICNEEBS'2012) Bangkok (Thailand), pp 52-55 118 Verma A., Malik C P., Gupta V K., Sinsinwar Y K (2009), “Response of Groundnut Varieties to Plant Growth Regulator (BAP) to Induce Direct Organogenesis”, J Agricul Sci., 5(3), pp 313-317 126 119 Wahid A., Gelani S., Ashraf M., Foolad M R (2007), “Heat tolerance in plants: an overview”, Environ Exp Bot., 61, pp 199–223 120 Wang L F., Zhang W C., Wang L., Zhang X C., Rao Z (2010), “Crystal structures of NAC domains of human nascent polypeptide - associated complex (NAC) and its alpha NAC subunit”, Protein Cell, 1, pp 406 – 416 121 Wingler A (2002), “The function of trehalose biosynthesis in plants”, Phytochem., 60, pp 437– 440 122 Wu Y (2009), “Dual function of Arabidopsis ATAF1 in abiotic and biotic stress responses”, Cell Res., 19, pp 1279–1290 123 Xia N., Zhang G., Liu X Y., Cai G L., Zhang Y., Wang X J., Zhao J., Huang L L (2010), Characterization of a novel wheat NAC transcription factor gene involved defense response against stripe rust pathogen infection and abiotic stresses”, Mol Biol Rep., 37, pp 3703-3712 124 Xiao B., Huang Y., Tang N., Xiong L (2007), “Ober-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions”, Theor Applied Gen., 115(1), pp 35-46 125 Xie Q., Frugis G., Colgan D., Chua N H (2000), “Arabidopsis NAC1 transduces auxin signal downstream of TIR1 to promote lateral root development”, Genes Develop., 14, pp 3024-3036 126 Xu Z X., Ni Z Y., Liu L., Nie L N., Li N C., Chen M., Ma Y Z (2008), “Characterization of the TaAIDFa gene encoding a CRT/DRE-binding factor responsive to drought, high-salt and cold stress in wheat”, Mol Gen Gen., 280, pp 497-508 127 Xue G P (2011), “Overexpression of TaNAC69 leads to enhanced transcript levels of stress up-regulated genes and dehydration tolerance in bread wheat”, Mol Plant, 4, pp 697–712 128 Yamada M., Morishita H., Urano K., Shiozaki N., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K., Yoshiba Y (2005), “Effects of free proline accumulation in petunias under drought stress”, J Exp Bot., 56, pp 1975–1981 129 Yang J., Zhang J., Liu K., Wang Z (2007), “Involvement of polyamines in 127 the drought resistance of rice”, J Exp Bot., 58, pp 1545–1555 130 Zhang X., Zhang Z., Chen J., Chen Q., Wang X., Huang R (2005), “Expressing TERF1 in tobacco enhances drought tolerance and abscisic acid sensitivity during seedling development”, Planta, 222, pp 494–501 131 Zhang F., Niu B., Wang Y C., Chen F., Wang S H., Xu Y., Jiang L D (2008), “A novel betain aldehyde dehydrogenase gene from Jatropa curcas, encoding an enzyme implicated in adaptation to environmental stress”, Plant Sci., 174, pp 510-518 132 Zhang X., Liu S., Takano T (2008), “Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance”, Plant Mol Biol., 68(1-2), pp 131-143 133 Zheng X., Chen B., Lu G., Han B (2009), “Overexpression of a NAC transcription factor enhances rice drought and salt tolerance”, Biochem Biophys Res., 379, pp 985-989 134 Ziemienowicz A (2001), “Odyssey of Agrobacterium T-DNA”, Acta Biochim.Pol., 48(3), pp 623-635 ... nhiều.Từ l? ? trên, chúng tơi tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu phân l? ??p chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn l? ??c (Arachis hypogaea L. )”nhằm thử nghiệm khả chuyển gen thị tiến tới chuyển gen chịu hạn. ..2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– NGUYỄN THỊ THU NGÀ NGHIÊN CỨU PHÂN L? ??P VÀ CHUYỂN GEN NAC2 LIÊN QUAN ĐẾN CHỊU HẠN Ở CÂY L? ??C (Arachis hypogaea L. ) Chuyên ngành:... thiện khả chịu hạn l? ??c Kết thu ban đầu l? ??c chuyển gen l? ?m để đánh giá mức độ nhằm phục vụ nghiên cứu cải thiện tính chịu hạn l? ??c 8 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN THỰC