Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất carrageenan từ rong sụn kappaphycus alvarrezii (doty) doty bằng enzyme viscozyme l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM PHẠM THỊ HẢI HÀ NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVARREZII (DOTY) DOTY BẰNG ENZYME VISCOZYME L ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Nha Trang, tháng năm 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM PHẠM THỊ HẢI HÀ NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVARREZII (DOTY) DOTY BẰNG ENZYME VISCOZYME L ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: TS ĐỖ VĂN NINH Nha Trang, tháng năm 2013 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án Trước tiên em xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, phòng Đào tạo Đại học, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm lời cảm ơn, niềm tự hào học tập trường năm qua Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy TS Đỗ Văn Ninh, Th.s Bùi Huy Chích tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ suốt trình thưc đồ án tốt nghiệp Xin chân thành biết ơn thầy cô giáo khoa Công nghệ Thực phẩm giảng dạy truyền đạt cho em kiến thức q báu suốt q trình học tập Trường Đại học Nha Trang Xin chân thành cảm ơn thầy giáo phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Thực Phẩm, phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, phịng thí nghiệm Hóa sinh - Vi sinh, Trung tâm thực hành thí nghiệm, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình thực tập Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người động viên, giúp đỡ em suốt thời gian thực tập vừa qua Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi chân thành cảm ơn tất người dành cho tơi tình cảm quý báu này! Xin trân trọng cảm ơn! Khánh Hòa, thánh năm 2013 Sinh viên Phạm Thị Hải Hà ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU .v DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan rong sụn .3 1.1.1 Giới thiệu rong sụn 1.1.2 Đặc điểm rong sụn 1.1.3 Đặc điểm sinh học .5 1.1.4 Thành phần hóa học rong sụn 1.1.5 Ứng dụng rong sụn .7 1.2 Tổng quan Car 1.2.1 Giới thiệu Car 1.2.2 Cấu tạo phân loại Car .8 1.2.3 Tính chất lý hóa Car .10 1.2.3.1 Tính chất polymer 10 1.2.3.2 Nhiệt độ nóng chảy 11 1.2.3.3 Sự tạo gel - keo hóa 11 1.2.3.4 Tính bền acid .13 1.2.3.5 Tính tan 13 1.2.3.6 Tính hấp thụ tia hồng ngoại màu 14 1.2.3.7 Tính thủy phân metyl hóa xác đinh cơng thức cấu tạo Car.14 1.2.3.8 Độ nhớt 14 1.2.3.9 Một vài tính chất khác 15 1.2.4 Ứng dụng Car .15 1.2.4.1.Ở nước 15 1.2.4.2 Ở nước 18 1.3 Một số phương pháp xử lý rong trước nấu chiết 19 1.4 Một số quy trình sản xuất Car 21 1.5 Tổng quan enzyme viscozyme .23 1.5.1 Giới thiệu enzyme Viscozyme 23 1.5.2 Ứng dụng Viscozyme 24 iii 1.5.3.Tổng quan cơng trình nghiên cứu nước sử dụng enzyme Viscozyme 24 1.5.3.1 Nghiên cứu nước .24 1.5.3.2 Nghiên cứu nước 26 Chương NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vât liệu nghiên cứu 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phương pháp phân tích 27 2.2.2 