Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường khả năng sinh tinh của cao đặc testin CT3 trên động vật thực nghiệm TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG SINH TINH CỦA CAO ĐẶC TESTIN CT3 TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Dược lý Độc chất Mã số: 9720118 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2021 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ Mạnh Hùng PGS.TS Vũ Văn Điền PGS.TS Vũ Văn Điền Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Đình Tảo Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh Phản biện 3: PGS.TS Vũ Sỹ Khảng Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Học viện Quân y Hồi: ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc Gia Thư viện Học viện Quân y ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Nồng độ tinh trùng thấp nguyên nhân dẫn đến vơ sinh nam giới Trong suy giảm tinh trùng nguyên nhân trực tiếp gây vơ sinh Tình trạng suy giảm tinh trùng ngày có xu hướng gia tăng, khơng gây nguy hiểm ảnh hưởng nhiều đến tâm lý sinh hoạt hàng ngày, làm giảm chất lượng sống bệnh nhân Hiện nay, việc điều trị suy giảm tinh trùng cịn gặp nhiều khó khăn chế bệnh phức tạp Các phương pháp điều trị theo y học đại có nhiều thành tựu điều trị suy giảm tinh trùng mang lại số kết định cải thiện triệu chứng chất lượng sống cho bệnh nhân, kết khơng ổn định có nhiều tác dụng khơng mong muốn Hiện nay, giới Việt Nam có xu hướng phát nghiên cứu thuốc có nguồn gốc từ dược liệu Theo nhiều nghiên cứu, thuốc có nguồn gốc từ dược liệu có ảnh hưởng tích cực đến thơng số tinh trùng Vì vậy, sử dụng phương thuốc y học cổ truyền điều trị suy giảm tinh trùng quan tâm Các thuốc Y học cổ truyền (được cho tác dụng phụ, tốn kém, có hiệu lâu dài) phương pháp chữa suy giảm tinh trùng có hiệu thực tế Testin CT3 (công thức 3) gồm vị dược liệu: bá bệnh, dâm dương hoắc, ba kích, xà sàng tử, bạch tật lê, hoàng kỳ, đương quy, câu kỷ tử Testin CT3 thiết kế dựa sở lý luận biện chứng Y học cổ truyền, có tác dụng bổ thận, sinh tinh, ích khí huyết, điều trị suy giảm chức sinh dục nam Sản phẩm nghiên cứu bào chế dạng cao đặc với mục đích kết hợp dược liệu tạo tác dụng mạnh độc tính Để góp phần ứng dụng chế phẩm thực tiễn, đề tài “Nghiên cứu tính an toàn tác dụng tăng cường khả sinh tinh cao đặc Testin CT3 động vật thực nghiệm” thực với mục tiêu Mục tiêu luận án 2.1 Xác định độc tính cấp, độc tính bán trường diễn, độc tính sinh sản phát triển cao đặc Testin CT3 2.2 Đánh giá tác dụng tăng cường khả sinh tinh Testin CT3 mơ hình gây suy giảm sinh sản chuột đực thực nghiệm Những đóng góp luận án - Lần ứng dụng mơ hình gây suy giảm sinh sản chuột nhắt đực stress giam giữ Việt Nam Đây mơ hình đơn giản, dễ thực hiện, dụng cụ dùng mơ hình dễ kiếm, rẻ tiền áp dụng để tiến hành nghiên cứu nơi chưa có đầy đủ trang thiết bị đại Bố cục luận án Luận án có 148 trang, bao gồm phần: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan 41 trang; Đối tượng phương pháp nghiên cứu 25 trang; Kết nghiên cứu 35 trang với 27 bảng, biểu đồ, 34 hình; Bàn luận 42 trang; Kết luận trang Luận án có 210 tài liệu tham khảo (tiếng Anh tiếng Việt) Chương TỔNG QUAN 1.1 Quá trình sinh tinh Quá trình sinh tinh trải qua giai đoạn: Sinh tinh bào; giảm phân, tạo tinh trùng 1.2 Những yếu tố ảnh hưởng tới q trình sinh tinh trùng: Điều hịa nội tiết trình sinh tinh; nhiệt độ; yếu tố di truyền; béo phì; bệnh đái tháo đường; hóa chất môi trường; nhiễm trùng 1.3 So sánh giải phẫu, mô học quan sinh dục người chuột Trên chuột đực, hệ thống sinh dục gồm: tinh hoàn; ống phụ tinh hoàn (bao gồm ống dẫn ra, mào tinh hoàn, ống dẫn tinh); tuyến sinh dục phụ (gồm túi tinh, tuyến tiền liệt, tuyến hành niệu quản, bọng tuyến, tuyến quy đầu) niệu đạo, dương vật Bọng tuyến tuyến quy đầu có chuột Tinh hồn chuột thơng với khoang bụng qua khe hở ống bẹn, cịn người có đóng ống bẹn nên tinh hồn xuống bìu Chuột 35 ngày để tinh nguyên bào phát triển thành tinh trùng Người 70 ngày để tinh nguyên bào phát triển thành tinh trùng 1.3 Mơ hình nghiên cứu khả sinh tinh thực nghiệm 1.3.1 Mơ hình gây suy giảm sinh sản động vật thực nghiệm: Mơ hình stress nhiệt; stress giam giữ, tia xạ, hóa chất 1.3.2 Mơ hình nghiên cứu tác dụng chức sinh sản nam: Test hành vi giao phối; thử nghiệm ham muốn tình dục, thử nghiệm khả giao phối, nghiên cứu tuần hoàn vi mạch dương vật, nghiên cứu áp lực thể hang (ICP), định hướng hành vi, xác định thời gian dự thu hút giống 1.3.3 Phương pháp đánh giá chức sinh sản xét nghiệm: Xác định cholesterol (phương pháp Chod PAP); xét nghiệm xác định hormon; xét nghiệm nitric oxid synthase (NOS), protein thụ thể androgen; giải phóng nitric oxid in vitro; trọng lượng quan sinh dục, nghiên cứu mô học; bảo quản tinh trùng; đếm tinh trùng in vitro; hàm lượng fructose túi tinh 1.4 Tình hình nghiên cứu dược liệu Testin CT3 * Cơ sở lý luận thuốc nghiên cứu - cao đặc Testin CT3: bá bệnh, dâm dương hoắc bổ thận dương chủ trị liệt dương, di tinh, hoạt tinh Qn Ba kích, xà sàng tử cơng cường dương bổ khí huyết, ơn tỳ thận Thần Bạch tật lê, hồng kỳ, đương quy bổ khí sinh huyết, bổ can thận, tăng cường lưu thông máu Tá Câu kỷ tử bổ huyết bổ can thận, dưỡng âm Sứ Testin CT3 thuốc vừa cải thiện chức sinh dục nam, vừa bồi bổ thể lẫn tăng cường lưu thơng khí huyết, cải thiện suy giảm tinh trùng tốt * Tình hình nghiên cứu dược liệu Testin CT3 Việt Nam: Có nhiều nghiên cứu cho kết khả quan, nhiều thuốc sản xuất ứng dụng rộng rãi Bài thuốc “Sinh tinh thang” tác giả Phan Hoài Trung nghiên cứu (2004) tính an tồn tác dụng thuốc đến số lượng chất lượng tinh trùng Năm 2007, Đậu Xuân Cảnh nghiên cứu Hải mã Sâm Việt Nam lên hình thái - chức tinh hoàn chuột cống trắng trưởng thành Đoàn Minh Thụy (2010) nghiên cứu tác dụng viên nang Hồi xuân hoàn Năm 2012, Dương Thị Ly Hương nghiên cứu rễ bá bệnh Nguyễn Thanh Hương (2017) nghiên cứu tính an tồn tác