Đánh giá khả năng chịu hạn và so sánh gen dreb5 của một số giống đậu tương địa phương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BẾ BÍCH ĐÀO ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ SO SÁNH GEN DREB5 CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BẾ BÍCH ĐÀO ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ SO SÁNH GEN DREB5 CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNG Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS CHU HOÀNG MẬU THÁI NGUYÊN - 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill), cơng nghiệp ngắn ngày, có giá trị dinh dưỡng kinh tế cao Hạt đậu tương chứa 30% 56% protein, chứa 12% - 25% lipid, chứa 36% - 40% hydrat cacbon loại amino acid cần thiết cho thể người như: cystein, lysine, triptophan, leucine, methyonine… Ngồi đậu tương cịn chứa nhiều loại vitamin (B1, B2, C, D, E, K…) cần thiết cho thể người động vật Một đặc tính quan trọng đậu tương có nốt sần rễ tạo khả cố định nitơ khơng khí Vì vậy, trồng đậu tương góp phần cải tạo đất bảo vệ mơi trường Trên phương diện hóa sinh, đậu tương loại hạt đánh giá đồng thời protein lipid Protein hạt đậu tương có phẩm chất tốt hồn tồn thay đạm động vật bữa ăn hàng ngày người Sử dụng y học tránh tượng suy dinh dưỡng trẻ em, cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho động vật non tốt Cây đậu tương phân bố từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới, từ độ cao thấp so với mực nước biển đến độ cao gần 2000 m phân bố rộng rãi từ 55 vĩ độ Bắc đến 55 vĩ độ Nam, với diện tích đạt khoảng 74,7 triệu Ở Việt Nam đậu tương gieo trồng vùng nông nghiệp nước, vùng núi phía bắc có diện tích gieo trồng lớn (46,6%), đồng Sơng Hồng (19,3%), vùng Tây Nguyên (11%), miền Đông Nam Bộ (10,2%), đồng Sông Cửu Long (8,9%), khu Bốn (2,3%) vùng Duyên Hải Miền Trung (1,6%) [2] Nước ta có hệ sinh thái đa dạng, khí hậu vùng, khơng giống nhau, vấn đề thích ứng trồng với điều kiện ngoại cảnh vấn đề có tầm quan trọng định phát triển ngành trồng trọt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Các nghiên cứu lĩnh vực nông nghiệp cho thấy tổng sản lượng lương thực giới đạt 20% tiềm di truyền Nguyên nhân cho stress mơi trường tác động lên trồng, hạn nước, hạn mặn lạnh gây lên nước nội bào mơ thực vật [11] Trước thực trạng đó, cơng tác chọn, tạo nhân giống giống đậu tương có kiểu gen chống chịu ngày quan tâm, tính chịu hạn đặc biệt quan tâm điều kiện biến đổi khí hậu Các protein DREB nhân tố tham gia vào trình phiên mã nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn đậu tương Protein DREB nhân tố kích thích gen hoạt động khơng phụ thuộc vào ABA Hiện có nghiên cứu đối tượng như: lúa, khoai tây, cúc, lạc…, đậu tương nghiên cứu DREB bước đầu Ở đậu tương thấy phân họ DREB gồm GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7 Mặc dù DREB không trực tiếp tham gia vào q trình chống chịu hạn nhân tố kích hoạt đồng thời biểu gen liên quan đến tính chịu hạn Như vậy, nói nghiên cứu DREB sở để cải thiện tính chịu hạn đậu tương thơng qua việc chuyển gen Với mục đích xác định thị phân tử liên quan đến tính chịu hạn đậu tương sở phân lập, so sánh gen DREB5 tiến hành đề tài: “Đánh giá khả chịu hạn so sánh gen DREB5 số giống đậu tương địa phương” Mục tiêu nghiên cứu Xác định mức độ chịu hạn sai khác trình tự gen DREB5 số giống đậu tương địa phương Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nội dung nghiên cứu - Phân tích hình thái kích thước hạt, khối lượng 1000 hạt xác định hàm lượng protein, lipid hạt số giống đậu tương địa phương; - Đánh