Bố trí thí nghiệm .27 2.2.2.1 Quy trình dự kiến .27 2.2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định thơng số quy trình 29 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 41 2.3 Các hóa chất thiết bị sử dụng 42 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Xác định hoạt độ enzyme Viscozyme 43 3.2 Xác định chế độ xử lý rong chế phẩm enzyme Viscozyme 45 3.2.1 Xác định tỷ lệ enzyme/rong thích hợp cho q trình xử lý rong 45 3.2.2 Xác định nhiệt độ xử lý thích hợp cho q trình xử lý .48 3.2.3 Xác định pH thích hợp cho trình xử lý 51 3.2.4 Kết tối ưu hóa q trình xử lý rong 54 3.3 Xác định chế độ nấu chiết rong 59 3.3.1 Xác định tỷ lệ nước nấu/rong thích hợp cho quy trình thu nhận Car 59 3.3.2 Xác định nhiệt độ nấu đến trình thu nhận Car .62 3.3.3 Xác định thời gian nấu đến trình nấu 65 3.3.4 Tối ưu hóa cơng đoạn nấu chiết 67 3.4 Đề xuất quy trình sản xuất car 73 3.5 Kết tiêu kim loại nặng 75 3.6 Đánh giá chất lượng Car phương pháp xử lý enzyme với phương pháp xử lý hóa chất 75 3.7 Sản xuất thử sản phẩm tính chi phí nguyên vật liệu cho sản phẩm 78 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .79 KẾT LUẬN 79 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 PHỤ LỤC I iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT nm : nanomet v/w : thể tích/ khối lượng CMC : sodium carboxymetyl-cellulose ABS : albumin huyết bò Car : Carrageenan v DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Sản lượng rong sụn giới năm 2001 .4 Bảng 1.2: Thành phần hóa học rong sụn .6 Bảng 1.3 Tính chất đặc trưng loại Car .13 Bảng 1.4 Cơ cấu thị trường tiêu thu Car năm 2001 15 Bảng 1.5 Các ứng dụng điển hình Car thực phẩm 16 Bảng 3.1 Thiết kế mức thực nghiệm tham số quy trình xác định ảnh hưởng yếu tố tới quy trình xử lý rong 55 Bảng 3.2 Phân tích ANOVA kết thí nghiệm tối ưu hóa theo mơ hình Level Factorial Design theo hiệu suất .55 Bảng 3.3 Các hệ số sau phân tích hồi quy ANOVA theo hiệu suất 56 Bảng 3.4 Phân tích ANOVA kết thí nghiệm tối ưu hóa theo mơ hình Level Factorial Design theo sức đơng .57 Bảng 3.5 Các hệ số sau phân tích hồi quy ANOVA theo sức đông 57 Bảng 3.6 Thiết kế mức thực nghiệm tham số quy trình xác định ảnh hưởng yếu tố tới trình nấu chiết 68 Bảng 3.7 Phân tích ANOVA kết thí nghiệm tối ưu hóa theo mơ hình Level Factorial Design theo hiệu suất .68 Bảng 3.8 Các hệ số sau phân tích hồi quy ANOVA theo hiệu suất 69 Bảng 3.9 Phân tích ANOVA kết thí nghiệm tối ưu hóa theo mơ hình level Factorial Design theo sức đông .70 Bảng 3.10 Các hệ số hồi quy sau phân tích ANOVA theo sức đơng .70 Bảng 3.11 Kết số tiêu kim loại nặng 75 Bảng 3.12 Kết đánh giá chất lượng Car theo phương pháp xử lý enzyme với phương pháp xử lý hóa chất 75 Bảng 3.13 Chi phí nguyên vật liệu cho sản xuất Car .78 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Rong sụn tươi Hình 1.2 Rong sụn khơ .3 Hình 1.3 Cấu trúc car Hình 1.4 Tác động môi trường kiềm lên cấu tạo Car 10 Hình 1.5 Cơ chế chuyển đổi từ dung dịch sang gel nhiệt độ thấp .12 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình dự kiến sản xuất Car enzyme Viscozyme L 28 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/rong đến trình xử lý rong 30 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến trình xử lý rong .32 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng pH đến trình sử lý rong 34 Hình 2.5 Các yếu tố đầu vào ảnh hưởng đến hiệu suất sức đơng Car 35 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tỷ lệ nước nấu/rong đến trình nấu .36 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ nấu đến trình nấu 38 Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời gian nấu đến trình nấu 40 Hình 2.9 Các yếu tố đầu vào ảnh hưởng đến hiệu suất sức đơng Car 41 Hình 3.1: Đồ thị đường chuẩn glucose theo phương pháp Miller 43 Hình 3.2.Đồ thị đường chuẩn Albumin 44 Hình 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/rong đến hiệu suất thu hồi Car 46 Hình 3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/rong đến sức đơng Car .46 Hình 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/rong đến độ nhớt Car 47 Hình 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thu nhận Car .49 Hình 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sức đông Car .49 Hình 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ nhớt Car 50 Hình 3.9 Ảnh hưởng pH đến hiệu suất thu nhận Car .52 Hình 3.10 Ảnh hưởng pH đến sức đông Car .52 Hình 3.11 Ảnh hưởng pH đến độ nhớt Car .53 vii Hình 3.12 Mức độ đáp ứng mong đợi - xử lý rong .58 Hình 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ nước nấu/rong đến hiệu suất thu nhận Car 60 Hình 3.14 Ảnh hưởng tỷ lệ nước nấu/rong đến sức đông Car 60 Hình 3.15 Ảnh hưởng tỷ lệ nước nấu/rong đến độ nhớt 61 Hình 3.16 Ảnh hưởng nhiệt độ nấu đến hiệu suất thu nhận Car 63 Hình 3.17 Ảnh hưởng nhiệt độ nấu đến sức đông 63 Hình 3.18 Ảnh hưởng nhiệt độ nấu đến độ nhớt 64 Hình 3.19 Ảnh hưởng thời gian nấu đến hiệu suất thu nhận Car 65 Hình 3.20 Ảnh hưởng thời gian nấu đến sức đông 66 Hình 3.21 Ảnh hưởng thời gian nấu đến độ nhớt 66 Hình 3.22 Mơ hình đáp ứng mong muốn – trình nấu chiết 71 Hình 3.23.Vi ảnh rong sụn chưa xử lý 76 Hình 3.24 Vi ảnh rong sụn xử lý NaOH 76 Hình 3.25 Vi ảnh rong sụn xử lý enzyme 77 MỞ ĐẦU Việt Nam nước nhiệt đới có bờ biển dài khoảng 3,200 km 236,972 mặt nước nuôi trồng thủy sản tạo tiền đề cho việc nuôi trồng phát triển nhiều loại có giá trị kinh tế cao Rong sụn lồi rong biển có giá trị kinh tế cao du nhập vào nước ta từ năm 1993 nhanh chóng thích nghi, phát triển tốt vùng biển Việt Nam Nghề nuôi trồng rong sụn trở thành nghề ngư dân tỉnh Ninh Thuận, Khánh Hòa, Phú Yên,… Tuy nhiên, công nghệ chế biến rong sụn Car từ rong sụn Việt Nam hạn chế nên rong sụn khơ ngun liệu tiêu thụ nước mà chủ yếu xuất nguyên liệu thô Từ năm 2003 đến cuối năm 2004, sản lượng rong sụn xuất đạt khoảng 1.000 khô (chủ yếu cơng ty Ninh Thuận, Khánh Hịa, Phú Yên xuất khẩu), tháng đầu năm 2005, sản lượng xuất tăng vọt lên khoảng 2.000 khô, giá trị xuất tăng lên 50 USD, lên 700 USD/tấn FOB [2] Rong sụn nguyên liệu để sản xuất Car loại