dụng dịch chiết nước Tỏa dương lên số tiêu sinh sản chuột đực Đậu Thùy Dương (2018) nghiên cứu độc tính tác dụng chức sinh sản OS35 (cao chiết cồn xà sàng) thực nghiệm Năm 2019, Mai Phương Thanh nghiên cứu tác dụng phục hồi TD0014 mơ hình gây suy giảm sinh sản natri valproat CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Chất liệu nghiên cứu Testin CT3 thuốc PGS TS Vũ Văn Điền, thiết kế cung cấp Thành phần Testin CT3 gồm có vị dược liệu, điều chế theo quy trình ổn định, vị dược liệu sơ chế, thái phiến, kiểm tra đạt tiêu chuẩn DĐVN IV Cao xây dựng tiêu chuẩn sở dạng cao đặc toàn phần 2.2 Đối tượng nghiên cứu: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thỏ chủng Newzealand White, chuột cống trắng chủng Wistar 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nghiên cứu tính an tồn cao đặc Testin CT3 2.3.1.1 Nghiên cứu độc tính cấp cao đặc Testin CT3: Dựa theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon hướng dẫn Bộ Y tế xác định độ an toàn hiệu thuốc cổ truyền 2.3.1.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn cao đặc Testin CT3: Dựa theo định số 371/BYT-QĐ Bộ Y tế WHO xác định độ an toàn cho chế phẩm có nguồn gốc thiên nhiên 2.3.1.3 Nghiên cứu độc tính sinh sản phát triển Testin CT3 * Nguyên tắc tiến hành: Dựa theo hướng dẫn OECD WHO Thí nghiệm tiến hành 180 chuột nhắt trắng, tuần tuổi, gồm 60 chuột đực 120 chuột Chia chuột thành lô, lô gồm 20 chuột đực 40 chuột Cho chuột đực lơ uống Testin CT3 35 ngày trước ghép cặp Sau ghép cặp lô, chuồng chuột đực chuột cái, ghép tuần Sau 15 ngày tách riêng đực Xác định chuột mang thai Chia ngẫu nhiên chuột mang thai thành nhóm: Nhóm 1: 50% mang thai mổ quan sát số phơi thai; nhóm chuột mang thai nuôi đến đẻ quan sát hệ F1 Thế hệ F1 tiến hành theo quy trình 2.3.2 Nghiên cứu đánh giá tác dụng Testin CT3 2.3.2.1 Đánh giá tác dụng mơ hình stress nhiệt Tiến hành theo phương pháp Bartlett J.M Setchell B.P: ngâm bìu, tinh hồn vào bình nước có thiết bị điều nhiệt trì nhiệt độ 42ºC 30 phút gây tổn thương tinh hoàn Chia 40 chuột thành lô, lô 10 con: Gây tổn thương tinh hồn chuột stress nhiệt lơ trị 1, trị lơ mơ hình Đánh giá: trọng lượng thể; quan sinh dục (tinh hoàn, túi tinh, tuyến tiền liệt); testosteron; số lượng, độ di động tinh trùng; phân tích mơ học; đánh giá thang điểm Johnsen Bảng Thang điểm Johnsen Điểm Mô tả 10 Quá trình sinh tinh bình thường, nhiều tinh trùng OST Có nhiều tinh trùng OST, cấu trúc OST bị đảo lộn Số lượng tinh trùng < 10 Khơng có tinh trùng có nhiều tinh tử Khơng có tinh trùng, số lượng tinh tử < 5 Khơng có tinh tử, có nhiều tinh bào Khơng có tinh tử, số lượng tinh bào < Chỉ có tế bào Sertoli tinh nguyên bào thành ống sinh tinh Chỉ có tế bào Sertoli thành ống sinh tinh Khơng có tế bào thành ống sinh tinh 2.3.2.2 Đánh giá tác dụng mơ hình giam giữ Mơ hình giam giữ: Theo Iwakabe; chuột bị giam giữ (gây stress cô đơn bất động) ống Falcon 50 mL, khoan nhiều lỗ đường kính 