giá khả chịu hạn số giống đậu tương địa phương điều kiện gây hạn nhân tạo - Khuếch đại, tách dòng xác định trình tự gen DREB5 số giống đậu tương địa phương - So sánh trình tự gen DREB5, trình tự amino acid protein DREB5 giống đậu tương khác khả chịu hạn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Cây đậu tƣơng 1.1.1.1 Đặc điểm sinh học đậu tương Đậu tương có tên khoa học (Glycine max (L) Merrill ), có nhiễm sắc thể 2n=40, thuộc thân thảo, họ Đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidea) Cây đậu tương hóa Trung Quốc đưa đến Triều Tiên, Nhật Bản, Nga, sang Nam Á qua Con đường tơ lụa Ở Việt Nam đậu tương trồng từ lâu đời, sớm tỉnh thuộc khu vực Trung du, miền núi phía Bắc miền đơng Nam Bộ [2] Về hình thái, đậu tương có phận rễ, thân, lá, hoa, Rễ đậu tương rễ cọc gồm rễ rễ bên, rễ đậu tương có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả cố định nitơ khơng khí, cung cấp đạm cho cây, có vai trị cải tạo đất [5] Thân đậu tương có hình trịn, có màu xanh tím, chín thân ngả sang màu vàng nâu Lá đậu tương gồm loại: Lá mầm, đơn kép (có chét đơi có 4-5 chét) Hoa mọc thành chùm nách lá, chùm hoa có từ 10-15 hoa, có màu trắng tím, hoa đậu tương tự thụ phấn 1% giao phấn Quả thẳng cong có nhiều lơng, chứa 1-5 hạt thông thường từ 2- hạt Hạt đậu tương khơng có nội nhũ mà có lớp vỏ mỏng bao quanh phơi mầm Hạt có hình trịn, ovan, trịn dài, trịn dẹt, vỏ hạt đậu tương có màu nâu, đen, vàng, xanh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Căn vào thời gian sinh trưởng đậu tương người ta chia làm loại: giống chín sớm (75-85) ngày, giống chín trung bình (80-100) ngày, giống chín muộn (110-120) ngày Thời gian sinh trưởng yếu tố quan trọng để lựa chọn trồng luân canh tăng vụ [13] 1.1.1.2 Giá trị kinh tế đậu tương Cây đậu tương trồng cạn ngắn ngày, loại trồng có tác dụng nhiều mặt hiệu kinh tế cao Về thực phẩm, hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao [2] Protein đậu tương có phẩm chất tốt protein thực vật, có đầy đủ cân đối loại amino acid cần thiết Protein đậu tương lại dễ tiêu hóa khơng có thành phần tạo cholesterol Lipid đậu tương chứa tỷ lệ lớn axit béo chưa no, có hệ thống đồng hóa lớn (98%), số iot cao (121- 137) có tác dụng phòng chống bệnh bướu cổ cho người, đặc biệt vùng trung du miền núi Hạt đậu tương cịn chứa nhiều loại muối khống có khả cung cấp lượng lớn (4.710 kcal/ kg), người ta chế biến hạt đậu tương thành 600 sản phẩm khác Mặt khác, sử dụng protein lipid đậu tương cịn có tác dụng phịng chống bệnh đái tháo đường, béo phì, huyết áp cao, chảy máu não,… Ngày người ta biết thêm hạt đậu tương có chất lecithin có tác dụng làm thể trẻ lâu, tăng trí nhớ tái sinh mô, làm cứng xương, tăng sức đề kháng Ngồi ra, cịn chứa nhiều loại vitamin, vị thuốc để chữa bệnh [12] Về mặt công nghiệp, sản phẩm đậu tương nguyên liệu nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp ép dầu, công nghiệp sử dụng trực tiếp gián tiếp nguyên liệu từ đậu tương Về xuất khẩu, đậu tương mặt hàng nơng sản có giá trị ổn định thị trường giới Lượng hạt đậu tương xuất hàng năm 24-26 triệu hạt/ năm 2- triệu dầu/ năm Từ sau đại chiến giới thứ nhất, đậu tương giữ vị trí hàng đầu thị trường nơng sản giới [2] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Trong chăn nuôi, đậu tương nguồn thức ăn cần thiết cho gia súc tốt, kg hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn Trong lĩnh vực trồng trọt, đậu tương có khả tích lũy đạm từ nitơ tự nhiên để nuôi làm giàu cho đất nhờ cộng sinh vi khuẩn Rhizobium rễ, với thân lá, chất hữu góp