polysaccharide biết sử dụng từ lâu Thành phần hóa học chủ yếu rong sụn Car, chiếm khoảng 40% trọng lượng khô.Tuy nhiên, cơng trình nghiên cứu rong sụn chủ yếu tập trung vào nghiên cứu nuôi trồng thu nhận Car từ rong sụn theo quy trình xử lý rong acid hay kiềm Phương pháp xử lý sản xuất Car cịn có số hạn chế Car thu thường lẫn với hóa chất nên q trình tinh chế gặp nhiều khó khăn, nhiễm mơi trường Xuất phát từ vấn đề đề tài “Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarrezii (Doty) Doty enzyme Viscozyme L” thực nhằm xác định chế độ xử lý enzyme nấu chiết sau xử lý enzyme Viscozyme, enzyme có khả thủy phân cellulose - thành phần thành tế bào Mục tiêu đề tài: sử dụng enzyme Viscozyme L thay hóa chất để xử lý rong sụn trình sản xuất Car 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu cho phép rút số kết luận sau: 1) Đã xác định số thơng số thích hợp cho cơng đoạn xử lý rong : tỷ lệ enzyme/rong 1%, nhiệt độ xử lý 450C, pH 4.7 2) Đã xác định số thơng số thích hợp cho cơng đoạn nấu rong tỷ lệ nước nấu/rong 50/1, nhiệt độ nấu 950C, thời gian nấu 70 phút 3) Đã đề xuất quy trình sản xuất Car thu theo phương pháp xử lý rong enzyme Viscozyme L sản xuất thử sản phẩm Car theo quy trình đề xuất 4) Sản xuất Car theo phương pháp xử lý enzyme Viscozyme L có hiệu quả, thu Car chất lượng cao ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Qua kết nghiên cứu nhận thấy phương pháp xử lý rong enzyme phương pháp có tính khả thi cao, nhiên cần có nghiên cứu sâu Vì vậy,cho phép em đề xuất số ý kiến sau: - Tiếp tục nghiên cứu, lựa chọn phương pháp lọc thích hợp nhằm tiết kiệm chi phí sản xuất cho quy trình sản xuất Car quy mô lớn - Tiếp tục nghiên cứu thành phần bỏ sau xử lý enzyme ứng dụng thành phần khác - Sau lọc, loại lượng bã tương đối lớn dùng làm thức ăn chăn ni làm phân bón 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, Công nghệ enzyme, Nhà xuất Nơng nghiệp TP.HCM Bùi Huy Chích (2009), Bước đầu nghiên cứu thủy phân carrgeenan từ rong sun (Kappaphycus alvarezii) enzyme amylase ứng dụng vào sản xuất trà uống hòa tan, luận văn thạc sĩ, trường Đại học Nha Trang Phạm Văn Đạt (2004), Nghiên cứu thành phần hóa học thử nghiệm sản xuất nước giải khát đóng hộp từ rong sụn, luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Nha Trang Phạm Hồng Hải, Nguyễn Xn Ngun, Nguyễn Bích Thùy, Trần Đình Toại, Một số ứng dụng carrageenan khả sử dụng k-carrageenan từ rong biển Việt Nam bảo quản chế biến thực phẩm, Tạp chí khoa học cơng nghệ, tập 45, số 4, 2007, Tr.87-93 Lê Thị Thúy Hằng (2012), Nghiên cứu sử dụng Enzyme polysaccharase để thu nhận carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarzeii (Doty) Doty, luận văn thạc sĩ, trường Đại học Nha Trang Đào Trọng Hiếu (2007), Tối ưu hóa quy trình cơng nghệ tách chiết carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii, Cục Chế biến, Thương mại Nông Lâm Thủy sản Nghề muối, Hà Nội Nguyễn Thị Bảo Hiếu (2012), Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh enzyme cellulase, đồ án tốt nghiệp, trường Đại học Nha Trang Đặng Văn Hợp, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Thuần Anh, Vũ Ngọc Bội, Phân tích kiểm nghiệm thực phẩm thủy sản, Nhà xuất khoa học kĩ thuật, tr-119 Phạm Văn Huyên (2012), Nguồn lợi, sử dụng nuồi trồng rong Việt Nam, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ chế biến, T12 (1), tr.87-98 10.Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2004), Chế biến rong biển, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội 11.Lương Thị Trúc Mai (2012), Sử dụng enzyme thương mại Viscozyme cải tiến quy trình chiết Lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ (Tagets erecta L.), đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Nha Trang 81 12.Dương Chí Thanh (2007), Nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ thu nhận carrageenan chất lượng cao từ rong sụn Kappaphycus alvarezii, Luận văn Thạc sĩ, trường Đại học Nha Trang 13.Nguyễn Thị Thúy (2009), Thực hành sinh học đại cương, Khoa nuôi trồng thủy sản, trường Đại học Nha Trang II Tài liệu nước 14.Danso-Boateng E., (2011) Efect of Enzyme and Heat Pretreatment on sunflower Oil Recovery Using Aqueous and Hexane Extractions, World Academy of Science, Engineering and Technology 80, 9, 1-7 15.Hilaire M W.; Robert N.; Michel P., Jacques F.; (2008) “ Aqueouse enzymeatic oil extraction from Irvingia gabonensis seed kernels”, European Journal of lipid Science and Technology 3, 232-238, p, 1-6 16.Hu-zhe Z., In-Wook H, and Shin-Kyo C.; (2009) “Enhancing polyphenol extraction from unripe apples by carbohydrate-hydrolyzing enzymes”, J Zhejing Univ Sci B, 912-919 17.Manuel S R.; Enrique B A.; (2008), “Enzymatic treatment to Improve extraction of capsaicinoids and carotenoids from Chili (Capsicum annum) fruits”, J Agric Food Chem 56, p, 10012-10018 18.Soovendran A/l Varadarajan, Nazaruddin Ramli, Arbakariya Ariff, Mamot Said, Suhaimi Md Yasir (2009), “Development of high yielding carragenan extraction method from Eucheuma Cotonii using cellulase and Aspergillus niger”, Prosiding Seminar Kimia Bersama UKM-ITB VIII - 461 19.Sujith A.P., Hymavathi T.V and Yasoda Devi P., (2010) “ Sunpercritical Fluid Extraction of Lutein Esters from Mariglod Flowers and their Hydrolysis by Improved Saponification and Enzyme Biocatalysis” International Journal of Biological and Life Sciences, p, 1-10 III.Trang websites 20 http://www.rimf.org.vn/awadetail.asp?lang=1&News_ID=198, 21:13,15/05/2013 21.http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/materials/enzymes/viscozyme.html, I PHỤ LỤC PHỤ LỤC Bảng 3.1 Mối tương quan nồng độ glucose với mật độ quang Ống nghiệm số Nồng độ glucose (mg/ml) ∆ OD 540nm 0 1 0.1955 2 0.4360 3 0.6240 4 0.7704 5 1.0264 Bảng 3.2 Nồng độ glucose sinh enzyme cellulase thủy phân CMC Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm OD540 (nm) 0.2999 0.4242 Nồng độ glucose (mg/ml) 1.4672 2.0856 Nồng độ glucose sinh G (µg /ml) 618.4 Bảng 3.3 Mối tương quan nồng độ BSA với mật độ quang Ống nghiệm số Nồng độ ABS (mg/ml) ∆ OD 660nm 0 0.2 0.1895 0.4 0.4014 0.6 0.5804 0.8 0.7335 