0,4 cm Chia chuột lô, lô 10 Chuột nhốt ống riêng bị tách riêng khu vực hạn chế khơng có liên hệ với chuột khác ngày, 15 ngày liên tiếp Ngày thứ 16, đánh giá tiêu: trọng lượng thể; trọng lượng quan sinh dục: tinh hoàn, túi tinh, tuyến tiền liệt, tuyến Cowper, nâng hậu mơn; đường kính ống sinh tinh, đường kính lịng ống sinh tinh, chiều cao biểu mơ ống sinh tinh; phân tích mơ học ống sinh tinh q trình trưởng thành tinh trùng, dựa hệ thống thang điểm Mustafa Bảng 2.2 Thang điểm Mustafa Điểm Mô tả Quá trình sinh tinh đầy đủ với tế bào tinh trùng trưởng thành Có vài tế bào tinh trùng, có q trình hủy hoại biểu mơ Có diện vài tinh trùng ( 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 Hàm lượng huyết sắc tố (G/l) Trước TN (a) 115,25±2,80 112,50±1,97 117,88±2,67 Sau tuần (b) 110,14±2,67 109,25±3,49 109,75±3,15 Sau tuần (c) 110,88±3,00 114,38±6,91 110,00±3,78 p (trước – sau) pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 Số lượng bạch cầu (G/l) Trước TN (a) 9,28±1,19 6,59±0,49 7,61±0,81 Sau tuần (b) 8,00±0,76 6,21±0,55 7,84±1,56 Sau tuần (c) 9,31±1,17 7,83±0,94 10,9±1,25 p (trước – sau) pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 Số lượng tiểu cầu (G/l) Trước TN (a) 509,38±54,20 438,50±46,50 495,75±84,57 Sau tuần (b) 424,57±81,01 513,00±85,90 543,12±123,1 Sau tuần (c) 453,50±75,04 431,25±52,52 551,50±56,45 p (trước – sau) pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 p p2-1 > 0,05 p3-1 > 0,05 p3-2 > 0,05 Bảng 3.7 đến 3.10 Ảnh hưởng Testin CT3 đến chức gan, thận Hoạt độ AST (UI/l) Thời điểm Lô chứng xét nghiệm Lô trị (1) Lô trị (2) p (3) Trước TN (a) 24,88±3,09 25,63±5,26 27,12±7,07 p2-1 > 0,05 p3-1 > 0,05 44,38±13,2 Sau tuần (b) 50,14±12,13 28,13±5,09 p3-2 > 0,05 52,75±14,8 37,63±10,1 Sau tuần (c) 39,75±9,15 p (trước – sau) pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 Hoạt độ ALT (UI/l) Trước TN (a) 48,88±4,19 52,25±5,03 46,37±8,86 Sau tuần (b) 57,38±3,88 62,63±4,29 60,00±8,11 Sau tuần (c) 58,50±3,58 58,00±4,68 58,25±7,42 p (trước – sau) pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 Nồng độ Urea (mmol/L) Trước TN (a) 3,89±0,59 3,23±0,84 3,74±0,91 Sau tuần (b) 3,38±0,35 4,08±0,22 3,55±0,27 Sau tuần (c) 3,35±0,54 3,81±0,41 3,64±0,37 p (trước – sau) pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 Nồng độ Creatinin (mmol/L) Trước TN (a) 80,13±5,19 73,38±5,08 82,38±1,93 Sau tuần (b) 78,38±4,38 81,75±2,53 87,13±2,30 Sau tuần (c) 85,88±4,92 81,63±1,25 85,50±1,45 p (trước – sau) pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 Sau 14 ngày 42 ngày uống Testin CT3, trọng lượng thể, số huyết học (số lượng hồng cầu, hàm lượng huyết, số lượng bạch cầu số lượng tiểu cầu), sinh hóa (AST, ALT, ure, creatinin) khơng có khác biệt so với lô chứng so sánh thời điểm trước sau dùng thuốc (p > 0,05) 3.1.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng Testin CT3 trình sinh sản phát triển qua hệ 3.1.3.1 Tỷ lệ mang thai qua hệ: Thế hệ P lô chứng tỷ lệ mang thai 26 chuột (65%); lô trị 30 chuột (75%) lô trị 28 chuột (70%) Thế hệ F1: Lô chứng tỷ lệ mang thai 18 (72%); lô trị 19 (76%) lô trị 20 (80%) 3.1.3.2 Ảnh hưởng Testin CT3 lên số phôi thai qua hệ Bảng 11 Chỉ số phôi thai hệ P mang thai F1 Chỉ số nghiên cứu Số hoàng thể/mẹ (M±SD) Số thai đậu/mẹ (M±SD) Số thai bình thường/mẹ (M±SD) Tỷ lệ thai chết* (n, %) Tỷ lệ trứng* (n, %) Lô chứng n = 13 (a) Lô trị n = 13 (b) Lô trị n = 13 (c) p (a-b,c) 7,85 ± 2,79 8,87 ± 1,25 7,64 ± 1,87 7,31 ± 2,32 8,40 ± 1,06 7,29 ± 1,59 6,92 ± 2,06 8,00 ± 0,93 6,86 ± 1,23 (4,9) (6,86) (4,51) (5,26) (5,61) (4,67) pb-a > 0,05 pc-a > 0,05 pb-c > 0,05 18 Tinh hoàn Túi tinh Chứng (a) 0,58 ± 0,09 0,51 ± 0,12 Mơ hình (b) 0,49 ± 0,03 0,23 ± 0,13 pb-a < 0,05 < 0,05 Lô trị (c) 0,63 ± 0,11 0,63 ± 0,19 pc-a > 0,05 > 0,05 pc-b < 0,05 < 0,05 Lô trị (d) 0,66 ± 0,09 0,74 ± 0,19 pd-a > 0,05 < 0,05 pd-b < 0,05 < 0,05 Lô mô hình trọng lượng quan sinh dục giảm so với lô chứng (p < 0,05) Lô dùng Testin CT3 liều thấp làm tăng trọng lượng tinh hồn, túi tinh, so với mơ hình với p < 0,05 Lô Testin CT3 liều cao làm tăng trọng lượng tinh hồn, túi tinh so với lơ mơ hình với (p < 0,05) Riêng túi tinh trọng lượng tăng so với lơ chứng có khác biệt thống kê (p < 0,05) Bảng 3.20 Trọng lượng tuyến tiền liệt, tuyến Cowper, nâng hậu mơn mơ hình stress giam giữ Trọng lượng quan sinh dục M ± SD (mg/100g) Lô chuột (n=8) Tuyến tiền liệt Tuyến Cowper Cơ nâng hậu môn Chứng (a) 0,30 ± 0,10 0,19 ± 0,05 0,19 ± 0,05 Mơ hình (b) 0,28 ± 0,07 0,13 ± 0,04 0,13 ± 0,09 pb-a > 0,05 < 0,05 < 0,05 Lô trị (c) 0,25 ± 0,05 0,19 ± 0,06 0,13 ± 0,05 pc-a < 0,05 > 0,05 < 0,05 pc-b > 0,05 < 0,05 > 0,05 Lô trị (d) 0,29 ± 0,04 0,21 ± 0,05 0,17 ± 0,04 pd-a > 0,05 > 0,05 > 0,05 pd-b > 0,05 < 0,05 < 0,05 Lơ mơ hình trọng lượng quan sinh dục giảm so với lô chứng, với p < 0,05 Lô Testin CT3 liều thấp làm tăng trọng lượng tuyến Cowper so với lô mơ hình (p < 0,05); tuyến tiền liệt giảm so với lô chứng (p < 0,05) Lô Testin CT3 liều cao làm tăng trọng lượng tuyến Cowper nâng hậu mơn so với lơ mơ hình với p < 0,05 3.2.2.3 Tác dụng Testin CT3 đến kích thước ống sinh tinh Bảng 3.21 Tác dụng Testin CT3 đến kích thước ống sinh tinh n=25 19 Kích thước ống sinh tinh Mean ± SD (µm) ĐK ĐK Cao biểu lịng OST mơ OST OST 141,87 57,31 Chứng 42,28 ± ± ± (a) 6,24 14,06 11,79 Mô 126,74 56,52 35,11 ± hình ± ± 5,43 (b) 15,02 12,52 pb-a < 0,05 > 0,05 < 0,05 139,72 57,05 Lô trị 41,33 ± ± ± (c) 5,99 15,84 12,87 pc-a >0,05 > 0,05 > 0,05 pc-b < 0,05 > 0,05 < 0,05 165,70 64,26 Lô trị 50,72 ± ± ± (d) 16,26 46,87 21,45 pd-a < 0,05 < 0,05 < 0,05 pd-b < 0,05 < 0,05 < 0,05 Lô mô hình đường kính, chiều cao biểu mơ ống sinh tinh giảm so với so với lô chứng hai lô Testin CT3 (p < 0,05) Lô Testin CT3 liều thấp có đường kính ống sinh tinh chiều cao biểu mô ống sinh tinh cao so với lô mô hình (p < 0,05) Lơ Testin CT3 liều cao làm tăng đường kính ống sinh tinh, đường kính lịng ống, chiều cao biểu mô ống sinh tinh so với lô chứng lơ mơ hình (p < 0,05) 3.2.2.4 Tác dụng Testin CT3 thay đổi mô học ống sinh tinh Bảng 3.22 Đánh giá ống sinh tinh theo thang điểm Mustafa Lô chuột (n=10) Lô chu ột (n= 10) Thang điểm n (%) 20 Chứ ng (1) ( ) (6 3, 5) ( ) Mơ hình (2) ( ) 6 (3 3) ( ) p2-1 < 0, < 0, < 0, Lô trị (3) 5 ( 7, ) 11 (5 9, 5) ( 0, ) p3-1 > 0, > 0, > 0, ( , ) ( ) < , 5 ( , ) > , 21 < p3-2 < 0, < 0, < 0, Lô trị (4) ( 7, ) (4 8) 2 ( 1 ) p4-1 < 0, < 0, > 0, p4-2 < 0, < 0, < 0, , ( , ) > , < , Lơ mơ hình điểm 2-3 nhiều lô chứng (p < 0,05), điểm 4-5 so với lô chứng (p < 0,05) Lô trị phần lớn điểm 4-5, điểm 2-3, so với lơ chứng khơng khác biệt, so với lơ mơ hình có khác biệt (p < 0,05) Lơ trị điểm 4-5 nhiều so với lô chứng lơ mơ hình (p < 0,05) Điểm 23 so với lô chứng p>0.05, so với lơ mơ hình với (p < 0,05) 22 Biểu đồ 3.7 Biểu đồ Boxplot phân bố điểm Mustafa Điểm trung bình lơ mơ hình 3,23 ± 0,79 thấp so với hai lô dùng Testin CT3 lô chứng (p < 0,05) Lô Testin CT3 liều thấp 4,12 ± 0,68 liều cao 4,20 ± 0,77 thấp so với lô chứng (4,18 ± 0,62), khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Tỷ lệ điểm Mustafa 100% 80% 60% 40% 20% 0% 8.5% 13.0% 14.5% 63.0% 91.5% 87.0% 85.5% Lô trị Lơ trị 0-1 4-5 37.0% Chứng Mơ hình Biểu đồ 3.8 Tỷ lệ nhóm điểm theoMustafa Lơ chứng điểm 4-5 chiếm 91,5%; điểm 2-3 chiếm 37%; khơng có điểm Lơ mơ hìnhđiểm 4-5 (37%); điểm 2-3 (63%), khơng có điểm Lơ trị 1, lơ trị 2, điểm 4-5 cao lơ mơ hình 87% 85,5%; điểm 2-3 lơ mơ hình chiếm 13% - 14,5% 23 Hình 3.9 Điểm đánh giá ống sinh tinh qua mặt cắt ngang 3.2.3 Kết đánh giá hoạt tính androgen cao đặc Testin CT3 Bảng 3.23 Trọng lượng chuột đánh giá hoạt tính androgen Trọng lượng chuột (g) p t r Lô chuột (n=8) Trước thí nghiệm Sau thí nghiệm c – s a u Chứng (a) Tham chiếu (b) pb-a Lô trị (c) pc-a pc-b Lô trị (d) 101,25 ± 14,08 104,75 ± 14,8 < 107,50 ± 16,83 119,06 ± 17,3 > 0,05 111,13 ± 16,24 > 0,05 > 0,05 108,50 ± 4,87 > 0,05 117,88 ± 16,04 > 0,05 > 0,05 115,75 ± 6,45 , 24 pd-a > 0,05 > 0,05 pd-b > 0,05 > 0,05 Trọng lượng chuột lơ khơng có khác biệt (p > 0,05) Trọng lượng chuột lô trước sau tăng có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Bảng 3.24 Trọng lượng quy đầu, tuyến tiền liệt hoạt tính androgen Trọng lượng M ± SD (g/100g) Lô chuột (n=8) Quy đầu Tuyến tiền liệt Chứng (a) 0,038 ± 0,006 0,006 ± 0,0005 Tham chiếu (b) 0,082 ± 0,013 0,077 ± 0,019 pb-a < 0,05 < 0,05 Lô trị (c) 0,042 ± 0,010 0,007 ± 0,001 pc-a > 0,05 > 0,05 pc-b < 0,05 < 0,05 Lô trị (d) 0,043 ± 0,005 0,006 ± 0,001 pd-a > 0,05 > 0,05 pd-b < 0,05 < 0,05 Lô testosteron trọng lượng quy đầu, tuyến tiền liệt tăng so với lô chứng lô trị với p < 0,05 Lô Testin CT3 liều thấp trọng lượng quy đầu tuyến tiền liệt không khác biệt so với lô chứng p > 0,05 Lô Testin CT3 liều cao; trọng lượng quy đầu tuyến tiền liệt không khác biệt so với lô chứng (p > 0,05) Bảng 3.25 Trọng lượng túi tinh, tuyến Cowper, nâng hậu môn Trọng lượng M ± SD (g/100g) Lô chuột (n=8) Túi tinh Tuyến Cowper Cơ nâng hậu môn Chứng (a) 0,025 ± 0,006 0,031 ± 0,005 0,037 ± 0,008 Tham chiếu (b) 0,312 ± 0,088 0,055 ± 0,009 0,197 ± 0,038 pb-a < 0,05 < 0,05 < 0,05 Lô trị (c) 0,046 ± 0,014 0,032 ± 0,011 0,047 ± 0,008 pc-a < 0,05 > 0,05 < 0,05 pc-b < 0,05 < 0,05 < 0,05 Lô trị (d) 0,036 ± 0,010 0,042 ± 0,006 0,054 ± 0,018 pd-a < 0,05 < 0,05 < 0,05 pd-b < 0,05 < 0,05 < 0,05 Lô testosteron trọng lượng túi tinh, tuyến Cowper, nâng hậu môn cao lô chứng hai lô dùng Testin CT3 (p < 0,05) Lô Testin CT3 liều thấp không tăng trọng lượng tuyến Cowper, 25 tăng trọng lượng túi tinh, nâng hậu môn so với lô chứng (p < 0,05) Lô Testin CT3 liều cao tăng trọng lượng túi tinh, tuyến Cowper nâng hậu môn so với lô chứng (p < 0,05) CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Tính an tồn cao đặc Testin CT3 4.1.1 Độc tính cấp cao đặc Testin CT3 Theo phân loại độc tính GHS, chất có giá trị độc tính cấp LD50>5000 mg/kg thể trọng coi chất gần không độc Do vậy, cao đặc Testin CT3 với LD 50 = 250,13 g/kg phân loại vào nhóm khơng u cầu cảnh báo đặc biệt, coi gần không độc Theo Đỗ Trung Đàm, dựa vào số điều trị để đánh giá tính an tồn thuốc Nếu số điều trị lớn 10 (I > 10) thuốc dùng tương đối an tồn Áp dụng cơng thức số điều trị cao đặc Testin CT3 I = 10,38 (I > 10) Vậy Testin CT3 dùng tương đối an toàn * Liều Testin CT3 dùng nghiên cứu: Dựa vào LD50 Testin CT3 250,13 g/kg Theo Đỗ Trung Đàm, liều thử nghiệm dược lý an toàn 1/10 LD50 loại động vật đường dùng thuốc Trong nghiên cứu, dị liều an tồn 1/10,4 LD 50 tức 24,1 g/kg với chuột nhắt Áp dụng phương pháp ngoại suy liều chuột nhắt tính theo hệ số 12,3; chuột cống hệ số 6,2 thỏ hệ số liều dùng an tồn chuột nhắt nghiên cứu 24,1 g/kg; chuột cống 12,15 g/kg thỏ 5,88 g/kg 4.1.2 Độc tính bán trường diễn * Tình trạng chung thay đổi trọng lượng thỏ: ba lô thỏ uống Testin CT3 lơ chứng ăn uống tốt, hoạt động bình thường * Ảnh hưởng Testin CT3 quan tạo máu: Sau tuần uống Testin CT3, số huyết học có giảm khơng khác biệt so với lô chứng thời điểm thời điểm trước sau Nhưng tuần thứ số huyết học lại tăng trở lại không khác biệt so với lô chứng so với thời điểm trước uống thuốc sau tuần Testin CT3 hai mức liều không ảnh hưởng tới chức tạo máu 26 * Ảnh hưởng Testin CT3 đến hủy hoại tế bào gan, chức thận: hoạt độ AST ALT hai lô dùng Testin CT3 sau tuần có tăng cao so với trước TN so với lô chứng p>0,05 Quan sát mô bệnh học không khác biệt hai lô dùng Testin CT3 so với lô chứng Do hạn chế kinh phí nên chưa thực thêm xét nghiệm đánh giá tác dụng Testin CT3 đến chức gan mà thực xét nghiệm đánh giá hủy hoại tế bào gan, tương lai hy vọng tiếp tục tiến hành nghiên cứu để hoàn thiện mặt cịn thiếu sót 4.1.3 Độc tính sinh sản phát triển * Ảnh hưởng Testin CT3 với khả mang thai: tỷ lệ mang thai lô Testin CT3 75% 70% cao so với lơ chứng (65%) chưa có ý nghĩa thống kê Chuột F1 mang thai F2 lơ có “bố” hệ P dùng Testin CT3 có xu hướng cao so với lơ chứng p >0,05 Testin CT3 có xu hướng tăng khả thụ thai * Ảnh hưởng Testin CT3 số phôi thai: hệ P mang thai F1 số hoàng thể, số thai đậu số thai bình thường lơ trị cao lô chứng, lô trị thấp lô chứng, p>0,05 Tỷ lệ thai chết lô trị thấp so với lô chứng, lô trị cao lô chứng, p>0,05 Tỷ lệ trứng lô trị lô trị thấp so với lô chứng, p>0,05 Thế hệ F1 mang thai F2 lơ chuột có “bố” hệ P uống Testin CT3 có xu hướng giống hệ trước * Ảnh hưởng Testin CT3 đến chuột sinh ra: số chuột mẹ hệ P hệ F1 lô Testin CT3 liều thấp cao lơ chứng, cịn lơ Testin CT3 liều cao hệ P thấp so với lô chứng, hệ F1 lại cao lô chứng, p>0,05 Tỷ lệ chuột chết lô trị cao hơn, cịn lơ trị hệ P thấp hơn, hệ F1 cao hơn, p>0,05 Chuột hệ F1 F2 khỏe mạnh, có đầy đủ phận bên ngồi, khơng thấy có dị tật bẩm sinh, khơng có hành vi bất thường, tình trạng chung tốt, khơng rối loạn tiêu hóa, rụng lơng, mệt mỏi, kích thích tổn thương thần kinh… 4.2 Tác dụng cao đặc Testin CT3 4.2.1 Tác dụng Testin CT3 mơ hình stress nhiệt 27 * Ảnh hưởng Testin CT3 với số lượng chất lượng tinh trùng: lô Testin CT3 liều thấp, số lượng tinh trùng tăng có ý nghĩa thống kê so với lơ mơ hình (p < 0,05), so với lơ chứng có tăng không khác biệt Lô Testin CT3 liều cao, số lượng tinh trùng có tăng so với lơ mơ hình khơng khác biệt, so với lơ chứng khơng tăng số lượng tinh trùng Lơ mơ hình có số lượng tinh trùng giảm rõ rệt so với lô chứng lô dùng Testin CT3 liều thấp (p < 0,05) Trong nghiên cứu, lô dùng Testin CT3 tỷ lệ tinh trùng di động nhanh cao rõ rệt so với lơ mơ hình đa số tinh trùng bất động chỗ * Ảnh hưởng Testin CT3 nồng độ testosteron máu: Lô Testin CT3 hai liều làm tăng testosteron so với lô chứng lô mô hình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Kết phù hợp với số lượng mức độ di động tinh trùng Lơ mơ hình, tổng hợp testosteron thấp thiếu hụt chức tiết tế bào Leydig, dẫn đến ảnh hưởng tới trình sinh tinh trưởng thành tinh trùng mào tinh hoàn Trong nghiên cứu, tăng đáng kể nồng độ testosteron cho thấy khả đảo ngược Testin CT3 stress nhiệt, Testin CT3 có tác dụng tăng cường chức sinh tinh Mặc dù chuột bị gây suy giảm sinh sản stress nhiệt, gây tổn thương tinh hồn, Testin CT3 nguồn ngoại sinh kích thích sản xuất testosteron tế bào Leydig tinh hoàn, nên làm tăng nồng độ testosteron rõ rệt hai lô trị so với lơ chứng lơ mơ hình * Đánh giá mô học ống sinh tinh theo thang điểm Johnsen: Đánh giá mơ học ống sinh tinh q trình trưởng thành tinh trùng, dựa hệ thống thang điểm Johnsen Đây hệ thống phân loại mô học định lượng đáng tin cậy, đơn giản, dễ thực để tiên lượng khả sinh sản nam giới Điểm Johnsen yếu tố dự báo mô bệnh học cấu trúc vi thể ống sinh tinh sau số định điều trị bệnh nhân suy giảm chức sinh sản nam, từ phân tích xác định tiên lượng tích cực giúp cải thiện khả sinh sản Kết cho thấy điểm Johnsen giảm đáng kể lơ mơ hình so với lơ chứng hai lô dùng Testin CT3 p