phần làm thay đổi tính chất lý hóa tăng độ phì nhiêu cho đất Trong hệ thống thâm canh,trồng đậu tương có tác dụng làm cho trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp phần phá vỡ chu kì sâu bệnh, chống nạn nhiễm lạm dụng bón phân hóa học thuốc trừ sâu Cây đậu tương trồng nhiều loại đất, nhiều vụ năm, xen canh, gối vụ thuận lợi Sự phát triển nghành sản xuất đậu tương biện pháp nhằm khai thác lợi vùng khí hậu nhiệt đới 1.1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương giới Do khả thích ứng rộng, đậu tương trồng khắp năm châu lục, tập trung nhiều Châu Mỹ 75,68%, tiếp đến Châu Á 21,27% số nước khác giới Cùng với khả thích nghi với đặc điểm điều kiện thời tiết, khí hậu, đất đai, việc ứng dụng tiến công nghệ sinh học từ chọn, tạo giống đến sản xuất làm tăng suất đậu tương năm gần đưa đậu tương trở thành trồng quan trọng cấu trồng Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới năm gần 2003 Diện tích (triệu ha) 83,66 Sản lƣợng (triệu tấn) 227,89 Năng suất (tạ/ha) 27,24 2004 91,60 224,37 24,49 2005 92,51 231,65 25,04 2006 95,25 229,24 24,07 2007 90,11 243,63 27,04 2008 96,87 238,41 24,61 Năm (Nguồn: FAOSTAT, 2009) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Qua bảng 1.1 cho thấy, khoảng thời gian từ năm 2000 đến năm 2008, sản xuất đậu tương giới có bước tăng đáng kể diện tích, suất sản lượng Năm 2003, diện tích đạt 83,66 triệu đến năm 2008 đạt 96,87 triệu tăng 15,8% Hiện nay, đậu tương trồng gần 80 nước khác khắp châu lục Đậu tương nguồn cung cấp dầu protein quan trọng, giới, nước có sản lượng đậu tương đứng đầu là: Mỹ, Brazil, Achentina Trung Quốc Bảng 1.2 Tình hình sản xuất đậu tƣơng nƣớc đứng đầu giới Quốc gia Mỹ Năm 2008 Năm 2009 Diện tích Sản lƣợng Năng suất Diện tích Sản lƣợng Năng suất (triệu ha) (triệu tấn) (tạ/ha) (triệu ha) (triệu tấn) (tạ/ha) 30,2 26,67 80,53 28,84 28,72 82,83 Brazil 21,27 28,17 59,92 22,89 21,92 50,17 Argentina 16,38 28,22 46,23 14,03 27,28 38,27 Trung Quốc 9,13 17,02 15,54 9,500 17,79 16,90 (Nguồn:United States Department of Agriculture, May 2010) Theo dự báo Bộ Nông Nghiệp Mỹ (USDA) Tổng sản lượng niên vụ 2010-2011 đạt 249,93 triệu giảm 9,27 triệu (-3,6%) so với sản lượng 259,20 triệu niên vụ 2009-2010 Tổng diện tích đậu tương giới đạt 101,37 triệu ha, giảm so với 102,12 triệu niên vụ 2009-2010 Năng suất bình quân đạt 247 tấn/ha so với 2,54 tấn/ niên vụ 2009-2010 Bảng 1.3 Sản lƣợng đậu tƣơng niên vụ 2010 - 2011 số nƣớc giới dự tính Sản lƣợng (triệu tấn) Tên nƣớc Mỹ Braxin Achentina Trung Quốc Ấn Độ Paragoay Các nước khác 90,08 65,00 50,00 14,60 8,80 6,50 11,30 (Theo Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam Việt Nam có lịch sử trồng đậu tương lâu đời, số tài liệu cho đậu tương đưa vào trồng nước ta từ thời vua Hùng xác định nhân dân ta trồng đậu tương trước đậu xanh họ đậu khác [3] Các giống đậu tương nước ta phong phú gồm giống đậu tương nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến tập đoàn giống đậu tương địa phương Trong năm gần với việc tạo giống đậu tương cho suất cao, nhà chọn giống đậu tương quan tâm nghiên cứu giống đậu tương địa phương, có suất thấp lại có chất lượng hạt cao có khả chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh bất lợi nóng, lạnh, phèn, mặn, hạn…[2] Hiện nay, diện tích gieo trồng đậu tương nước ta mở rộng Tính đến tháng 4/2010 123,9 nghìn chia làm vùng sản xuất chính: miền núi Bắc Bộ 24,7%, Đồng sơng Hồng 17,5%, Đơng Nam Bộ 26,2% (có diện tích lớn nhất), Đồng sông Cửu Long 12,4%; tổng diện tích vùng chiếm 80% diện tích trồng đậu tương nước, lại Đồng ven biển miền Trung Tây Nguyên [14] Bảng 1.4 Tình hình sản xuất đậu tƣơng Việt Nam năm gần Năm Diện tích (nghìn ha) Sản lƣợng (nghìn tấn) Năng suất (tạ/ha) 2003 165,6 219,7 13,26 2004 183,8 245,9 13,37 2005 204,1 292,7 14,34 2006 185,6 258,1 13,90 2007 187,4 275,2 14,69 2008 191,5 268,6 14,03 2009 146,4 213,6 14,59 (Nguồn: Niêm giám thống kê 2009, Nhà Xuất Bản Thống Kê Hà Nội, 2010) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chúng tơi nhận thấy, nhóm thứ gồm giống CPB, VNS, Xanh Tiên Đài đánh giá khả chịu hạn CPB, VNS hai giống chịu hạn kém, Xanh Tiên Đài giống chịu hạn trung bình; nhóm thứ hai gồm giống Bản Giốc giống Xanh Ba Bể đánh giá giống đậu tương chịu hạn tốt Như vậy, dựa trình tự gen DREB5 phân chia giống có sai khác khả chịu hạn Cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu với số lượng giống đậu tương nhiều để có kết luận xác thị phân tử liên quan đến tính chịu hạn dựa trình tự gen DREB5 Chúng tơi so sánh trình tự amino acid protein DREB5 giống đậu tương nghiên cứu với giống đậu tương khác CPB, VNS, XTD EF583447 có độ tương đồng cao, từ 87,7% đến 99,7 % (Bảng 3.10) Bảng 3.10 Hệ số tƣơng đồng trình tự amino acid protein DREB5 XBB BG CPB XBB BG CPB VNS XTD EF583447 100 99,7 88,7 87,7 90,4 99,3 100 88,7 87,7 90,4 99,0 100 98,7 98,4 89,4 100 97,4 88,4 100 91,1 VNS XTD EF583447 100 Từ kết so sánh trình tự amino acid protein DREB5 giống đậu tương nghiên cứu với giống đậu tương khác CPB, VNS, XTD giống đậu tương có mã số EF583447 Ngân hàng gen NCBI có nguồn gốc từ Trung Quốc, chúng tơi thiết lập sơ đồ hình biểu diễn mối quan hệ trình tự amino acid protein DREB5 giống đậu tương (Hình 3.10) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 CPB.pro VNS.pro Xanhtiendai.pro XBB.pro BanGioc.pro EF583447.pro 5.7 Nucleotide Substitutions (x100) Hình 3.10 Mối quan hệ di truyền trình tự amino acid protein DREB5 Kết cho thấy, giống đậu tương chia thành nhóm: nhóm gồm giống CPB, VNS, Xanh Tiên Đài; nhóm gồm giống Bản Giốc, Xanh Ba Bể EF583447 Chúng nhận thấy nhóm gồm giống (CPB, VNS) giống chịu hạn XTD giống chịu hạn trung bình; nhóm gồm giống BG XBB đánh giá chịu hạn tốt Như vậy, dựa trình tự amino acid protein DREB5 phân chia giống có sai khác khả chịu hạn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Khối lượng 1000 hạt bảy giống đậu tương nghiên cứu dao động từ 89,79g - 198,44g, giống BG có khối lượng thấp (87,79 g) giống ĐT84 có khối lượng cao (198,44) Hàm lượng protein dao động từ 33,10% - 42,42%, hàm lượng lipid dao động từ 14,35% - 18,62% Bảy giống đậu tương nghiên cứu có khả chịu hạn khác phân bố thành nhóm theo mức độ chịu hạn, hai giống đậu tương Bản Giốc Xanh Ba Bể có khả chịu hạn cao giống ĐT 84 có khả chịu hạn thấp Đã nhân bản, tách dòng xác định trình tự gen DREB5 giống đậu tương chịu hạn tốt Xanh Ba Bể Bản Giốc Gen DREB5 có kích thước 924 bp Trình tự nucleotide gen DREB5 giống đậu tương nghiên cứu trình tự nucleotide gen DREB5 giống đậu tương NCBI (EF583447) có độ tương đồng cao (91,9% đến 99,7%) Trình tự amino acid protein DREB5 giống đậu tương nghiên cứu giống EF583447 có độ tương đồng cao (87,7% đến 99,7%) Xác định khác biệt trình tự nucleotide gen DREB5 trình tự amino acid protein DREB5 nhóm chịu hạn tốt nhóm chịu hạn ĐỀ NGHỊ Cần tiếp tục nghiên cứu về gen DREB5 làm sở cho việc thiết kế vector mang cấu trúc gen DREB5 phục vụ chuyển gen tạo đậu tương có khả chịu hạn tốt xác định thị phân tử liên quan đến tính chịu hạn dựa trình tự gen DREB5 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Lê Trần Bì nh, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chị u ngoại cảnh bất lợi lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội, tr.92-98 Ngơ Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây Đậu tương, Nxb Nông Nghiệp Trần Văn Điền (2007), Giáo trình đậu tương, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Hoàng Văn Đức (1986), Kết nghiên cứu quốc tế về đỗ tương, NXB Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh Hương (2005), Nghiên cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh nhân gene dehydrin số giống đậu tương địa phương vùng núi phía bắc Việt Nam, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc – Nghiên cứu khoa học sống – ĐH Y Hà Nội, tr 1224- 1227 Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải, (2007), Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 5(1): tr.1-18 Trần Thị Phương Liên, Nguyễn Huy Hoàng, Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chaperonin ở giớ ng đậu tương chịu nóng M103, Tạp chí Khoa học công nghệ, số 36, tr 8-14 Trần Thị Phương Liên, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Lê Thị Muội (1999), Phân lập gen dehydrin liên quan đến khả chịu hạn đậu tương, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, Hà Nội, tr 1348- 1349 Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tí nh hóa sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả chị u,no chịu ́ ng hạn Việt Nam , Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội, tr 22-34 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 51 10 Chu Hoàng Mậu , Nông Thị Man , Lê Trần Bì nh (2000), Đánh giá sớ tính trạng kinh tế quan trọng khả chịu hạn dòng đậu tương (Glycine max (L).Merrill) đợt biến, Tạp chí Khoa học công nghệ Đại học Thái Nguyên, số 13, tr.16-21 11 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hường, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hồng Hà (2011), Gen đặc tính chịu hạn đậu tương, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội 12 Nguyễn Thị Tố Ngà (2005), Nghiên cứu khả sinh trưởng, phát triển suất số giống đậu tương Vĩnh Phúc, Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên 13 Trịnh Thị Nhất, Trần Hồng Uy, Trần Đình Long (1997), Ảnh hưởng trồng xen ngơ - đậu tương đến thời giam sinh trưởng suất hệ thống trồng, Nông nghiệp Công nghiệp thực phẩm, N426, tr 537- 538 14 Trung tâm thơng tin PTNNNT-Viện sách chiến lược PTNNNTBộ Nơng nghiệp & PTNT, Bản tin tháng 3/ 2010 nghành hàng lương thực, Bộ NN& PTNT, Hà Nội, 2010 Tài liệu Tiếng Anh 15 Chen M., Wang Q Y, Cheng X G, Xu Z S, Li L C, Ye X G, Xia L Q, Ma Y Z., (2007) GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants, Biochem Biophys Res Commun, 353(2), pp 299-305 16 Close T J., (1996), Dehydrin: Emergence biochemical role family plant dehydrin proteins, Physiol Plant, 97: pp 795 – 803 17 Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Parvez M M., Seki M., Hiratsu K., Ohme-Takagi M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2005), AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabidopsis, Plant Cell 17(12): pp.3470-3488 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 18 Gao.S., Chen M., Ma.Y., (2008), Glycine max stress-related protein (AREB1) mRNA, complete cds, NCBI GenBank, accession EU418491 19 Hao Y J., Zhang J S., Chen S Y., (2009), Glycine max transcriptional factor NAC35 (NAC35) mRNA, complete cds, NCBI GenBank, accession EU440355 20 Hartl F.U (1996), Molecular chaperones in cellular protein folding, Nature, 381, pp 571 – 580 21 Jinn T., Chang P.L., Chen Y., Key J.L AND Lin C (1997), Tissue- type Specific heat- Shock protein in Soy bean, Plan physiol., 114, pp 429- 438 22 Keder J C., (1996), “Lipid - transfer proteins in plant”, Annual review of Plant Physiology and Plant moculelar Biology, 47: pp 627 - 654 23 Lee D K., Ahn J H., Song S K., Choi Y D., Lee J S., (2003), Glycine max expansin (EXP1) mRNA, complete cds, NCBI GenBank, accession AF516879 24 Lee D K., Ahn J H., Song S K., Choi Y D., Lee J S., (2011), Expression of an Expansin Gene Is Correlated with Root Elongation in Soybean, School of Biological Sciences, Seoul National University, Seoul 151- 742, Korea (D.- K.L., J H A., S -K S., J S L.); anh School of Agricultural Biotechnology anh Crop Functional Genomics Center, Seoul National University, Suwon 441- 744, Korea (Y D C) 25 Liao Y., Zou H F., Wang H W., Zhang W K., Ma B., Zhang J S., Chen S Y., (2008), Soybean GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants, Cell Res, 18(10): pp.1047- 1060 26 Lin R., Zhao W., Meng X., Wang M and Peng Y (2007), Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC-domain transcription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea, Plant Sci 172 (1), 120130 (2007) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53 27 Li X W., Wang Q Y., Zhao Y., Zhang.Y., Qian, D D., Zhai.Y., Zhang Q L., (2011), Glycine max MYB transcription factor MYB12B2 mRNA, complete cds, EMBL GenBank , accession JF510467 28 Liu K.H., Lin T.Y., (2004), Vigna radiata lipid trasfer protein I (ltp 1) mRNA, complete cds, EMBL Gen Bank, Accession AY300806 29 Liu K.H., Lin T.Y., (2004), Vigna radiata lipid trasfer protein II (ltp 2) mRNA, complete cds, EMBL Gen Bank, Accession AY300807 30 Liu W., Feng F (2008), Nicotiana tabacum DREB4 mRNA, complete cds, College of Life Science, Henan Agricultural University, Wenhua Road, Zhengzhou, Henan 450002, P.R China 31 Lucas S., Hammon N., Glavina del Rio T., Detter J., Dalin E., Tice H., Pitluck S., Tuskan G., Chapman J., Putnam N.H., (2005), Populus trichocarpa AP2/ERF domain-containing transcription factor (DREB11), mRNA, US 40 Liu W and Feng F (2008), Nicotiana tabacum DREB4 mRNA, complete cds, College of Life Science, Henan Agricultural University, Wenhua Road, Zhengzhou, Henan 450002, P.R China 32 Maitra N., Cushman J C., (1994), Isolation and characterization a drought – induced soybean cDNA encoding a D95 family late – embryogene is – abudant protein, Plant Physiol., 106, pp 805- 806 33 Porcel R., Azcon R., Ruiz Lozano J M., (2005), Evaluation of the role of genes encoding for dehydrin proteins (LEA D – 11) during drought stress in arbuscular mycorrhizal Glycine max and Lactuca sativa plant J Exp Bot., 56(417): pp 1933 – 1942 34 Takahashi R., Benitez E R., Oyoo M E., Khan N A., Komatsu.S., (2011), Glycine max W2 mRNA for R2R3 MYB transcription factor, complete cds, cultivar: Nezumisaya, EMBL GenBank, accession AB597933 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 35 Tran L S., Nakashima K., Sakuma Y., Osakabe Y., Qin F., Simopson S D., Maruyama K., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi - Shinozaki K., (2007), Co-expression of the stress-inducible zinc finger homeodomain ZFHD1 and NAC transcription factors enhances expression of the ERD1 gene in Arabidopsis Plant J.,(1): pp 46-63 36 Zhang G., Chen M., Li L., Xu Z., Chen X., Guo J., Ma Y., (2009) Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco, Journal of Experimental Botany, 60(13): pp.3781-3796 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây đậu tương đặc tính chịu hạn đậu tương 1.1.1 Cây đậu tương 1.1.1.1 Đặc điểm sinh học đậu tương 1.1.1.2 Giá trị kinh tế đậu tương 1.1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương giới 1.1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam 1.1.2 Thành phần hóa sinh hạt đậu tương 1.1.2.1 Protein dự trữ thành phần amino acid hạt đậu tương 1.1.2.2 Lipid, vitamin số chất khác 10 1.1.3 Đặc tính chịu hạn gen liên quan đến tính chịu hạn đậu tương 10 1.2 Nghiên cứu nhân tố phiên mã 17 1.2.1 Các nhân tố tham gia vào trình phiên mã 17 1.2.2 Nghiên cứu nhân tố phiên mã DREB DREB5 19 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 2.1 Vật liệu 22 2.2 Hoá chất 22 2.3 Thiết bị 23 2.4 Phương pháp nghiên cứu 24 2.4.1 Phương pháp sinh lí, hố sinh 24 2.4.2 Phương pháp sinh học phân tử 26 2.4.2.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 26 2.4.2.2 Kỹ thuật RT-PCR 27 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 2.4.2.3 Phương pháp tinh sản phẩm RT-PCR 28 2.4.2.4 Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng 29 2.4.2.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 30 2.4.2.6 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 30 2.4.2.7 Tách chiết plasmid 30 2.4.2.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotide 31 2.4.3 Phương pháp xử lí số liệu 31 2.4.3.1 Phương pháp thống kê chương trình Excel 31 2.4.3.2 Phương pháp xử lý trình tự gen 31 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết phân tích đặc điểm hình thái, kích thước khối lượng hạt 32 3.1.1 Đặc điểm hình thái, kích thước, khối lượng hóa sinh hạt giống đậu tương nghiên cứu 32 3.1.1.1 Hình thái, kích thước, khối lượng hạt 32 3.1.1.2 Hàm lượng protein lipid hạt giống đậu tương nghiên cứu 33 3.2 Kế́t quả đánh giá kh ả chịu hạn của các gi ố́ng đậuu tương nghiên cứu 34 3.2.1 Tỷ lệ thiệt hại giống đậu tương nghiên cứu giai đoạn non tác động hạn 35 3.2.2 Chỉ số chịu hạn giống đậu tương giai đoạn non 36 3.3 Kết phân lập gen DREB5 từ đậu tương 37 3.3.1 Tách chiết RNA từ mầm đậu tương 37 3.3.2 Kết nhân gen DREB5 phản ứng RT-PCR 38 3.3.3 Kết tách dòng gen DREB5 38 3.3.4 Kết quả xác đị nh trì nh tự nucleotide 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 Kết luận 50 Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 NHƢ̃NG CHƢ̃ VIẾT TẮT ABA Abscisic Acid (Axit abxisic) DNA Axit deoxyribonucleic (Deoxyribonucleic acid) ASTT Áp suất thẩm thấu bp Base pair (Cặp base) CTAB Cetyltrimethyl – ammonium bromide đtg Cộng sự DREB Dehydration- Responsive Element Binding EDTA Ethylen Diamin Tetraaccetic Acid (Axit ethylen diamin tetraaceic) kb Kilo base HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) LEA Late embryogenesis abundant protein (Protein tí ch lũy với số lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trì nh hì nh thành phôi) LTP Lipid trasfer protein (Protein vận chuyển lipid) MGPT Môi giới phân tử (Molecular chaperone) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) TAE Tris Acetate EDTA P5CS (Pyrroline -5 - Carboxylate Synthetase) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương giới năm gần .6 Bảng 1.2 Tình hình sản xuất đậu tương nước đứng đầu giới .7 Bảng 1.3 Sản lượng đậu tương niên vụ 2010 - 2011 số nước giới dự tính Bảng 1.4 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam năm gần Bảng 2.1 Nguồn gốc của các giống đậu tương nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng 23 Bảng 2.3 Thành phần hóa chất phản ứng RT-PCR 27 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 28 Bảng 3.1 Hình dạng, màu sắc, khối lượng, kích thước hạt giống đậu tương nghiên cứu 32 Bảng 3.2 Hàm lượng protein và lipid của7 giống đậu tương nghiên cứu .34 Bảng 3.3 Tỷ lệ thiệt hại giống đậu tương giai đoạn non 35 Bảng 3.4 Chỉ số chịu hạn tương đối giống đậu tương .36 Bảng 3.5 Hệ số tương đồng trình tự nucleotide gen DREB5 43 Bảng 3.6 Vị trí sai khác trình tự nucleotide nhóm đậu tương chịu hạn tốt nhóm đậu tương chịu hạn .44 Bảng 3.7 Hệ số tương đồng trình tự amino acid protein DREB5 46 Bảng 3.8 Vị trí sai khác trình tự amino acid protein DREB5 hai nhóm đậu tương chịu hạn tốt chịu hạn 46 Bảng 3.9 Hệ số tương đồng trình tự nucleotide gen DREB5 47 Bảng 3.10 Hệ số tương đồng trình tự amino acid protein DREB5 48 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 DANH MỤC CÁC HÌ NH Hình 1.1 Cơ chế phân tử q trình tăng cường tính chịu hạn thực vật 18 Hình 2.1 Sơ đồ vector pBT 29 Hình 3.1 Đồ thị mơ tả tỷ lệ thiệt hại hạn gây giống đậu tương nghiên cứu giai đoạn non 36 Hình 3.2 Ảnh điện di RNA tổng số gel agarose 1% 37 Hình 3.3 Ảnh điện di DNA sản phẩm RT-PCR 38 Hình 3.4 Đĩa ni cấy xuất khuẩn lạc trắng khuẩn lạc xanh 39 Hình 3.5 So sánh trì nh tự nucleotide của gen DREB5 BG với XBB 40 Hình 3.6 So sánh trình tự nucleotide gen DREB5 BG, XBB với gen DREB5 CPB, VNS 42 Hình 3.7 Mối quan hệ di truyền giống đậu tương dựa phân tích trình tự nucleotide gen DREB5 43 Hình 3.8 So sánh trình tự amino acid protein DREB5 hai giống đậu tương XBB, BG với hai giống đậu tương giống CPB, VNS 45 Hình 3.9 Mối quan hệ di truyền giống đậu tương dựa phân tích trình tự nucleotide gen DREB5 47 Hình 3.10 Mối quan hệ di truyền trình tự amino acid protein DREB5 49 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan là công trì nh nghiên cứu của riêng liệu, kết quả nêu luận văn là trung thực và Các số chưa từng công bố bất kỳ công trì nh nào khác Thái Nguyên, ngày 25 tháng 09 năm 2011 Tác giả luận văn Bế Bích Đào Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 61 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Chu Hoà ng Mậu, Đại học Thái Nguyên đã tận tì nh hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi hoàn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã đóng góp ý ki ến q báu tận tình bảo, hết lịng giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Tơi cũng xin chân thành cảm ơn các kỹ thuật viên phòng Sinh học phân tử , phịng Hóa sinh - Viện Khoa học sự sớng phịng thí nghiệm Bộ mơn Di truyền - ĐH Thái Nguyên và & Sinh học thực nghiệm - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Qua , cũng xin cảm ơn Bộ môn Hệ thống canh tác nghiên cứu Ngô đã cung cấp một số giống đậu tương giúp có thể - Viện hồn thành luận văn Tơi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đì nh , bè bạn động viên khuyến khí ch giúp đỡ suốt quá trì nh làm luận văn Tác giả luận văn Bế Bích Đào Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 62 ... hạt số giống đậu tương địa phương; - Đánh giá khả chịu hạn số giống đậu tương địa phương điều kiện gây hạn nhân tạo - Khuếch đại, tách dịng xác định trình tự gen DREB5 số giống đậu tương địa phương. .. tính chịu hạn đậu tương sở phân lập, so sánh gen DREB5 tiến hành đề tài: ? ?Đánh giá khả chịu hạn so sánh gen DREB5 số giống đậu tương địa phương? ?? Mục tiêu nghiên cứu Xác định mức độ chịu hạn sai... có khả chịu hạn Từ kết so sánh trình tự nucleotide gen DREB5 giống đậu tương BG, XBB với gen DREB5 giống đậu tương CPB, VNS so sánh vị trí sai khác trình tự nucleotide nhóm đậu tương chịu hạn