0.8467 II Bảng 3.4 Kết xác định hàm lượng protein enzyme Viscozyme Mẫu ∆ OD 660 Đối chứng Thí nghiệm 0.6547 Hàm lượng protein (mg/ml) 364.25 Bảng 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/rong đến hiệu suất, sức đông độ nhớt Car Sức đông (g/cm2) Độ nhớt (v/w) Hiệu suất thu hồi (%) 0.5 22 485.87 215.5 0.75 24.5 513.67 230 25.13 531.13 236 1.25 28.13 563.7 256 1.5 22.3 473.7 197.3 STT Tỷ lệ enzyme/rong (cps) Bảng 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ xử lý đến hiệu suất, sức đông độ nhớt Car Nhiệt độ xử lý (0C) Hiệu suất thu hồi (%) Sức đông (g/cm2) Độ nhớt (cps) 40 24.4 468.5 149.01 45 26.67 528.31 168.5 50 28.4 550.65 200.5 55 22.9 536.41 185.73 STT Bảng 3.7 Ảnh hưởng pH đến hiệu suất, sức đông độ nhớt Car STT pH Hiệu suất thu hồi (%) Sức đông (g/cm2) Độ nhớt (cps) 4.5 23.33 450.68 174.52 4.7 26.06 518.16 205 4.9 28.24 568 220.45 5.1 27.26 524 212.3 5.3 26.67 473.5 168 III Bảng 3.8 Kết quy hoạch thực nghiệm tối ưu trình xử lý rong theo torial Level Factorial Design IV Bảng 3.9 Ảnh hưởng tỷ lệ nước nấu/rong đến hiệu suất, sức đông độ nhớt Car STT Tỷ lệ nước nấu/rong Hiệu suất thu hồi (v/w) (%) Sức đông (g/cm2) Độ nhớt (cps) 45 25.2 516.8 189.7 50 26.73 565 230 55 28.01 573.2 228.5 60 27.52 548 196 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ nấu đến hiệu suất, sức đông độ nhớt Car Sức đông (g/cm2) Độ nhớt (0C) Hiệu suất thu hồi (%) 85 24.12 524 223 90 26.64 584.5 230 95 28.12 573 218 100 24 84 516 167 STT Nhiệt độ nấu chiết (cps) Bảng 3.11 Ảnh hưởng thời gian nấu đến hiệu suất, sức đông độ nhớt Car Sức đông (g/cm2) Độ nhớt (phút) Hiệu suất thu hồi (%) 70 26.85 621.3 199.8 80 27.3 647.5 254 90 28.46 625 248 100 27.29 631 173 STT Thời gian nấu (cps) V Bảng 3.12 Quy hoạch thục nghiệm tối ưu điều kiện nấu theo torial Level Factorial Design VI PHỤ LỤC 2.1 Xác định hoạt tính enzyme Viscozyme L theo phương pháp Miller [13] 2.1.1 Nguyên tắc Xác đượng lượng đường khử dựa sở xác định mức độ tăng cường độ màu hỗn hợp với DNS 2.1.2 Hóa chất - Thuốc thử DNS: cân g DNS pha 20 ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50 ml nước cất với 30g muối sodium potassium tartrate Đun nhẹ cho tan định mức đến 100ml - Dung dịch glucose (10mg/mL): Cân 2.5 g glucose (dạng khơ khơng ngậm nước) hịa tan thành 200 mL với nước cất sử dụng bình định mức.Từ dung dịch glucose (10mg/mL), pha dung dịch glucose có nồng độ từ ÷ (mg/mL) theo bảng đây: Nồng độ glucose (mg/mL) Thể tích dung dịch glucose mẫu (mL) 10 15 20 25 Nước cất 50 45 40 35 30 25 - Lập đồ thị chuẩn: Cho 0,5 ml dung dịch glucose vào ống nghiệm khô, thêm vào 0.5 mL thuốc thử DNS Đun nóng cách thủy phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng Thêm vào ống 5mL nước cất đo mật độ quang bước sóng 540 nm với ống đối chứng nước cất.Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung mật độ quang, trục hoành nồng độ glucose - Dung dịch acetic 1M: Hòa tan 60 ml acid acetic vào nước định mức bình định mức đến 1000mL - NaOH 1M: cân 40g NaOH hòa tan nước định mức bình định mức đến 1000 mL VII - Dung dịch chất (1% w/v CMC): Cân 10g CMC hòa tan 800 mL nước, thêm vào 100mL acid acetic 1M Chỉnh dung dịch pH với NaOH pH kế Chuyển sang bình định mức 1000 định mức cho đủ vạch - Chuẩn bị enzyme: Lấy 1mL dung dịch enzyme gốc cho vào bình định mức 100mL Cho thêm nước cất vào định mức cho đủ 100mL, lắc 2.1.3 Cách thực Hút mL dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm để ổn nhiệt 400C phút Cũng để dung dịch chất ổn định nhiệt độ phút Thêm 1mL dung dịch chất vào ống nghiệm đựng dung dịch enzyme lắc Và giữ 400C 30 phút Lấy ống nghiệm khỏi bể đun nóng cách thủy 10 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng Lấy 0.5mL dung dịch vào ống nghiệm sạch, thêm vào 0.5 mL thuốc thử DNS, lắc Đun cách thủy phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng Thêm vào ống ml nước cất đo mật độ quang bước sóng 540 nm Song song với mẫu thí nghiệm, ta làm mẫu đối chứng tương tự thay enzyme enzyme bất hoạt 2.1.4.Tính kết Đơn vị hoạt độ enzyme viscozyme xác định sau: đơn vị hoạt độ enzyme tương ứng với µg glucose thời gian thủy phân chất CMC 60 phút G x Độ pha lỗng Hđ viscozyme= (đvhđ/mL) Vxτ Trong đó: - G= G (mẫu không bất hoạt)- G (mẫu bất hoạt) - G: nồng độ glucose sinh trình thủy phân chất enzyme Viscozyme - τ: Thời gian (phút) VIII - V: thể tích enzyme Viscozyme phản ứng thủy phân chất (mL) 2.2 Xác định nồng độ protein hòa tan theo phương pháp Lowry [8] 2.2.1 Nguyên tắc Phương pháp dựa sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden-photphovonphramat (thuốc thử Folin-ciocalteu) tạo phức chất mày xanh da trời có độ hấp thụ cực đại bước sóng 660nm Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein phạm vi định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học protein chuẩn, ta xác định hàm lượng protein mẫu nghiên cứu 2.2.2 Hóa chất - Dung dịch A: 4g NaOH (0.1M) 20g Na2CO3 (2%) pha 1000ml nước cất - Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0.5%) pha dung dịch Natri xitrat (1%) dung dịch Natri, Kali Tactorat 1% - Dung dịch C: Hỗn hợp hai dung dịch A B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước dùng) - Thuốc thử folin, trước dùng pha loãng hai lần cho độ axit N - BSA 1mg/ml - Lập đồ thị chuẩn: Cân 0.1g (100mg-BSA) hòa tan 100ml nước, ta dung dịch gốc có nồng độ 1mg/mL Sau pha lỗng dung dịch gốc nước cất với nồng độ 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1mg/mL để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn Lấy xác 0.5 ml dung dịch BSA nồng độ pha loãng cho vào ống nghiệm, thêm vào ống 2mL dung dịch C để nhiệt độ phòng khoảng 10 phút, sau thêm 0.25mL thuốc thử folin, lắc để yên khoảng 20 ÷ 30 phút Đo mật độ quang bước sóng 660nm Song song với mẫu thí nghiệm, ta tiến hành mẫu đối chứng thay dung dịch protein chuẩn nước cất - Chuẩn bị enzyme: Lấy 1mL dung dịch enzyme gốc cho vào bình định mức 500mL Cho thêm nước cất vào định mức cho đủ 500mL, lắc IX 2.2.3 Cách tiến hành - Mẫu thí nghiệm: lấy xác 0.5mL dịch chứa protein với hàm lượng thích hợp cho vào ống nghiệm, thêm vào 2mL dung dịch C, lắc để yên 10 phút Sau thêm vào hỗn hợp ống nghiệm 0.25mL folin pha loãng lần, lắc để yên khoảng 20 ÷ 30 phút, màu vàng hỗn hợp chuyển thành màu xanh da trời đạt đến cường độ màu cực đại Đo mật độ quang bước sóng 660nm Xác định trị số mật độ quang học dung dịch nghiên cứu - Mẫu đối chứng: 0.5mL nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào 2ml dung dịch C bước tiến hành tương tự mẫu thí nghiệm 2.3 Xác định hoạt độ riêng Hoạt độ riêng chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh chế phẩm enzyme Từ hoạt độ chung enzyme hàm lượng protein xác định, tính hoạt độ riêng enzyme theo công thức: HđViscozyme Hđr(đvhđ/mg protein) = mg protein 2.4 Xác định hiệu suất thu hồi Car Hiệu suất thu hồi Car tính theo cơng thức (%) X= A(100-W2) P(100-W1) 100% Trong - A: số gram Car thu (g) - P: Số gram rong đem nấu chiết (g) - W1: Độ ẩm rong nguyên liệu (g) - W2: Độ ẩm Car (g) X 2.5 Xác định độ bền gel theo Craigle (Craigle, 1978) Độ bền gel Kappa- Carrageenan đo mơi trường nước dung dịch KCl 0.2% Cân xác 1.8 g Car (đã biết độ ẩm), thêm vào 120 ml nước cất 120 ml KCl 0.2%, nấu đến tan hoàn toàn hệ thống sinh hàn hồi lưu Đổ đĩa peptri cốc thủy tinh 100 ml, để tạo gel qua đêm, giữ lạnh 200C, tiến hành đo độ bền gel điểm lấy giá trị trung bình Độ bền gel đo máy Rheometer CR – 500 DX, Sun – Scientific, JaPan với piston trượt 0.78 cm2 ( đường kính 1.09 cm) 2.6 Xác định độ nhớt (Craigle, 1978) Dung dịch carrageenan 1.5%; cân xác 1.8 g Car hịa tan NaCl 0.1M nóng, dùng khuấy từ 35 ÷ 40 phút cho Car hịa tan hồn tồn Độ nhớt dung địch đo 750C 2.7 Phương pháp nhuộm kép [7] Dùng để phân biệt cách rõ ràng mô quan: + Những mô có màng tế bào hóa gỗ bắt màu xanh phẩm lục iode xanh methylene + Những mô có màng tế bào cấu tạo cellullose, bắt màu hồng phẩm đỏ carmin Kĩ thuật nhuộm kép tiến hành sau: - Ngâm lát cắt vào nước Javen 15 ÷ 20 phút để nộ chất tế bào - Rửa nước - Rửa acid acetic 1% để tẩy hypoclorit Javen dính vào mẫu vật - Rửa nước - Ngâm xanh methylen ÷ giây (tùy theo mẫu) - Rửa nước - Ngâm đỏ carmin 15 ÷ 20 phút - Rửa nước - Lên kính dung dịch thích hợp (glyxêrin, nước, ) XI PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH THỰC NGHIỆM Hình 3.1 Rong sụn sau xử lý enzyme Hình 3.2 Car thu sau xử lý enzyme XII Hình 3.3 Cân phân tích AY 200 Hình 3.5 Bể ổn nhiệt Hình 3.7 Máy đo lưu biến Hình 3.4 Máy đo pH Hình 3.6 Máy đo độ nhớt Hình 3.8 Máy so màu UV-Vis ... hoàn thành nghiên cứu thử nghiệm, sản xuất nhiều sản phẩm từ rong sụn nghiên cứu sản xuất Car chất l? ?ợng cao, nghiên cứu sản xuất Carramin thay hàn the sản xuất giò chả; Nghiên cứu sản xuất Car... công luận văn thạc sỹ “ Nghiên cứu sử dụng Enzyme polysaccharase để thu nhận Car từ rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty? ?? Đề tài nghiên cứu trình xử l? ? rong enzyme Viscozyme L Pectinnex Ultra... KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM PHẠM THỊ HẢI HÀ NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVARREZII (DOTY) DOTY BẰNG ENZYME VISCOZYME L ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: